Summary
La purification par affinité des protéines marquées en combinaison avec la spectrométrie de masse (APMS) est une méthode puissante pour la cartographie systématique des réseaux d'interactions protéiques et d'enquêter sur le fondement mécaniste des processus biologiques. Ici, nous décrivons un peptide optimisé séquentielle d'affinité (SPA) procédure APMS développé pour la bactérie
Abstract
Comme la plupart des processus cellulaires sont médiés par des assemblages macromoléculaires, l'identification systématique des interactions protéine-protéine (PPI) et l'identification de la composition de sous-unité du complexe multi-protéique peut donner un aperçu de la fonction des gènes et améliorer la compréhension des systèmes biologiques 1, 2. Interactions physiques peuvent être mis en correspondance avec confiance vialarge échelle haute isolation et la caractérisation des complexes de protéines endogènes dans des conditions proches des conditions physiologiques basés sur la purification par affinité des protéines chromosomiques marqués en combinaison avec la spectrométrie de masse (APMS). Cette approche a été appliquée avec succès dans les organismes évolutivement divers, y compris les levures, les mouches, les vers, les cellules de mammifères, et les bactéries 1-6. En particulier, nous avons généré une affinité carboxy-terminale de peptides séquentielle (SPA) pour système de marquage double affinité de purification des complexes protéiques natifs de culture d'Escherichia coli à Gram négatif, en utilisant genetically-traitables souches de laboratoire d'accueil qui sont bien adaptés à l'échelle du génome des enquêtes sur la biologie fondamentale et les processus conservées des procaryotes 1, 2, 7. Notre SPA-tagging système est analogue à la méthode de purification d'affinité en tandem développé à l'origine pour la levure 8, 9, et se compose d'un peptide liant la calmoduline (CBP), suivi par le site de clivage pour la protéase du virus hautement spécifique du tabac etch (TEV) et trois copies du FLAG (FLAG 3X) épitope, ce qui permet deux cycles consécutifs d'enrichissement par affinité. Après amplification de cassette, spécifiques d'une séquence linéaire des produits de PCR codant pour la SPA-tag et un marqueur de sélection sont intégrés et sont exprimées en tant que cadre carboxy-terminaux dans un fond fusions DY330 qui est induite à exprimer de façon transitoire un système hétérologue est performant bactériophage lambda recombinaison 10. Après deux étapes de purification utilisant la calmoduline et billes d'affinité anti-FLAG permet sélective hautementet une récupération efficace de même de faibles complexes protéiques d'abondance des cultures à grande échelle. Spectrométrie de masse tandem est ensuite utilisé pour identifier de façon stable les co-purification de protéines avec une sensibilité élevée (faibles limites de détection nanogramme).
Ici, nous décrivons détaillées étape par étape, les procédures communément utilisés pour le marquage des protéines systématique, la purification et la spectrométrie de masse basée sur l'analyse des complexes protéiques solubles de E. coli, qui peuvent être étendus et potentiellement adaptée à d'autres espèces bactériennes, y compris certains agents pathogènes opportunistes qui se prêtent à recombineering. Les interactions physiques qui en découlent peuvent souvent révéler intéressantes composants et des connexions inattendues suggérant de nouveaux liens mécanistes. Intégration des données PPI avec remplacement des données d'association moléculaire, tels que génétiques (gène-gène) les interactions et la génomique contexte (GC) des prédictions peuvent faciliter l'élucidation de l'organisation mondiale moléculaire de complexes multi-protéiques dans les deuxvoies méthodologiques. Les réseaux générés pour E. coli peuvent être utilisées pour mieux comprendre l'architecture fonctionnelle des produits des gènes orthologues dans d'autres microbes dont annotations fonctionnelles font actuellement défaut.
Protocol
1. Construction de gènes spécifiques SPA-tagging dans E. coli souche DY330
- Le plasmide pJL148 englobant la séquence d'ADN SPA-tag et la kanamycine marqueur de résistance aux antibiotiques de cassette (Kan R) sont utilisés comme matrice dans une réaction en chaîne par polymérase (PCR) 7. A 45 nt gène spécifique à l'amorce sens, située immédiatement en amont du codon stop du gène cible dans le cadre avec un 27 pb ('5'-AGCTGGAGGATCCATGGAAAAGAGAAG -3) amorce sens étiquette spécifique, et un 45 nt spécifique du gène amorce inverse, situé immédiatement en aval du codon stop du gène cible dans l'image avec un point d'ébullition 27 (5'-GGCCCCATATGAATATCCTCCTTAGTT -3 ') amorce anti-sens spécifique tag, sont utilisés pour amplifier le marqueur et SPA-Kan R cassette du pJL148 utilisant les conditions suivantes: 94 cycles de PCR ° C pendant 5 min; 30 cycles de 94 ° C pendant 1 min, 55 ° C pendant 1 min, 68 ° C pendant 2 min 10 sec, puis 68 ° C pendant 10 min. Ces séquences amplifiées servir uns substrats pour la ectopique introduit λ-Rouge machines de recombinaison homologue (voir ci-dessous).
- Le produit de PCR est purifié en utilisant un kit QIAquick PCR purification pour éliminer les sels qui peuvent interférer avec l'électroporation. Le produit de PCR purifié est ensuite ciblé pour intégrer à l'extrémité 3 '(juste en amont du codon d'arrêt natif) d'un gène spécifique dans DY330 souche dans laquelle le mécanisme de recombinaison λ-rouge 10 est exprimé.
- Le DY330 λ-Rouge souche exprimant est cultivée pendant une nuit dans 2 ml de Luria-Bertani (LB) à 32 ° C en agitant à 180 tours par minute. 1 ml de la culture d'une nuit est ensuite inoculée dans 70 ml de milieu LB frais dans 500 ml fiole conique. L'inoculum est cultivé à 32 ° C en agitant à 180 tours par minute jusqu'à ce que la DO 600 atteigne environ 0,8.
- La culture est transférée dans un nouveau erlenmeyer de 250 ml, où les cellules sont induites par incubation de la fiole dans un bain d'eau à 42 ° C en agitant doucement à180 tours par minute pendant 15 minutes. Immédiatement après l'induction, le ballon est mis en incubation dans un bain de bouillie de glace d'eau pendant au moins 30 min sous agitation.
- La culture glacée est immédiatement transféré en pré-réfrigérés tube de 50 ml en polypropylène et soumis à une centrifugation à 3993 xg pendant 6 min à 4 ° C. Le culot cellulaire est remis en suspension dans 50 ml d'eau glacée stérile et centrifugé de nouveau à 3993 xg pendant 6 min à 4 ° C. Le culot cellulaire est alors remis en suspension dans 1 ml d'eau froide et transféré dans un tube de 1,5 ml Effendorf, et centrifugé à une vitesse maximale de 20 secondes à 4 ° C. Après deux ou trois étapes de lavage avec de l'eau glacée, le culot cellulaire est remis en suspension dans 700 ul enfin de l'eau glacée stérile, résultant en des cellules électro-compétentes.
- Grâce à l'électroporation, une pi de l'amplicon purifié est introduit dans 40 pl de cellules électro-compétentes. Les cellules sont électroporation dans un Bio-Rad II GenePulser avec les paramètres suivants: 2,5 kV, 25 uF avec impulsionContrôleur de 200 Ω. Après recombinaison homologue et de l'intégration, les transformants qui ont réussi à recombiner l'étiquette / cassette dans le chromosome sont choisis en fonction de la résistance à Kan (figure 1A). Plusieurs transformants sont sélectionnés pour Western blot pour vérifier la génération correcte (c'est à dire un signal positif) de la SPA taggés protéines de fusion avec anticorps anti-FLAG M2 qui est sélective contre les épitopes drapeau de la SPA-tag.
- Confirmé souche carboxy terminal de fusion SPA-tag est cultivé sur une grande échelle afin d'isoler des complexes de protéines solubles à partir des cellules récoltées en utilisant le protocole de purification SPA. Les grandes lignes des étapes de la procédure de purification par affinité tag est montré dans la figure 1B.
2. La culture et la sonication
- Inoculer 100 pi d'une étiquette E. SPA- stock de glycérol coli dans 50 ml de bouillon terrible (TB) milieu liquide supplémenté avec 50 ul de 25 pg / ml of Kan solution dans une fiole conique de 250 ml. Cultiver la culture pendant la nuit à 32 ° C.
Remarque: Comme la cassette λ inductible par la température dans la souche DY330 rouge est sous le contrôle d'un répresseur sensible à la température 10, la souche de SPA-marqué E. coli est cultivée à 32 ° C. - Transférer 10 ml de la culture d'une nuit dans 990 ml tuberculose frais additionné de 25 pg / ml de Kan dans un ballon de 4 litres. La culture est développée à 32 ° C avec agitation constante à 250 tours par minute, pendant 5 à 6 heures, jusqu'à ce que la DO 600 atteigne 2 à 3 ~.
- Transférer le 1 litre E. coli SPA-tag culture pour nettoyer les bouteilles de centrifugation et tourner les cellules à 4 ° C dans Beckman J6-HC centrifugeuse @ 3993 xg pendant 15 min.
- Le surnageant est éliminé des bouteilles de centrifugation. Reprendre le E. culots cellulaires coli avec 25 ml de tampon de sonication. Assurez-vous de garder les bouteilles de centrifugation sur la glace en tout temps.
- Le culot remis en suspension esttransféré à tube de 50 ml en polypropylène Falcon et congelés à l'azote liquide. Les cellules congelées sont conservées à -80 ° C pour utilisation à long terme.
- Avant de sonication, décongeler les cellules congelées complètement en gardant les boulettes sur la glace. Les échantillons décongelés sont transférés à une coupelle en acier inoxydable stérile placé sur de la glace pendant la sonication. La sonde est immergée dans l'échantillon et soumis aux ultrasons pendant 3 min. Encore 2 min, on laisse refroidir l'échantillon de surchauffe.
- Le lysat cellulaire est traitée aux ultrasons transmis dans le tube de pré-réfrigéré centrifugation stérile, et on le soumet à une centrifugation à 4 ° C en utilisant une centrifugeuse Beckman JA-17 @ rotor 35.267 xg (16.000 rpm) pendant 15 min à deux reprises.
Remarque: Dans le cas de la purification des protéines membranaires, le lysat cellulaire soniqué est centrifugé qu'une seule fois pendant 15 minutes parce que nous ne savons pas dans quelle fraction des protéines membranaires sont, c'est, que ce soit dans le culot ou dans la fraction surnageante. Donc, pour éviter la perte de plus de membresprotéines membranaires, nous tournons les cellules pendant 15 min à grande vitesse de centrifugation et le surnageant est ensuite traité pour la purification (voir les étapes ci-dessous), où 1% de détergent est utilisé pour solubiliser les protéines membranaires. - Le surnageant du tube de centrifugation est soigneusement transférée dans un tube Falcon de 50 ml en polypropylène et congelés à l'azote liquide. L'extrait de cellules congelées soniqué est stocké pour une période maximale de 6 mois à -80 ° C pour une utilisation ultérieure.
3. Purification par affinité
- Avant d'utiliser, 100 pi de Anti-Flag M2 perles sont lavées par 10 volumes de tampon AFC (30 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, 0,1% de détergent, et 0,1-0,5 mM PTCE [tris (2-carboxyéthyl) phosphine - l'acide chlorhydrique]) sans le détergent et l'agent de réduction TCEP (tris (2-carboxyéthyl) phosphine).
- Le congelés, extrait cellulaire soniqué est décongelé en plaçant le tube dans l'eau froide. L'extrait cellulaire décongelée est incubé avec 3 pi de benzonase nucléase pendant 30 min à 4 ° C. A ce mélange, ajouter un détergent non ionique Triton X-100 (concentration finale du détergent devrait être de 0,1%) et 200 pi de suspensions anti-FLAG M2 billes d'agarose.
Remarque: Pour toutes les purifications de protéines solubles, 0,1% de Triton X-100 est utilisé pour minimiser l'adsorption non spécifique, alors que pour la purification d'une protéine membranaire, différents doux détergents non ioniques, tels que C12E8 (octaéthylène dodécyl éther de glycol), DDM ( n-dodécyl β-D-maltoside) et le maltose-néopentylglycol (MNG) peut être utilisé à une concentration de 1% de détergent pour améliorer la solubilisation. Depuis différents détergents ont une efficacité variable solubilisation des protéines membranaires, il est recommandé d'effectuer des purifications de protéines indépendantes en utilisant plus d'un détergent. - Le contenu est mélangé doucement en tournant le tube pendant 3 heures à 4 ° C en utilisant un agitateur LabQuake. Après 3 h de rotation, le tube est centrifugé à 1.700 g pendant 6 minutes. Le surnageant est alors removed soin, autant que possible, sans perturber le cordon lâche granulés.
- Le culot est remis en suspension dans le surnageant restant, puis transféré dans un 0,8 x 4 cm colonne de Bio-Rad polypropylène de préparation. S'assurer de retirer les bouchons de vidange par le bas de la colonne, afin de permettre les éluats à vidanger par gravité. Laver la colonne 5 fois avec étape de clivage TEV.
- Après la vidange des éluats lavés, la sortie de fond de la colonne est fermée. À la même colonne, le clivage est réalisée par l'addition de 5 à 10 ~ pi (50 unités) de protéase TEV et 400 pl de tampon 1X AFC sur la colonne. S'assurer de fermer la partie supérieure de la colonne avec un capuchon. La colonne contenant les billes sont tournés doucement une nuit à 4 ° C pendant la nuit à l'aide d'un agitateur LabQuake.
- Enlever le bouchon sur le dessus et le bouchon de sortie au bas de la colonne, et égoutter les éluats récupérés après clivage TEV dans une colonne contenant 200 suspensions frais ul de billes de sépharose-calmoduline qui est lavé par 10volumes de tampon de liaison calmoduline.
- À la fois le haut et le bas de la colonne sont fixées hermétiquement, et le contenu de la colonne sont mélangées doucement par rotation pendant 3 heures à 4 ° C à l'aide d'un agitateur LabQuake.
- Après 3 h de rotation, l'éluat est évacué en retirant le couvercle supérieur et le bouchon de fond de la colonne. La colonne est lavée quatre fois avec 200 pi de tampon de liaison 1X calmoduline suivie d'un lavage rigoureux avec 400 pl de tampon de lavage calmoduline.
- La protéine liée est éluée en quatre fractions de 50 ul dans un nouveau tube Eppendorf en utilisant 1X tampon d'élution calmoduline. La fraction éluée est distribué dans deux tubes Eppendorf propres dans des volumes égaux. Les deux tubes sont ensuite séchés sous vide à l'aide d'une vitesse.
- L'éluat séché d'un tube est utilisé pour l'exécution d'un gel coloration à l'argent, tandis que l'autre est stocké dans -80 ° C, avant d'utiliser la spectrométrie de masse.
4. Coloration à l'argent
- Pour l'argent staining, la moitié du volume de SDS 3X (dodécyl sulfate de sodium) tampon d'échantillon est ajouté à 50 ul de l'éluat séché. Après avoir fait bouillir le mélange pendant 5 min, les échantillons sont chargés sur un gel de polyacrylamide SDS.
- Après le gel a fini de s'exécuter, il est soigneusement placé dans une solution de fixation (méthanol à 50% et 10% d'acide acétique) et agité doucement sur un agitateur rotatif pendant 20 min. Le gel est ensuite rincé à l'éthanol à 20% pendant 10 min.
- Le gel fixe est lavée deux fois à fond avec 500 ml d'eau bidistillée pendant 10 minutes pour assurer fond uniforme faible.
- Le gel est ensuite agité doucement dans 500 ml de thiosulfate de sodium pendant 1 min, suivie de deux étapes de lavage avec de l'eau distillée pendant 20 sec.
- L'eau est éliminée, et le gel est incubé dans 200 ml de nitrate d'argent 0,1% pendant 30 min. Après ce temps, le nitrate d'argent est éliminé et le gel est lavé avec de l'eau distillée pendant 20 secondes pour éliminer l'excès de nitrate d'argent.
- Le gel est finalement la main agitée dans 75 mlde la solution de développement. Lorsque l'intensité désirée est atteinte, la solution de développement est éliminé et 80 ml d'acide acétique est ajouté pour arrêter la réaction. Assurer à incuber le gel dans l'acide acétique pendant une période minimale de 20 minutes pour une visualisation correcte des bandes de gel.
5. Protéolyse et préparation des échantillons pour la spectrométrie de masse
- Pour l'échantillon séché, ajouter 50 ul du tampon de digestion et 0,9 ul de 100 mM PTCE-HCl (tris (2-carboxyéthyl) phosphine - acide chlorhydrique) et incuber le mélange pendant 45 min à température ambiante pour l'étape de réduction. Ensuite, 1 pl de 500 mM d'iodoacétamide est ajouté et incubé dans l'obscurité pendant 40 min un autre pour permettre d'alkylation échantillon.
- Après le second tour de l'incubation, ajouter 1 ug de trypsine immobilisée sur le mélange et incuber soit à 37 ° C pendant 5 heures ou toute la nuit à température ambiante. Assurez-vous d'arrêter la réaction en ajoutant 1 ul d'acide acétique.
- Pré-humide, la Millipore Zip-Tip pointe de la pipette en aspirant 10 ul de la solution de mouillage et d'équilibrage. Distribuer la solution à perdre. Par la suite aspirer 10 ul de la solution de lavage et distribuer la solution à perdre. Répétez cette étape deux fois.
- Pour une fixation efficace du mélange peptidique à l'extrémité, d'une pipette mélanger le mélange de peptides de 20 fois. Le mélange de peptides qui ont adhéré à la pointe est lavé par aspiration et la distribution de la solution de lavage. Répétez cette procédure deux fois pour une fixation efficace du mélange de peptides à la pointe.
- Avec le bout contenant le peptide lié, aspirer 10 ul de la solution de mouillage et d'équilibration, et distribuer dans un tube eppendorf propre. Répétez cette étape deux fois. Après séchage, les échantillons élués dans le vide de vitesse, les échantillons peuvent être analysés par spectrométrie de masse immédiatement ou conservés à -80 ° C avant utilisation.
6. Identification des protéines par LTQ Velos Orbitrap spectromètre de masse
Thcomposants électroniques polypeptidiques des complexes isolés sont identifiés à l'aide d'un Orbitrap LTQ Velos hybrides spectromètre de masse en tandem. L'exception des Orbitrap pouvoir de résolution (> 60.000 maximum intégral moitié de la largeur, ou FWHM) et la précision de masse (<2 ppm) qui minimise MS / MS échantillonnage de contaminants non pertinentes fond non spécifiques détectés dans purifications de commande, tandis que la vitesse élevée à piège à ions Velos composant peut détecter et peptides de fragments de faible abondance en utilisant à la fois le transfert d'électrons et de dissociation induite par collision modes de dissociation. Matchs de confiance élevé entre résultant spectres MS / MS sont mappés à la référence E. séquences de protéines coli en utilisant l'algorithme de recherche de base de données comme SEQUEST et chaque séquence correspondant évaluée au cours d'un algorithme de probabilité comme STATQUEST 11. Le nombre total de spectres, l'unicité séquence peptidique et les contaminants de fond communs détectés dans le contrôle négatif (c.-à-maquette.) Purifications sont envisagées pour atteindre un bas empirique faux-distaux de découverte. Les étapes suivantes sont effectuées pour l'identification des protéines:
- Les micro-colonnes sont emballées avec ~ 10 cm de 3 pm Luna-C 18 et de résine sont en interface avec une source d'ions Proxeon nanoélectronébulisation qui est placé en ligne avec l'instrument Orbitrap.
- Un Proxeon flux binaire nano HPLC pompe est utilisée pour délivrer un taux stable de flux pointe d'environ 300 -1 nl min pendant les séparations de peptides.
- Pour parvenir à élution peptide, un gradient de tampon organique est mis en place selon la complexité de l'échantillon. Par exemple, le gradient suivant est généralement mis en place pour E. échantillons SPA coli: le solvant B est passée de 2% à 6% en 1 min, à 24% en 38 min, à 100% dans la prochaine 4 min, détenue à 100% pendant 1 min, puis a diminué à 2% en 1 min, et dernière maintenir à 2% pendant 15 min. Le solvant de phase mobile A a 95% HPLC gradient d'eau et 5% ACN avec de l'acide formique 0,1%, tandis que le solvant B a 5% HPLC gradient d'eau et 95% d'ACN avec 0,1% d'acide formique acid. Le débit à la pointe de l'aiguille est fixée à 300 nl min -1 pendant 60 min.
- Comme les cycles de spectrométrie de masse de fonctionner grâce à un balayage complet de masse à 60.000 résolutions, 10 concomitants scans en tandem fragmentation de masse sont recueillies pour les ions précurseurs les plus intenses. L'exclusion dynamique, la sélection massale monoisotopique, et en temps réel des données dépendantes de caractéristiques de l'instrument d'acquisition sont activés.
- Les spectres sont recherchés en utilisant un algorithme de recherche de base de données tels que SEQUEST contre une base de E. séquences de protéines coli, et le résultat est statistiquement filtré en utilisant un algorithme probabiliste comme STAQUEST 11 pour assurer un taux faible de faux découverte. Seuls les candidats de confiance élevé (99% de probabilité) sont sélectionnés, tandis que les matchs montrant plus de 10 ppm en masse d'erreur par rapport à la masse des peptides théoriques sont éliminés sans autre considération.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Un aspect essentiel de l'approche basée sur APMS SPA décrit ici est que le marquage est effectué dans le cadre naturel chromosomique, assurant ainsi la régulation des gènes normale est maintenue (. Promoteur natif appât préservé, où les niveaux d'expression n'est pas perturbé) et natif stable associée à complexes protéiques sont récupérés à court endogènes niveaux. Questions polarité opéron sont également évités par un promoteur comprenant orientée vers l'extérieur dans le marqueur de sélection. Cette approche SPA-tagging est assez efficace pour purifier les composants de faible abondance complexes à l'homogénéité proche, y compris associées à la membrane assemblées, même si les sous-unités sont exprimées en bas à seulement quelques molécules par cellule bactérienne. Dans l'ensemble, ce protocole peut être facilement mis à l'échelle en place pour la purification de grande-ensembles de protéines marquées solubles dans E. coli ou, en principe, toutes les autres espèces bactériennes pour lesquelles le marquage par recombineering est possible, ou ceux qui possèdent naturellement élevé transformationstion des capacités, comme Acinetobacter, un outil de travail émergent de la génétique bactérienne, qui a été utilisé, par exemple, de construire une bibliothèque souche de KO génomiques ciblées 13.
Un souci majeur inhérent à grande échelle des approches protéomiques est l'identification des mœurs non spécifiques interacteurs et la contamination trace fausse. Malgré deux tours de l'enrichissement, nos purifications SPA routine régulière de détecter des contaminants fréquents qui sont généralement des protéines de haute abondance d'entretien ménager, tels que les protéines ribosomales et les accompagnateurs, qui se lient de façon non spécifique à la résine chromatographique et / ou d'appâts protéines. Ce problème peut être atténué de deux manières. Tout d'abord, le nombre total spectrale et l'unicité de chaque protéine identifiée avec un appât particulier est évalué par rapport à un ensemble plus large de purifications de plusieurs appâts protéiques indépendants et des non marqué (ie. Type sauvage) des souches témoins négatifs (c.. Expertise maquette purification par affinitériences) pour minimiser les fausses associations positives. Deuxièmement, toutes les interactions protéines candidates doivent être validées à l'aide de marquage réciproque et la purification du partenaire de liaison putatif, dans le but de confirmer indépendamment individuels interactions protéine-protéine pour éviter les cas rares où la présence de la SPA-tag perturbant l'incorporation de protéines natives en l'assemblage des protéines endogènes.
APMS des enquêtes protéomiques sont limitées par le manque de sensibilité en termes d'identification des interactions transitoires ou sous-stoechiométrique. Dans de tels cas, les procédures de purification seule étape peut être utilisé pour améliorer la détection des partenaires d'interaction plus faibles. Au cours de notre étude décennie en cours, longue de l'E. coli interactome, nous avons vu les capacités de détection des nouveaux spectromètres de masse génération d'améliorer de façon constante. Ancien instrumentation est biaisé à l'identification récurrente de protéines très abondantes, souvent empêchant la détection de moins abundant mais potentiellement très important protéines interagissant. A l'inverse, la Orbitrap Velos spectromètre de masse hybride que nous utilisons actuellement a nettement amélioré la résolution, précision de la masse et de la sensibilité permettant ainsi beaucoup plus efficace, la détection à haut débit de protéines de faible abondance, y compris les interactions transitoires. Enfin, si la nature de l'interaction est totalement inconnu nous suggérons aux chercheurs de: (i) appliquer des critères stricts d'attribuer les scores de confiance à tous les matches présumés de recherche de données. Les protéines ayant deux ou plusieurs peptides uniques sont généralement considérés comme positifs, en supposant que chaque match passe avec un seuil de probabilité minimale de coupure de 99% ou plus de probabilité, (ii) veiller à examiner la spécificité des interacteurs protéines candidates enregistré avec l'appât marqués dans comparaison avec les résultats obtenus avec les souches témoins négatifs non marqués (expériences simulées) ou des appâts de protéines non apparentées; (iii) réciproquement confirmer les interactions potentielles contenant une protéine inconnue des interintérêt en créant la fusion SPA tag correspondant appât pour purification à grande échelle ou de valider les interactions par paires à l'aide traditionnelle de co-immunoprécipitation avec des anticorps spécifiques des protéines ou tag spécifiques.
À ce jour, en utilisant cette approche systématique, nous avons réussi à marquer et purifier les deux tiers environ de l'~ 2.750 E. protéines solubles qui coli détectable exprimées en culture dans un milieu riche 1, 2. Nous avons également adapté cette même méthode de base pour isoler systématiquement des complexes de protéines associées à la membrane, et sont en train d'essayer de purifier chacun des restants à 1.000 E. protéines coli prévu pour être lié à la membrane. Alors que la purification des protéines membranaires pose souvent des défis uniques, car ils ne sont souvent pas efficacement solubilisées par le tampon d'extraction que nous avons l'habitude d'utiliser pour la méthode SPA, l'ajout de détergents non ioniques à nos tampons permet la solubilisation et la purification de la majorité de la E. coli </ Em> protéines membranaires, nous avons tenté à ce jour (Babu et al., Données non publiées).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Aucun conflit d'intérêt déclaré.
Acknowledgments
Ce travail a été soutenu par des fonds de la Fondation canadienne pour l'innovation, Génome Canada, l'Ontario Genomics Institute, le ministère de l'Innovation, et les Instituts de recherche en santé du don à JG et E. L'AE rouge exprimant coli souche DY330 était un gentil cadeau de Donald L. Cour (National Cancer Institute, Frederick, MD).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| I. Antibiotics | |||
| Kanamycin | Bioshop | #KAN201 | |
| Ampicillin | Bioshop | #AMP201 | |
| 2. Terrific-Broth medium | |||
| Bio-Tryptone | Bioshop | #TRP 402 | |
| Yeast extract | Bioshop | #YEX 555 | |
| Glycerol | Bioshop | #GLY 002 | |
| K2HPO4 | Bioshop | #PPM 302 | |
| KH2PO4 | Bioshop | #PPM 303 | |
| 3. Bacterial Strain and Plasmid | |||
| DY330 | Yu et al. (2000)10 | ||
| pJL148 | Zeghouf et al. (2004)7 | ||
| 4. PCR and Electrophoresis Reagents | |||
| Taq DNA polymerase | Fermentas | # EP0281 | |
| 10 X PCR buffer | Fermentas | # EP0281 | |
| 10 mM dNTPs | Fermentas | # EP0281 | |
| 25 mM MgCl2 | Fermentas | # EP0281 | |
| Agarose | Bioshop | # AGA002 | |
| Loading dye | NEB | #B7021S | |
| Ethidium bromide | Bioshop | # ETB444 | |
| 10X TBE buffer | Thermo Scientific | #28355 | |
| Tris Base | Bioshop | #TRS001 | |
| Boric acid | Bioshop | #BOR001 | |
| 0.5 M EDTA (pH 8.0) | Sigma | # E6768 | |
| DNA ladder | NEB | #N3232L | |
| 5. Plasmid isolation and Clean-up Kits | |||
| Plasmid Midi kit | Qiagen | #12143 | |
| QIAquick PCR purification kit | Qiagen | #28104 | |
| 6. PCR and Transformation Equipments | |||
| Thermal cycler | BioRad | iCycler | |
| Agarose gel electrophoresis | BioRad | ||
| Electroporator | Bio-Rad | GenePulser II | |
| 0.2 cm electroporation cuvette | Bio-Rad | ||
| 42 °C water bath shaker | Innova 3100 | ||
| Beckman Coulter TJ-25 centrifuge | Beckman Coulter | TS-5.1-500 | |
| 32 °C Shaker | New Brunswick Scientific, USA | ||
| 32 °C large Shaker | New Brunswick Scientific, USA | ||
| 32 °C plate incubator | Fisher Scientific | ||
| 7. Electrophoresis and Western blotting | |||
| Acrylamide monomer, N,N'- methylenebis-acrylamide | Bio-Rad | #161-0125 | |
| Ammonium persulfate | Bioshop | # AMP001 | |
| n-butanol | Sigma | # B7906 | |
| TEMED | Bioshop | #TEM001 | |
| Whatman No. 1 filter paper | Fischer Scientific | #09-806A | |
| Mini protean 3 cell | Bio-Rad | #165-3301 | |
| iBlot gel transfer device | Invitrogen | #IB1001 | |
| Nitrocellulose membranes | Bio-Rad | #162-0115 | |
| Monoclonal Anti-Flag M2 antibody | Sigma | #F3165 | |
| Horseradish peroxidase | Amersham | #NA931V | |
| Pre-stained protein molecular weight standards | Bio-Rad | #161-0363 | |
| Chemiluminescence reagent | PIERCE | #1856136 | |
| Autoradiography film | Clonex Corp | #CLEC810 | |
| Quick Draw blotting paper | Sigma | #P7796 | |
| C2 platform rocking shaker | New Brunswick Scientific, USA | ||
| 8. Sonication Equipment and Reagents | |||
| Sonicator | Branson Ultrasonic | #23395 | |
| NaCl | Bioshop | #SOD001 | |
| Protease inhibitors | Roche | #800-363-5887 | |
| 0.5 mM TCEP-HCl | Thermo Scientific | #20490 | |
| 9. Affinity Purification Reagents and Equipment | |||
| 0.8 x 4 cm Bio-Rad polypropylene column | Bio-Rad | #732-6008 | |
| Benzonase nuclease | Novagen | #70746 | |
| Anti-FLAG M2 agarose beads | Sigma | #A2220 | |
| Calmodulin-sepharose beads | GE Healthcare | #17-0529-01 | |
| TEV protease | Invitrogen | #12575-015 | |
| Triton X-100 | Sigma | #T9284 | |
| CaCl2 | Sigma | #C2661 | |
| EGTA | Sigma | #E3889 | |
| LabQuake Shaker | Thermolyne | #59558 | |
| 10. Silver Staining Reagents | |||
| Methanol | Bioshop | #MET302 | |
| Acetic acid | Bioshop | t#ACE222 | |
| Sodium-thiosulfate | Sigma | #S-7143 | |
| Silver nitrate | Fischer Scientific | #S181-100 | |
| Formaldehyde | Bioshop | #FOR201 | |
| Sodium carbonate | Bioshop | #SOC512 | |
| 11. Reagents and Equipment for Protein Identification | |||
| Trypsin Gold, Mass Spectrometry Grade | Promega | # V5280 | |
| 50 mM NH4HCO3 | Bioshop | #AMC555 | |
| 1 mM CaCl2 | Bioshop | #CCL302 | |
| Acetonitrile | Sigma | #A998-4 | |
| Formic acid | Sigma | #F0507 | |
| HPLC grade water | Sigma | #95304 | |
| Iodoacetamide | Sigma | #16125 | |
| Millipore Zip-Tip | Millipore | # ZTC18M960 | |
| ~10 cm of 3 μm Luna-C18 resin | Phenomenex | ||
| Proxeon nano HPLC pump | Thermo Fisher Scientific | ||
| LTQ Orbitrap Velos mass spectrometer | Thermo Fisher Scientific | ||
| 12. Labware | |||
| 4 liter conical flasks | VWR | #89000-372 | |
| 50 ml polypropylene falcon tubes | Any Vendor | ||
| 1.5 ml micro-centrifuge tubes | Any Vendor | ||
| 250 ml conical flaks | VWR | #29140-045 | |
| 15 ml sterile culture tubes | Thermo Scientific | #366052 | |
| Cryogenic vials | VWR | #479-3221 | |
| -80 °C freezer | Fisher Scientific | #13-990-14 | |
| Speed vacuum system | Thermo Scientific | ||
| Buffers and Solutions 1. 1 liter Terrific Broth (TB) media 11 g Bio-Tryptone 2. Potassium Salt Stock Solution 1.5 M K2HPO4 3. Sonication Buffer 20 mM Tris-HCl (pH 7.9) 4. AFC buffer 30 mM Tris-HCl (pH 7.9) 5. TEV cleavage buffer 30 mM Tris-HCl (pH 7.9) 6. Calmodulin binding buffer 30 mM Tris-HCl (pH 7.9) 7. Calmodulin wash buffer 30 mM Tris-HCl pH 7.9 8. Calmodulin elution buffer 30 mM Tris-HCl (pH 7.9) 9. Developing solution (1L) 37% Formaldehyde 10. Digestion buffer 50 mM NH4HCO3 11. Wetting and Equilibration solution 70% acetonitrile (ACN) in 0.1% formic acid 12. Washing solution 100% H2O in 0.1% formic acid |
|||
References
- Butland, G., et al. Interaction network containing conserved and essential protein complexes in Escherichia coli. Nature. 433, 531-537 (2005).
- Hu, P., Janga, S. C., Babu, M., Diaz-Mejia, J. J., Butland, G. Global functional atlas of Escherichia coli encompassing previously uncharacterized proteins. PLoS Biol. 7, e1000096 (2009).
- Krogan, N. J., et al. Global landscape of protein complexes in the yeast Saccharomyces cerevisiae. Nature. 440, 637-643 (2006).
- Mak, A. B., et al. A lentiviral functional proteomics approach identifies chromatin remodeling complexes important for the induction of pluripotency. Mol. Cell Proteomics. 9, 811-823 (2010).
- Polanowska, J., et al. Tandem immunoaffinity purification of protein complexes from Caenorhabditis elegans. Biotechniques. 36, 778-782 (2004).
- Veraksa, A., Bauer, A., Artavanis-Tsakonas, S. Analyzing protein complexes in Drosophila with tandem affinity purification-mass spectrometry. Dev. Dyn. 232, 827-834 (2005).
- Zeghouf, M., et al. Sequential Peptide Affinity (SPA) system for the identification of mammalian and bacterial protein complexes. J. Proteome Res. 3, 463-468 (2004).
- Puig, O., et al. The tandem affinity purification (TAP) method: a general procedure of protein complex purification. Methods. 24, 218-229 (2001).
- Rigaut, G., et al. A generic protein purification method for protein complex characterization and proteome exploration. Nat. Biotechnol. 17, 1030-1032 (1999).
- Yu, D., et al. An efficient recombination system for chromosome engineering in Escherichia coli. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 97, 5978-5983 (2000).
- Kislinger, T., et al. PRISM, a generic large scale proteomic investigation strategy for mammals. Mol. Cell Proteomics. 2, 96-106 (2003).
- Vlasblom, J., et al. GenePro: a Cytoscape plug-in for advanced visualization and analysis of interaction networks. Bioinformatics. 22, 2178-219 (2006).
- de Berardinis, V., et al. A complete collection of single-gene deletion mutants of Acinetobacter baylyi ADP1. Mol. Syst. Biol. 4, 174 (2008).
- Babu, M., et al. Sequential peptide affinity purification system for the systematic isolation and identification of protein complexes from Escherichia coli. Methods Mol. Biol. 564, 373-400 (2009).
