Kütle spektrometrisi (antipersonel mayınları) ile kombinasyon halinde etiketli proteinlerin saflaştırılması Affinity protein etkileşimi ağların sistematik eşleme için ve biyolojik süreçlerin mekanistik temeli araştırmak için güçlü bir yöntem. Burada, bakteri için geliştirilmiş optimize edilmiş sıralı peptid afinite (SPA) antipersonel mayınları prosedürü tarif<em> Escherichia coli</em> Bile hücre başına düşük kopya sayıları başlayarak yakın homojenliği kararlı multi-protein kompleksleri izole ve karakterize etmek için kullanılan olabilir.
Çoğu hücresel süreçler makromoleküler meclisleri, protein-protein etkileşimlerinin sistematik tanımlama (ÜFE) ve kompleksleri gen fonksiyonu içgörü sağlamak ve biyolojik sistemleri 1, 2 anlayışı artırabilir çoklu-protein alt ünitesi kompozisyon tespiti aracılık beri. Fiziksel etkileşimler kütle spektrometrisi (antipersonel mayınları) ile kombinasyon halinde kromozomal-etiketli proteinlerin afinite arıtma esas yakın fizyolojik koşullar altında endojen protein komplekslerinin yüksek güven vialarge ölçekli izolasyonu ve karakterizasyonu ile eşlenebilir. Bu yaklaşım başarılı maya, sinek, solucan, memeli hücreleri ve bakteriler 1-6 gibi evrimsel farklı organizmaların, tatbik edilmiştir. Özellikle, ge kullanılarak kültive gram-negatif Escherichia coli afinite arıtma doğal protein kompleksleri için bir karboksi-terminal Sıralı Peptid Affinity (SPA) çift etiketleme sistemi meydana getirmiştirtemel biyoloji ve prokaryotlar 1, 2, 7 korunmuş süreçlerinin genom araştırmaları için çok uygundur netically-uysal ana laboratuar suşları. Bizim SPA-etiketleme sistemi maya 8, 9 başlangıçta geliştirilen tandem afinite saflaştırma yöntemi ile benzerdir ve bir kalmodulin bağlayıcı derece özel tütün etch virüsü (TEV) proteaz için bölünme sitesinin takip peptid (CBP) ve üç nüsha oluşur benzeşim zenginleştirme üst üste iki tur için izin BAYRAK epitopu (3X BAYRAK), ve. Kaset amplifikasyon sonra, SPA-etiketi ve bir seçilebilir işaretleyici kodlayan sekans spesifik lineer PCR ürünleri entegre edilmiş ve geçici bir yüksek verimli heterolog bakteriyofaj lambda rekombinasyon sistemi 10 ifade indüklenen bir DY330 arka planda karboksi-terminal füzyon olarak çerçeve içinde ifade. Kalmodulin ve anti-FLAG afinite boncuklar kullanılarak daha sonraki iki aşamalı bir saflaştırma son derece seçici sağlayanbüyük ölçekli kültürlerden bile düşük bolluk protein komplekslerinin ve etkili kurtarma. Tandem kütle spektrometrisi sonra yüksek duyarlılık (düşük nanogram tespit limitleri) ile stabil olarak eş-temizleyici proteinleri belirlemek için kullanılır.
Burada, biz yaygın sistematik protein etiketleme, saflaştırma ve kitle E. çözünür protein komplekslerinin spektrometresi tabanlı analiz için kullanmak ayrıntılı adım adım prosedürleri tarif büyütülüyor ve potansiyel Recombineering mükellef olan belirli fırsatçı patojenler dahil olmak üzere diğer bakteri türlerinin, uygun olabilir coli. Sonuçlanan fiziksel etkileşimler genellikle ilginç beklenmeyen bileşenleri ve roman mekanistik bağlantılar düşündüren bağlantılarını ortaya çıkarabilir. Örneğin genetik (gen-gen) etkileşimleri ve tahminler iki içinde çok protein komplekslerinin küresel moleküler organizasyonun aydınlatılması kolaylaştırabilir genomik-bağlam (GC) gibi alternatif moleküler birleşme verileri ile ÜFE verileri Entegrasyonuological yollar. E. için oluşturulan ağlar coli fonksiyonel açıklamaları anda eksik olan diğer mikroplar orthologous gen ürünlerinin fonksiyonel mimarisi hakkında fikir edinmek için kullanılabilir.
Burada açıklanan SPA tabanlı antipersonel mayınları yaklaşımın önemli bir yönü olduğunu etiketleme böylece normal gen regülasyonu sağlamak korunur (yani. Yerel yem organizatörü dolayısıyla ekspresyon düzeyleri tedirgin değil, korunmuş) ve stabil ilişkili yerli olup, doğal kromozomal çerçevede yapılan olmasıdır protein kompleksleri yakın endojen düzeylerde geri kazanılır. Operon polarite konuları da seçilebilir işaretleyici bir dışa dönük organizatörü dahil önlenir. Bu …
The authors have nothing to disclose.
Bu çalışma Yenilik, Genom Kanada, Ontario Genomik Enstitüsü, İnovasyon Ontario Bakanlığı ve JG için Sağlık Araştırma hibe Kanada Enstitüleri ve AE Kırmızı-eksprese eden E. için Kanada Vakfı fonları tarafından desteklenen coli suşu DY330 Donald L. Mahkemesi (Ulusal Kanser Enstitüsü, Frederick, MD) bir tür hediye oldu.
Materials | Vendor | and Catalog Numbers | |
I. Antibiotics | |||
Kanamycin | Bioshop | #KAN201 | |
Ampicillin | Bioshop | #AMP201 | |
2. Terrific-Broth medium | |||
Bio-Tryptone | Bioshop | #TRP 402 | |
Yeast extract | Bioshop | #YEX 555 | |
Glycerol | Bioshop | #GLY 002 | |
K2HPO4 | Bioshop | #PPM 302 | |
KH2PO4 | Bioshop | #PPM 303 | |
3. Bacterial Strain and Plasmid | |||
DY330 | Yu et al. (2000)10 | ||
pJL148 | Zeghouf et al. (2004)7 | ||
4. PCR and Electrophoresis Reagents | |||
Taq DNA polymerase | Fermentas | # EP0281 | |
10 X PCR buffer | Fermentas | # EP0281 | |
10 mM dNTPs | Fermentas | # EP0281 | |
25 mM MgCl2 | Fermentas | # EP0281 | |
Agarose | Bioshop | # AGA002 | |
Loading dye | NEB | #B7021S | |
Ethidium bromide | Bioshop | # ETB444 | |
10X TBE buffer | Thermo Scientific | #28355 | |
Tris Base | Bioshop | #TRS001 | |
Boric acid | Bioshop | #BOR001 | |
0.5 M EDTA (pH 8.0) | Sigma | # E6768 | |
DNA ladder | NEB | #N3232L | |
5. Plasmid isolation and Clean-up Kits | |||
Plasmid Midi kit | Qiagen | #12143 | |
QIAquick PCR purification kit | Qiagen | #28104 | |
6. PCR and Transformation Equipments | |||
Thermal cycler | BioRad | iCycler | |
Agarose gel electrophoresis | BioRad | ||
Electroporator | Bio-Rad | GenePulser II | |
0.2 cm electroporation cuvette | Bio-Rad | ||
42 °C water bath shaker | Innova 3100 | ||
Beckman Coulter TJ-25 centrifuge | Beckman Coulter | TS-5.1-500 | |
32 °C Shaker | New Brunswick Scientific, USA | ||
32 °C large Shaker | New Brunswick Scientific, USA | ||
32 °C plate incubator | Fisher Scientific | ||
7. Electrophoresis and Western blotting | |||
Acrylamide monomer, N,N’- methylenebis-acrylamide | Bio-Rad | #161-0125 | |
Ammonium persulfate | Bioshop | # AMP001 | |
n-butanol | Sigma | # B7906 | |
TEMED | Bioshop | #TEM001 | |
Whatman No. 1 filter paper | Fischer Scientific | #09-806A | |
Mini protean 3 cell | Bio-Rad | #165-3301 | |
iBlot gel transfer device | Invitrogen | #IB1001 | |
Nitrocellulose membranes | Bio-Rad | #162-0115 | |
Monoclonal Anti-Flag M2 antibody | Sigma | #F3165 | |
Horseradish peroxidase | Amersham | #NA931V | |
Pre-stained protein molecular weight standards | Bio-Rad | #161-0363 | |
Chemiluminescence reagent | PIERCE | #1856136 | |
Autoradiography film | Clonex Corp | #CLEC810 | |
Quick Draw blotting paper | Sigma | #P7796 | |
C2 platform rocking shaker | New Brunswick Scientific, USA | ||
8. Sonication Equipment and Reagents | |||
Sonicator | Branson Ultrasonic | #23395 | |
NaCl | Bioshop | #SOD001 | |
Protease inhibitors | Roche | #800-363-5887 | |
0.5 mM TCEP-HCl | Thermo Scientific | #20490 | |
9. Affinity Purification Reagents and Equipment | |||
0.8 x 4 cm Bio-Rad polypropylene column | Bio-Rad | #732-6008 | |
Benzonase nuclease | Novagen | #70746 | |
Anti-FLAG M2 agarose beads | Sigma | #A2220 | |
Calmodulin-sepharose beads | GE Healthcare | #17-0529-01 | |
TEV protease | Invitrogen | #12575-015 | |
Triton X-100 | Sigma | #T9284 | |
CaCl2 | Sigma | #C2661 | |
EGTA | Sigma | #E3889 | |
LabQuake Shaker | Thermolyne | #59558 | |
10. Silver Staining Reagents | |||
Methanol | Bioshop | #MET302 | |
Acetic acid | Bioshop | t#ACE222 | |
Sodium-thiosulfate | Sigma | #S-7143 | |
Silver nitrate | Fischer Scientific | #S181-100 | |
Formaldehyde | Bioshop | #FOR201 | |
Sodium carbonate | Bioshop | #SOC512 | |
11. Reagents and Equipment for Protein Identification | |||
Trypsin Gold, Mass Spectrometry Grade | Promega | # V5280 | |
50 mM NH4HCO3 | Bioshop | #AMC555 | |
1 mM CaCl2 | Bioshop | #CCL302 | |
Acetonitrile | Sigma | #A998-4 | |
Formic acid | Sigma | #F0507 | |
HPLC grade water | Sigma | #95304 | |
Iodoacetamide | Sigma | #16125 | |
Millipore Zip-Tip | Millipore | # ZTC18M960 | |
~10 cm of 3 μm Luna-C18 resin | Phenomenex | ||
Proxeon nano HPLC pump | Thermo Fisher Scientific | ||
LTQ Orbitrap Velos mass spectrometer | Thermo Fisher Scientific | ||
12. Labware | |||
4 liter conical flasks | VWR | #89000-372 | |
50 ml polypropylene falcon tubes | Any Vendor | ||
1.5 ml micro-centrifuge tubes | Any Vendor | ||
250 ml conical flaks | VWR | #29140-045 | |
15 ml sterile culture tubes | Thermo Scientific | #366052 | |
Cryogenic vials | VWR | #479-3221 | |
-80 °C freezer | Fisher Scientific | #13-990-14 | |
Speed vacuum system | Thermo Scientific | ||
Buffers and Solutions 1. 1 liter Terrific Broth (TB) media 11 g Bio-Tryptone 2. Potassium Salt Stock Solution 1.5 M K2HPO4 3. Sonication Buffer 20 mM Tris-HCl (pH 7.9) 4. AFC buffer 30 mM Tris-HCl (pH 7.9) 5. TEV cleavage buffer 30 mM Tris-HCl (pH 7.9) 6. Calmodulin binding buffer 30 mM Tris-HCl (pH 7.9) 7. Calmodulin wash buffer 30 mM Tris-HCl pH 7.9 8. Calmodulin elution buffer 30 mM Tris-HCl (pH 7.9) 9. Developing solution (1L) 37% Formaldehyde 10. Digestion buffer 50 mM NH4HCO3 11. Wetting and Equilibration solution 70% acetonitrile (ACN) in 0.1% formic acid 12. Washing solution 100% H2O in 0.1% formic acid |