Affiniteitszuivering van gemerkte eiwitten in combinatie met massaspectrometrie (APM) is een krachtige methode voor systematische mapping van eiwit interactie netwerken en het onderzoeken van de mechanistische basis van biologische processen. Hier beschrijven we een geoptimaliseerde sequentiële peptide affiniteit (SPA) APM procedure ontwikkeld voor de bacterie<em> Escherichia coli</em> Die worden gebruikt voor het isoleren en stabiele multi-eiwitcomplexen karakteriseren buurt homogeniteit zelfs vanaf lage kopie-aantallen per cel.
Aangezien de meeste cellulaire processen gemedieerd worden door macromoleculaire samenstellingen, de systematische identificatie van eiwit-eiwit interacties (PPI) en de identificatie van de subunit samenstelling van multi-eiwit complexen kan inzichtelijk genfuncties en het begrip van biologische systemen 1, 2. Fysieke interacties in kaart worden gebracht met groot vertrouwen vialarge schaal isolatie en karakterisering van endogeen eiwit complexen die bijna fysiologische omstandigheden gebaseerd op affiniteitszuivering van chromosomaal gemerkte eiwitten in combinatie met massaspectrometrie (APM). Deze aanpak is succesvol toegepast in evolutionair verschillende organismen, waaronder gist, vliegen, wormen, zoogdiercellen, bacteriën en 1-6. In het bijzonder hebben wij een gegenereerd carboxy-terminale peptide Sequential Affinity (SPA) dual tagging systeem affiniteit zuiveren natieve eiwitcomplexen uit gekweekte gram-negatieve Escherichia coli, met genetically-handelbaar gastheer laboratoriumstammen die zeer geschikt is voor genoom-brede onderzoeken van de fundamentele biologie en geconserveerde processen van prokaryoten 1, 2, 7. De SPA-merksysteem is analoog aan de tandem affinity purification methode oorspronkelijk ontwikkeld voor gist 8, 9, en bestaat uit een calmoduline-bindend peptide (CBP) gevolgd door de splitsingsplaats voor de zeer specifieke tobacco etch virus (TEV) protease en drie kopieën van de FLAG-epitoop (3x FLAG), waardoor twee opeenvolgende rondes van affiniteitsverrijking. Na cassette amplificatie worden sequentiespecifieke lineaire PCR producten coderen voor de SPA-tag en een selecteerbare marker geïntegreerd en uitgedrukt in frame als carboxyterminale fusies in een DY330 achtergrond die wordt geïnduceerd om op transiënte expressie een efficiënte heterologe bacteriofaag lambda rekombinatiestelsel 10. Dual volgende stappen zuivering met calmoduline en anti-FLAG affiniteit beads kan de zeer selectieveen efficiënte invordering van zelfs lage abundantie heeft eiwitcomplexen van grootschalige culturen. Tandem massaspectrometrie wordt vervolgens gebruikt om de stabiel co-zuivering eiwitten te identificeren met hoge gevoeligheid (laag nanogram detectielimieten).
We beschrijven gedetailleerde stap-voor-stap procedures we vaak gebruikt voor systematische eiwit tagging, zuivering en massaspectrometrie-analyse van oplosbare eiwitcomplexen van E. coli, die kan worden opgeschaald en mogelijk aangepast aan andere bacteriële species, waaronder bepaalde opportunistische pathogenen die vatbaar zijn recombineering. De resulterende fysieke interacties kunnen onthullen vaak interessante onverwachte onderdelen en verbindingen suggereren nieuwe mechanistische links. Integratie van de PPI gegevens met alternatieve moleculaire vereniging gegevens, zoals genetische (gen-gen) interacties en genomische-context (GC) voorspellingen kan opheldering van de wereldwijde moleculaire organisatie van multi-eiwit complexen te vergemakkelijken binnen bische paden. De netwerken gegenereerd voor E. coli kan worden gebruikt om inzicht te krijgen in de functionele architectuur van orthologe genproducten in andere microben die functionele annotaties op dit moment ontbreekt.
Een belangrijk aspect van de SPA-gebaseerde APM's beschreven aanpak is dat tagging wordt uitgevoerd binnen de natuurlijke chromosomale context, waardoor waarborging van de normale genregulatie wordt gehandhaafd (dwz. Inheemse aas promotor bewaard gebleven, vandaar expressie niveaus niet wordt verstoord) en native stabiel-geassocieerde eiwitcomplexen worden teruggewonnen op bijna endogene niveaus. Operon polariteit problemen zijn ook voorkomen door een buitenwaarts gerichte promoter in de selecteerbare marke…
The authors have nothing to disclose.
Dit werk werd ondersteund door de middelen van de Canadese Stichting voor Innovatie, Genome Canada, de Ontario Genomics Institute, de Ontario ministerie van Innovatie, en de Canadese Institutes of Health Research subsidie aan JG en AE The Red-expressie E. coli-stam DY330 was een vriendelijke gift van Donald L. Hof (National Cancer Institute, Frederick, MD).
Materials | Vendor | and Catalog Numbers | |
I. Antibiotics | |||
Kanamycin | Bioshop | #KAN201 | |
Ampicillin | Bioshop | #AMP201 | |
2. Terrific-Broth medium | |||
Bio-Tryptone | Bioshop | #TRP 402 | |
Yeast extract | Bioshop | #YEX 555 | |
Glycerol | Bioshop | #GLY 002 | |
K2HPO4 | Bioshop | #PPM 302 | |
KH2PO4 | Bioshop | #PPM 303 | |
3. Bacterial Strain and Plasmid | |||
DY330 | Yu et al. (2000)10 | ||
pJL148 | Zeghouf et al. (2004)7 | ||
4. PCR and Electrophoresis Reagents | |||
Taq DNA polymerase | Fermentas | # EP0281 | |
10 X PCR buffer | Fermentas | # EP0281 | |
10 mM dNTPs | Fermentas | # EP0281 | |
25 mM MgCl2 | Fermentas | # EP0281 | |
Agarose | Bioshop | # AGA002 | |
Loading dye | NEB | #B7021S | |
Ethidium bromide | Bioshop | # ETB444 | |
10X TBE buffer | Thermo Scientific | #28355 | |
Tris Base | Bioshop | #TRS001 | |
Boric acid | Bioshop | #BOR001 | |
0.5 M EDTA (pH 8.0) | Sigma | # E6768 | |
DNA ladder | NEB | #N3232L | |
5. Plasmid isolation and Clean-up Kits | |||
Plasmid Midi kit | Qiagen | #12143 | |
QIAquick PCR purification kit | Qiagen | #28104 | |
6. PCR and Transformation Equipments | |||
Thermal cycler | BioRad | iCycler | |
Agarose gel electrophoresis | BioRad | ||
Electroporator | Bio-Rad | GenePulser II | |
0.2 cm electroporation cuvette | Bio-Rad | ||
42 °C water bath shaker | Innova 3100 | ||
Beckman Coulter TJ-25 centrifuge | Beckman Coulter | TS-5.1-500 | |
32 °C Shaker | New Brunswick Scientific, USA | ||
32 °C large Shaker | New Brunswick Scientific, USA | ||
32 °C plate incubator | Fisher Scientific | ||
7. Electrophoresis and Western blotting | |||
Acrylamide monomer, N,N’- methylenebis-acrylamide | Bio-Rad | #161-0125 | |
Ammonium persulfate | Bioshop | # AMP001 | |
n-butanol | Sigma | # B7906 | |
TEMED | Bioshop | #TEM001 | |
Whatman No. 1 filter paper | Fischer Scientific | #09-806A | |
Mini protean 3 cell | Bio-Rad | #165-3301 | |
iBlot gel transfer device | Invitrogen | #IB1001 | |
Nitrocellulose membranes | Bio-Rad | #162-0115 | |
Monoclonal Anti-Flag M2 antibody | Sigma | #F3165 | |
Horseradish peroxidase | Amersham | #NA931V | |
Pre-stained protein molecular weight standards | Bio-Rad | #161-0363 | |
Chemiluminescence reagent | PIERCE | #1856136 | |
Autoradiography film | Clonex Corp | #CLEC810 | |
Quick Draw blotting paper | Sigma | #P7796 | |
C2 platform rocking shaker | New Brunswick Scientific, USA | ||
8. Sonication Equipment and Reagents | |||
Sonicator | Branson Ultrasonic | #23395 | |
NaCl | Bioshop | #SOD001 | |
Protease inhibitors | Roche | #800-363-5887 | |
0.5 mM TCEP-HCl | Thermo Scientific | #20490 | |
9. Affinity Purification Reagents and Equipment | |||
0.8 x 4 cm Bio-Rad polypropylene column | Bio-Rad | #732-6008 | |
Benzonase nuclease | Novagen | #70746 | |
Anti-FLAG M2 agarose beads | Sigma | #A2220 | |
Calmodulin-sepharose beads | GE Healthcare | #17-0529-01 | |
TEV protease | Invitrogen | #12575-015 | |
Triton X-100 | Sigma | #T9284 | |
CaCl2 | Sigma | #C2661 | |
EGTA | Sigma | #E3889 | |
LabQuake Shaker | Thermolyne | #59558 | |
10. Silver Staining Reagents | |||
Methanol | Bioshop | #MET302 | |
Acetic acid | Bioshop | t#ACE222 | |
Sodium-thiosulfate | Sigma | #S-7143 | |
Silver nitrate | Fischer Scientific | #S181-100 | |
Formaldehyde | Bioshop | #FOR201 | |
Sodium carbonate | Bioshop | #SOC512 | |
11. Reagents and Equipment for Protein Identification | |||
Trypsin Gold, Mass Spectrometry Grade | Promega | # V5280 | |
50 mM NH4HCO3 | Bioshop | #AMC555 | |
1 mM CaCl2 | Bioshop | #CCL302 | |
Acetonitrile | Sigma | #A998-4 | |
Formic acid | Sigma | #F0507 | |
HPLC grade water | Sigma | #95304 | |
Iodoacetamide | Sigma | #16125 | |
Millipore Zip-Tip | Millipore | # ZTC18M960 | |
~10 cm of 3 μm Luna-C18 resin | Phenomenex | ||
Proxeon nano HPLC pump | Thermo Fisher Scientific | ||
LTQ Orbitrap Velos mass spectrometer | Thermo Fisher Scientific | ||
12. Labware | |||
4 liter conical flasks | VWR | #89000-372 | |
50 ml polypropylene falcon tubes | Any Vendor | ||
1.5 ml micro-centrifuge tubes | Any Vendor | ||
250 ml conical flaks | VWR | #29140-045 | |
15 ml sterile culture tubes | Thermo Scientific | #366052 | |
Cryogenic vials | VWR | #479-3221 | |
-80 °C freezer | Fisher Scientific | #13-990-14 | |
Speed vacuum system | Thermo Scientific | ||
Buffers and Solutions 1. 1 liter Terrific Broth (TB) media 11 g Bio-Tryptone 2. Potassium Salt Stock Solution 1.5 M K2HPO4 3. Sonication Buffer 20 mM Tris-HCl (pH 7.9) 4. AFC buffer 30 mM Tris-HCl (pH 7.9) 5. TEV cleavage buffer 30 mM Tris-HCl (pH 7.9) 6. Calmodulin binding buffer 30 mM Tris-HCl (pH 7.9) 7. Calmodulin wash buffer 30 mM Tris-HCl pH 7.9 8. Calmodulin elution buffer 30 mM Tris-HCl (pH 7.9) 9. Developing solution (1L) 37% Formaldehyde 10. Digestion buffer 50 mM NH4HCO3 11. Wetting and Equilibration solution 70% acetonitrile (ACN) in 0.1% formic acid 12. Washing solution 100% H2O in 0.1% formic acid |