Summary
Kütle spektrometrisi (antipersonel mayınları) ile kombinasyon halinde etiketli proteinlerin saflaştırılması Affinity protein etkileşimi ağların sistematik eşleme için ve biyolojik süreçlerin mekanistik temeli araştırmak için güçlü bir yöntem. Burada, bakteri için geliştirilmiş optimize edilmiş sıralı peptid afinite (SPA) antipersonel mayınları prosedürü tarif
Abstract
Çoğu hücresel süreçler makromoleküler meclisleri, protein-protein etkileşimlerinin sistematik tanımlama (ÜFE) ve kompleksleri gen fonksiyonu içgörü sağlamak ve biyolojik sistemleri 1, 2 anlayışı artırabilir çoklu-protein alt ünitesi kompozisyon tespiti aracılık beri. Fiziksel etkileşimler kütle spektrometrisi (antipersonel mayınları) ile kombinasyon halinde kromozomal-etiketli proteinlerin afinite arıtma esas yakın fizyolojik koşullar altında endojen protein komplekslerinin yüksek güven vialarge ölçekli izolasyonu ve karakterizasyonu ile eşlenebilir. Bu yaklaşım başarılı maya, sinek, solucan, memeli hücreleri ve bakteriler 1-6 gibi evrimsel farklı organizmaların, tatbik edilmiştir. Özellikle, ge kullanılarak kültive gram-negatif Escherichia coli afinite arıtma doğal protein kompleksleri için bir karboksi-terminal Sıralı Peptid Affinity (SPA) çift etiketleme sistemi meydana getirmiştirtemel biyoloji ve prokaryotlar 1, 2, 7 korunmuş süreçlerinin genom araştırmaları için çok uygundur netically-uysal ana laboratuar suşları. Bizim SPA-etiketleme sistemi maya 8, 9 başlangıçta geliştirilen tandem afinite saflaştırma yöntemi ile benzerdir ve bir kalmodulin bağlayıcı derece özel tütün etch virüsü (TEV) proteaz için bölünme sitesinin takip peptid (CBP) ve üç nüsha oluşur benzeşim zenginleştirme üst üste iki tur için izin BAYRAK epitopu (3X BAYRAK), ve. Kaset amplifikasyon sonra, SPA-etiketi ve bir seçilebilir işaretleyici kodlayan sekans spesifik lineer PCR ürünleri entegre edilmiş ve geçici bir yüksek verimli heterolog bakteriyofaj lambda rekombinasyon sistemi 10 ifade indüklenen bir DY330 arka planda karboksi-terminal füzyon olarak çerçeve içinde ifade. Kalmodulin ve anti-FLAG afinite boncuklar kullanılarak daha sonraki iki aşamalı bir saflaştırma son derece seçici sağlayanbüyük ölçekli kültürlerden bile düşük bolluk protein komplekslerinin ve etkili kurtarma. Tandem kütle spektrometrisi sonra yüksek duyarlılık (düşük nanogram tespit limitleri) ile stabil olarak eş-temizleyici proteinleri belirlemek için kullanılır.
Burada, biz yaygın sistematik protein etiketleme, saflaştırma ve kitle E. çözünür protein komplekslerinin spektrometresi tabanlı analiz için kullanmak ayrıntılı adım adım prosedürleri tarif büyütülüyor ve potansiyel Recombineering mükellef olan belirli fırsatçı patojenler dahil olmak üzere diğer bakteri türlerinin, uygun olabilir coli. Sonuçlanan fiziksel etkileşimler genellikle ilginç beklenmeyen bileşenleri ve roman mekanistik bağlantılar düşündüren bağlantılarını ortaya çıkarabilir. Örneğin genetik (gen-gen) etkileşimleri ve tahminler iki içinde çok protein komplekslerinin küresel moleküler organizasyonun aydınlatılması kolaylaştırabilir genomik-bağlam (GC) gibi alternatif moleküler birleşme verileri ile ÜFE verileri Entegrasyonuological yollar. E. için oluşturulan ağlar coli fonksiyonel açıklamaları anda eksik olan diğer mikroplar orthologous gen ürünlerinin fonksiyonel mimarisi hakkında fikir edinmek için kullanılabilir.
Protocol
1. E. Gen özgü SPA-etiketleme İnşaatı coli DY330 Gerinim
- Plazmid pJL148 SPA-etiket DNA sekansı ve kanamisin antibiyotik direnç işaretleyicisi kaset (Kan R) içeren polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) amplifikasyon 7'de bir şablon olarak kullanılır. Bir 27 bp (5'-AGCTGGAGGATCCATGGAAAAGAGAAG -3 ') etiket spesifik ileri primer ile çerçeve içinde hedef gen stop kodonu arasında hemen akış yukarı yer alan bir 45 nt gen spesifik ileri primer, ve bir 45 nt gene özel ters primerler, hemen arkasında 94: 27 bp (5'-GGCCCCATATGAATATCCTCCTTAGTT -3 ') özel etiket ters primeri ile çerçeve içinde hedef gen stop kodonu akış aşağı aşağıdaki PCR döngü koşulları kullanılarak pJL148 dan SPA-tag ve Kan R kaset yükseltmek için kullanılır 5 dk için ° C, 1 dakika, 68 için 1 dakika, 55 ° C ° '10 dakika süreyle 68 ° C'de, ardından 2 dk 10 sn için C, 94 ° C, 30 döngü. Çoğaltılan dizileri bir hizmetektopik tanıttı λ-Kırmızı homolog rekombinasyon amaçlı s substratlar (bkz. aşağıda).
- PCR ürünü elektroporasyon ile etkileşime girebilir tuzları uzaklaştırmak için bir QIAquick PCR saflaştırma kiti kullanılarak saflaştırılır. Saflaştırılan PCR ürünü daha sonra λ-Kırmızı rekombinasyon makineleri 10 ifade edildiği DY330 gerilme, belirli bir genin 3 'ucunun (yerli stop kodonu arasında hemen akıntı yukarı için) de entegre hedeflenmektedir.
- DY330 λ-Kırmızı ifade gerinim 180 rpm'de sallayarak 32 ° C'de 2 ml Luria-Bertani (LB) orta gecede büyüdü. Gecede kültürü 1 ml sonradan 500 ml.lik erlene 70 ml taze LB ortama inoküle edilir. Inokulum OD 600 ~ 0.8 ulaşıncaya kadar 180 rpm'de sallayarak 32 ° C'de yetiştirilir.
- Kültür hücreleri ° C hafifçe de sallayarak 42 bir su banyosunda balonun bekletilmeleri ile indüklenen olan taze bir 250 ml.lik erlene, aktarılır15 dakika için 180 rpm. Indüksiyon hemen sonra, şişenin sallama ile en az 30 dakika süreyle bir buz su banyosu içinde bulamaç inkübe edilir.
- Buz-soğuk kültür hemen önce soğutulmuş 50 ml polipropilen tüp içine aktarılır ve 4, 6 dakika boyunca 3,993 x g'de santrifüj tabi ° C olduğu Hücre pelet, 50 ml buz-soğuk steril su içinde yeniden süspansiyonlandı ve 4 ° C'de 6 dakika için 3,993 xg'de tekrar santrifüje tabi tutulur Hücre peleti daha sonra soğuk su, 1 ml içinde tekrar süspanse edilir ve bir 1.5 ml Effendorf tüpüne aktarılır ve 4 ° C sıcaklıkta 20 sn için maksimum hızda santrifüje tabi tutulur Buz gibi soğuk su ile iki ya da üç yıkama aşamalarından sonra hücre peleti elektro-yetkili hücreler ile sonuçlanan, buz-soğuk steril su, 700 ul son olarak tekrar süspanse edilir.
- Elektroporasyon yoluyla saflaştırılmış bir amplikon ul elektro-yetkili hücreler 40 ul içine verilir. 2,5 kV, darbe ile 25 μF: hücreler aşağıdaki ayarları ile Bio-Rad GenePulser II electroporated edilir200 Ω denetleyicisi. Homolog rekombinasyon ve entegrasyon sonra, başarılı bir kromozom içine etiketi / kaset recombined transformantlar Kan (Şekil 1A) direnç göre seçilir. Birden transformantlar Batı SPA-etiketinin BAYRAK epitoplara seçici anti-BAYRAK M2 antikoru ile SPA-etiketli füzyon proteinleri doğru nesil (yani pozitif sinyal) doğrulamak için blot için seçilir.
- Onaylandı karboksi terminal SPA-etiketi füzyon suşu SPA arıtma protokolü kullanılarak hasat hücreleri çözünür protein kompleksleri izole etmek için geniş çaplı bir kültüre edilir. Benzeşme etiket saflaştırma prosedür söz konusu olan adımlar taslağı Şekil 1B 'de gösterilmiştir.
2. Kültürü ve Sonikasyon
- SPA-etiketli E. 100 ul inoküle 50 ml müthiş suyu (TB) içine coli gliserol stok sıvı ortam 25 ug / ml o 50 ul ile desteklenmiş250 ml.lik erlene f Kan çözüm. 32 ° C'de gece boyunca kültür büyütün
Not: suşu DY330 içindeki sıcaklık-indüklenebilir λ Kırmızı kaset sıcaklığa duyarlı repressör 10 kontrolü altında olduğundan, SPA-etiketli E. coli suşu 32 ° C'de yetiştirilir - 4 litrelik bir şişe içinde Kan, 25 ug / ml ile takviye 990 ml taze TBC gece boyunca kültür 10 ml aktarın. OD 600 ~ 2 ila 3 ulaşana kadar kültür, 32 ° C'de sabit 5 ila 6 saat boyunca 250 rpm'de sallayarak yetiştirilir.
- 1 litre E. aktarın coli SPA-tag kültürün santrifüj şişeleri temizlemek ve 15 dakika için Beckman ° C J6-HC santrifüj @ 3993 xg 4'te hücreleri dönmeye.
- Süpernatant santrifüj şişelerinden çıkarılır. E. süspanse sonikasyon tamponu, 25 ml ile coli hücre pelletleri. Her zaman buz üzerinde santrifüj şişeleri tutmak için emin olun.
- Yeniden süspanse pelet olduğunu50 ml polipropilen Falcon tüpüne nakledilir ve sıvı azot kullanılarak dondurulmuştur. Donmuş hücreleri -80 ° C'de uzun süreli kullanım için saklanır.
- Önce sonication için, buz üzerinde pelet tutarak tamamen donmuş hücreleri eritin. Çözülmüş numuneler sonication için buz üzerine yerleştirilmiş bir steril bir paslanmaz çelik kap için transfer edilir. Sonda numune içine daldırılmış ve 3 dakika boyunca sonike edilmektedir. Ek bir 2 dakika aşırı ısınmaya karşı örnek soğumaya bırakılmıştır.
- Sonicated hücre lisatı önceden soğutulmuş steril santrifüj tüpü içine aktarılmış ve iki defa 15 dakika süreyle bir JA-17 @ rotor 35.267 x g'de (16000 rpm) ile Beckman santrifüj içinde 4 ° C'de santrifüje tabi tutulur.
Not: bu zar proteinleri olan fraksiyonunu bilmediğinden zar protein saflaştırılması durumunda, sonicated hücre lizat 15 dakika için sadece bir kez santrifüj edilir, ki pelet ya da süpernatan fraksiyonu ya da vardır. Yani mem aşırı kaybını önlemek içinmembran proteinleri, biz 15 yüksek hızda santrifüj dk ve% 1 deterjan membran proteinleri çözünür nerelerde kullanılır süpernatant sonradan (aşağıdaki adımlara bakın) arıtma için işlenir için hücrelerin döndürün. - Santrifüjleme tüpten dikkatli bir şekilde 50 ml polipropilen Falcon tüpüne nakledilir ve sıvı azot kullanılarak dondurulmuştur. Sonicated dondurulmuş hücre özütü gelecekte kullanılmak üzere -80 ° C'de 6 ay, maksimum süre için saklanır.
3. Affinity Arıtma
- Kullanmadan önce, Anti-Flag M2 boncuk 100 ul AFC 10 hacim tampon (30 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl,% 0.1 deterjan, ve 0.1-0.5 mM TCEP [tris (2-karboksietil) fosfin ile yıkanır - Deterjan olmaksızın hidroklorik asit]) ve indirgeyici madde TCEP (tris (2-karboksietil) fosfin).
- Dondurulmuş, sonicated hücre özütü soğuk suda tüp yerleştirerek eridi. Çözülmüş hücre özütü benzo 3 ul ile inkübe4 ° C'de 30 dakika süreyle Nase nükleaz Bu karışıma, non-iyonik deterjan eklemek Triton X-100 (deterjanı son konsantrasyonu% 0.1 olmalıdır) ve Anti-Flag M2 agaroz boncukları 200 ul süspansiyonlar bulunmaktadır.
Not: bütün çözünür proteinin saflandırma için,% 0.1 Triton X-100, spesifik olmayan adsorpsiyon, en aza indirmek için kullanıldığı durumlarda olduğu gibi bir zar proteini, böyle C12E8 (Octaethylene glikol dodesil eter) gibi farklı hafif non-iyonik deterjanlar, DDİ (saflaştırılması için aşağıdakileri N-dodesil β-D-maltoside) ve maltoz-neopentil glikol (MNG) çözünmüş artırmak için% 1 deterjan konsantrasyonunda kullanılır. Ayrı deterjanlar membran proteinlerinin çözünürleştirme verimliliği değişen var olduğundan, birden fazla deterjan kullanarak bağımsız protein arındırmalardan gerçekleştirmek için tavsiye edilir. - İçerik yavaşça ° C'de bir LabQuake çalkalayıcı kullanılarak 4, 3 saat boyunca tüp döndürülerek karıştırılır. Dönme 3 saat sonra, tüp 6 dakika boyunca 1,700 x g santrifüj edilir. Süpernatant ardından rgevşek boncuk pelet bozmadan, mümkün olduğunca dikkatli emoved.
- Pelet kalan süpernatan içinde tekrar süspanse edilir ve daha sonra 0.8 x 4 cm Bio-Rad polipropilen prep kolon içine aktarılır. Elüsyonların yerçekimi akışı ile boşalması için, sütunun dipsavak tıkacı çıkarmak için emin olun. TEV dilinimi adım sütun 5 kez yıkayın.
- Eluatlar yıkanmış Boşaltmadan sonra, sütunun alt çıkış kapatılır. Aynı sütun için yarılma sütun üzerine TEV proteaz ve 1X tampon AFC 400 ul ~ 5-10 ul (50 ünite) eklenmesi ile gerçekleştirilir. Bir kapak ile sütunun üst kapatmak için emin olun. Boncuk içeren sütunu LabQuake çalkalayıcı kullanarak 4 ° C gecede gecede hafifçe döndürülür.
- Sütunun alt ve üst çıkış fiş kapağını çıkarın ve 10 ile yıkanır, kalmodulin-Sepharose boncuklar 200 ul süspansiyonlar içeren taze bir sütun içine TEV bölünme sonra geri yıkama sıvıları boşaltmakkalmodulin bağlayıcı tampon hacimleri.
- Üst ve sütunun alt ikisi de sıkıca bağlanır, ve kolon içindekilerin ° C'de bir LabQuake çalkalayıcı kullanılarak 4, 3 saat süre ile hafifçe döndürülerek karıştırılır.
- Dönme 3 saat sonra, elüsyon sütunun üst kapak ve alt fişi ile boşaltılır. Sütun kalmodulin yıkama tamponu ile 400 ul bir sıkı yıkama izledi 1X kalmodulin bağlayıcı tampon 200 ul ile dört kez yıkanmıştır.
- Bağımlı Protein 1X kalmodulin elüsyon tamponu kullanılarak yeni bir Eppendorf tüpü içinde 50 ul dört fraksiyonlar halinde elüt edilmektedir. Yıkanan fraksiyonu eşit hacimde iki temiz Eppendorf tüplerine dağıtılır. Her iki tüp daha sonra bir hızlı vakum kullanarak kurutulur.
- Diğer önceki kütle spektrometrisi kullanılarak, -80 ° C de saklanır iken bir tüp kurutulmuş elüsyon, bir gümüş boyama jel çalıştırmak için kullanılır.
4. Gümüş Boyama
- Gümüş staini içinng, 3X SDS (sodyum dodesil sülfat), numune tampon hacminin yarısına kurutulmuş arındırıldı ve 50 ul ilave edilir. 5 dakika için karışımın kaynama sonra, örnekler, bir SDS-poliakrilamid jeli üzerine yüklenir.
- Jel çalışması bittikten sonra, dikkatli bir şekilde sabitleme çözeltisi içine yerleştirilir (% 50 metanol ve% 10 asetik asit) ve 20 dakika için bir döner çalkalayıcı üzerinde hafifçe karıştırılır. Jel daha sonra, 10 dakika süreyle% 20 etanol içinde durulanır.
- Sabit jel düşük homojen bir arkaplan sağlamak için 10 dakika için çifte damıtılmış 500 ml su ile iki kez iyice yıkanır.
- Jel daha sonra 20 saniye için damıtılmış su ile iki yıkama adımları ardından 1 dakika için, 500 ml sodyum tiyosülfat yavaşça karıştırılır.
- Suya atılır, ve jel 30 dakika süreyle% 0.1 'lik gümüş nitrat, 200 ml içerisinde inkübe edilir. Bu süreden sonra, gümüş nitrat kaldırılır ve jel fazla gümüş nitrat kaldırmak için 20 saniye için damıtılmış su ile yıkanır.
- Jel sonunda 75 ml içinde çalkalanır eliylegelişen çözeltisi eklendi. Istenilen yoğunluğu elde edildikten sonra, gelişen çözelti atıldı ve asetik asit 80 ml reaksiyonu durdurmak için eklenir. Jel bant uygun görselleştirme için 20 dakika arasında, en az asetik asit içinde jel inkübe edin.
5. Kütle Spektrometresi için Proteoliz ve Numune Hazırlama
- Kurutulmuş numune için, sindirim tamponu 50 ul ve 100 mM TCEP-HCl (tris (2-karboksietil) fosfin - hidroklorik asit) 0.9 ul ekle ve oda sıcaklığında 45 dakika için karışımın inkübe indirgeme adımı için. Daha sonra, 500 mM iodoacetamide 1 ul ilave edilir ve numune alkilasyon için izin vermek için başka bir 40 dakika süreyle karanlıkta inkübe edilir.
- İnkübasyonun ikinci turundan sonra, karışım için immobilize tripsin 1 ug ilave edin ve 5 saat ya da oda sıcaklığında gece boyunca 37 ° C sıcaklıkta ya da inkübe edilir. Asetik asit, 1 ul ekleyerek reaksiyonu durdurmak için emin olun.
- Pre-ıslak Millipoıslatma ve dengeleme çözümü 10 ul aspire tarafından yeniden ZipTip pipet. Atık çözelti dağıtın. Daha sonra yıkama solüsyonu 10 ml aspirat ve atık solüsyonu dağıtmak. Bu adımı iki kez tekrarlayın.
- Uç için peptid karışımı ile etkin bir şekilde bağlayıcı için, pipet peptid karışımı ile 20 kez ilave edilir. Uç yapıştırılır ki peptid karışımı ile aspire ve yıkama çözeltisi dağıtıcı ile yıkanır. Ucu peptid karışımı etkili bağlanma için iki kez bu işlemi tekrarlayın.
- Bağlama peptidi içeren uç ile, ıslatıcı ve dengeleme çözelti 10 ml aspire ve temiz bir eppendorf tüpüne dağıtın. Bu adımı iki kez tekrarlayın. Kullanmak ° C'ye önce hızlı vakum içinde seyreltilen numuneler kurutulduktan sonra, numuneler kütle spektrometresi ile analiz edilebilir hemen ya da -80 saklanabilir.
6. LTQ Orbitrap Velos Kütle Spektrometresi Protein Tanımlama
Thİzole edilen kompleksler e polipeptit bileşenlerini bir LTQ Orbitrap Velos melez tandem kütle spektrometresi kullanılarak belirlenmiştir. Orbitrap, olağanüstü çözme gücü (> 60.000 Tam Genişlik Yarım Maksimum veya FWHM) ve kontrol arındırmalardan tespit alakasız non-spesifik arka bulaşanların MS / MS örnekleme minimize kütle doğruluğu (<2 ppm) sahip yüksek hızlı Velos iyon tuzağı ise bileşeni algılayabilir ve elektron transferi disosiyasyon ve çarpışma ile indüklenen disosiasyon modlarını kullanarak hem fragmanı düşük bolluk peptidler. Çıkan MS / MS spektrumları arasında yüksek güven maçlar referans E. eşleştirilir coli protein dizileri SEQUEST ve STATQUEST 11 gibi bir olasılık algoritması sırasında değerlendirilen her bir eşleşme dizisi gibi veritabanı arama algoritması kullanarak. Toplam spektrumu sayısı, peptid sekansı özgünlüğü ve negatif kontrol (örn. Sahte) saflandırma tespit edilen ortak bir arka plan kirletici maddelerin düşük deneysel sahte-dis elde etmek için kabul edilirCovery oranı. Aşağıdaki adımları protein tespiti için yapılır:
- Mikro kolonlar 3 mikron Luna-C 18 reçine ~ 10 cm dolu ve Orbitrap alet doğrultusunda yerleştirilen bir Proxeon nanoelectrospray iyon kaynağı ile arayüzü vardır.
- Bir Proxeon nano akış ikili HPLC pompası peptid ayırımları boyunca ~ 300 nl dk-1 bir ucu sabit akış oranı vermek için kullanılır.
- Peptid elüsyon ulaşmak için, organik bir tampon degrade örneği karmaşıklığına göre ayarlanır. Örneğin, aşağıdaki degrade tipik E. için ayarlanır coli SPA örnekleri: çözücü B 1 dak için% 100 tutulan sonraki 4 dakika içinde% 100, 38 dakika içinde% 24, 1 dak% 2 ila% 6 artmış, daha sonra 1 dakika içinde% 2'ye düşmüştür ve 15 dakika boyunca 2% tutarak son. Mobil faz çözücü A çözücü B% 0.1 'lik formik aci ile% 5 gradyan HPLC su ve% 95 ACN sahip iken,% 0.1' lik formik asit ile% 95 HPLC gradyanı, su ve 5% ACN sahiptird. Iğnenin ucundaki akış hızı 60 dk 300 nl dk -1 olarak ayarlanır.
- Kütle spektrometresi çevrimleri 60.000 çözünürlüklerde tam bir kitlesel tarama ile çalıştırmak gibi, 10 eş zamanlı tandem parçalanma kitle taramaları en yoğun habercisi iyonları için toplanır. Dinamik dışlama, tek izotoplu kitle seçimi, ve gerçek zamanlı veri bağımlı toplama aracı özellikleri etkinleştirilir.
- Spektrumları E. bir veritabanı karşı böyle SEQUEST gibi bir veritabanı arama algoritmasını kullanarak aranır coli protein dizileri ve sonuç istatistiksel olarak düşük bir yanlış keşif hızı sağlamak için böyle STAQUEST 11 gibi bir olasılık algoritması kullanılarak süzülür. Maçlar teorik peptid kütle kıyasla fazla 10 ppm kitle hata gösteren daha fazla dikkate elimine edilirken Yalnızca yüksek güven (% 99 olasılık) aday seçilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Burada açıklanan SPA tabanlı antipersonel mayınları yaklaşımın önemli bir yönü olduğunu etiketleme böylece normal gen regülasyonu sağlamak korunur (yani. Yerel yem organizatörü dolayısıyla ekspresyon düzeyleri tedirgin değil, korunmuş) ve stabil ilişkili yerli olup, doğal kromozomal çerçevede yapılan olmasıdır protein kompleksleri yakın endojen düzeylerde geri kazanılır. Operon polarite konuları da seçilebilir işaretleyici bir dışa dönük organizatörü dahil önlenir. Bu SPA-etiketleme yaklaşımı altbirimleri bakteriyel hücre başına sadece birkaç molekül aşağı ifade bile membran ilişkili meclisleri dahil yakınındaki homojenliği düşük bolluk kompleksleri, bileşenleri arındırmak için yeterince etkilidir. Genel olarak, bu protokol E. etiketlendi çözünür proteinlerin büyük setleri arındırıcı için kolayca ölçekli-up olabilir coli ya da prensip olarak Recombineering etiketleme vasıtasıyla mümkün olan herhangi bir başka bakteri türleri ya da olanlar bu parça doğal olarak yüksek dönüşümüAcinetobacter, hedeflenen gen Knockouts 13 bir gerginlik kitaplığı oluşturmak için, örneğin kullanılır olmuştur bakteri genetiği yükselen bir beygir, gibi tion yeteneği.
Büyük ölçekli proteomik yaklaşımlar için doğal bir önemli bir husustur gelişigüzel non-spesifik Etkileşimi ve sahte iz kontaminasyon tanımlanmasıdır. Zenginleşme iki tur rağmen, bizim rutin SPA arındırmalardan düzenli genellikle kromatografik reçine ve / veya yem proteinleri ile non-spesifik bağlama ribozomal proteinlerin ve şaperonlar gibi yüksek bolluk temizlik proteinlerdir sık kontaminantları tespit. Bu sorun, iki şekilde azaltılabilir. İlk olarak, belirli bir yem ile tanımlanan her proteinin toplam spektral numarası ve teklik birden çok alakasız protein yemler arındırmalardan daha geniş bir dizi göreli ve etiketsiz (yani. Yabani türü) negatif kontrol suşu (yani. Davalarını afinite saflaştırma exper itibaren kabul ediliryalancı pozitif dernekler en aza indirmek için iments). İkincisi, tüm aday protein etkileşimleri SPA-etiketinin varlığını içine yerli proteinlerin dahil bozan çıktığı çok ender durumlar önlemek için bağımsız olarak teyit bireysel protein-protein etkileşimleri amacı ile, karşılıklı etiketleme ve varsayılan bağlayıcı ortağı saflaştırma kullanılarak valide edilmelidir endojen protein montaj.
Antipersonel mayınları tabanlı proteomik araştırmalar geçici veya alt stokiyometrik etkileşimlerinin belirlenmesi açısından duyarlılık eksikliği ile sınırlıdır. Bu gibi durumlarda, tek aşamalı bir saflaştırma işlemine zayıf etkileşimi ortak tespit artırmak için kullanılabilir. E. devam eden, on yıllık uzun çalışma sırasında coli interactome, biz yeni nesil Massenspektrometer tespit kapasitesini sürekli geliştirmek gördük. Eski enstrümantasyon genellikle daha az abu algılama engelleyen, son derece bol proteinlerin tekrarlayan belirlenmesine önyargılındant ancak potansiyel olarak çok önemli bir etkileşim proteinler. Tersine, Orbitrap şu anda belirgin şekilde iyileşmiştir çözünürlük, kütle doğruluğu ve hassasiyeti dolayısıyla geçici etkileşimler de dahil olmak üzere düşük bolluk proteinler çok daha verimli, yüksek verimlilik algılama, izin gelmiştir kullanmak hibrit kütle spektrometresi Velos. Etkileşimin doğasını tamamen bir bilinmeyen Son olarak, eğer biz araştırmacılar öneririz: (i) tüm olası veritabanı arama eşleşmeleri güven puanlarını atamak için sıkı kriterleri geçerlidir. Iki veya daha fazla benzersiz peptitler ile Proteinler genellikle her maç% 99 veya daha fazla bir olasılık az olabilirlik eşik kesme ile geçer varsayarsak, pozitif olarak kabul edilir; (ii) etiketli yem ile kaydedilen aday Protein Etkileşimi özgüllüğünü incelemek için emin olun Negatif kontrol etiketsiz suşları (mock deneyleri) ya da ilgisiz protein yemler ile elde edilen sonuçlar karşılaştırıldığında, (iii) karşılıklı arası bilinmeyen bir protein içeren potansiyel etkileşimleri onaylayınest büyük ölçekli arıtma için gelen SPA etiketi yem füzyon oluşturma veya protein spesifik veya etiketi spesifik antikorlar ile geleneksel eş immünopresipitasyon kullanarak çifti-bilge etkileşimleri doğrulamak tarafından.
Bugüne kadar, bu sistematik bir yaklaşım kullanarak, biz ~ 2.750 E. yaklaşık üçte ikisi etiketlemek ve arınmayı başardı algılanabilir zengin orta 1, 2, kültürü altında ifade coli çözünür proteinler. Biz de sistematik membran ilişkili protein kompleksleri izole etmek için bu aynı temel yöntemi adapte olması ve şimdi kalan ~ 1.000 E. her arındırmak için çalışıyorsunuz coli proteinleri membran bağlı olduğu tahmin. Genellikle verimli biz normalde SPA yöntemi için kullandığınız ekstraksiyon tamponu ile çözündüğünü değil çünkü membran proteinlerinin saflaştırılması genellikle benzersiz zorluklar teşkil ederken, bizim tamponlara iyonik olmayan deterjan ilave bir çoğunluğunun çözünürleştirme ve saflaştırılması sağlar E. coli </ Em> membran proteinleri biz (Babu ve ark., Yayınlanmamış veri) bugüne kadar çalıştılar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Çıkar çatışması ilan etti.
Acknowledgments
Bu çalışma Yenilik, Genom Kanada, Ontario Genomik Enstitüsü, İnovasyon Ontario Bakanlığı ve JG için Sağlık Araştırma hibe Kanada Enstitüleri ve AE Kırmızı-eksprese eden E. için Kanada Vakfı fonları tarafından desteklenen coli suşu DY330 Donald L. Mahkemesi (Ulusal Kanser Enstitüsü, Frederick, MD) bir tür hediye oldu.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| I. Antibiotics | |||
| Kanamycin | Bioshop | #KAN201 | |
| Ampicillin | Bioshop | #AMP201 | |
| 2. Terrific-Broth medium | |||
| Bio-Tryptone | Bioshop | #TRP 402 | |
| Yeast extract | Bioshop | #YEX 555 | |
| Glycerol | Bioshop | #GLY 002 | |
| K2HPO4 | Bioshop | #PPM 302 | |
| KH2PO4 | Bioshop | #PPM 303 | |
| 3. Bacterial Strain and Plasmid | |||
| DY330 | Yu et al. (2000)10 | ||
| pJL148 | Zeghouf et al. (2004)7 | ||
| 4. PCR and Electrophoresis Reagents | |||
| Taq DNA polymerase | Fermentas | # EP0281 | |
| 10 X PCR buffer | Fermentas | # EP0281 | |
| 10 mM dNTPs | Fermentas | # EP0281 | |
| 25 mM MgCl2 | Fermentas | # EP0281 | |
| Agarose | Bioshop | # AGA002 | |
| Loading dye | NEB | #B7021S | |
| Ethidium bromide | Bioshop | # ETB444 | |
| 10X TBE buffer | Thermo Scientific | #28355 | |
| Tris Base | Bioshop | #TRS001 | |
| Boric acid | Bioshop | #BOR001 | |
| 0.5 M EDTA (pH 8.0) | Sigma | # E6768 | |
| DNA ladder | NEB | #N3232L | |
| 5. Plasmid isolation and Clean-up Kits | |||
| Plasmid Midi kit | Qiagen | #12143 | |
| QIAquick PCR purification kit | Qiagen | #28104 | |
| 6. PCR and Transformation Equipments | |||
| Thermal cycler | BioRad | iCycler | |
| Agarose gel electrophoresis | BioRad | ||
| Electroporator | Bio-Rad | GenePulser II | |
| 0.2 cm electroporation cuvette | Bio-Rad | ||
| 42 °C water bath shaker | Innova 3100 | ||
| Beckman Coulter TJ-25 centrifuge | Beckman Coulter | TS-5.1-500 | |
| 32 °C Shaker | New Brunswick Scientific, USA | ||
| 32 °C large Shaker | New Brunswick Scientific, USA | ||
| 32 °C plate incubator | Fisher Scientific | ||
| 7. Electrophoresis and Western blotting | |||
| Acrylamide monomer, N,N'- methylenebis-acrylamide | Bio-Rad | #161-0125 | |
| Ammonium persulfate | Bioshop | # AMP001 | |
| n-butanol | Sigma | # B7906 | |
| TEMED | Bioshop | #TEM001 | |
| Whatman No. 1 filter paper | Fischer Scientific | #09-806A | |
| Mini protean 3 cell | Bio-Rad | #165-3301 | |
| iBlot gel transfer device | Invitrogen | #IB1001 | |
| Nitrocellulose membranes | Bio-Rad | #162-0115 | |
| Monoclonal Anti-Flag M2 antibody | Sigma | #F3165 | |
| Horseradish peroxidase | Amersham | #NA931V | |
| Pre-stained protein molecular weight standards | Bio-Rad | #161-0363 | |
| Chemiluminescence reagent | PIERCE | #1856136 | |
| Autoradiography film | Clonex Corp | #CLEC810 | |
| Quick Draw blotting paper | Sigma | #P7796 | |
| C2 platform rocking shaker | New Brunswick Scientific, USA | ||
| 8. Sonication Equipment and Reagents | |||
| Sonicator | Branson Ultrasonic | #23395 | |
| NaCl | Bioshop | #SOD001 | |
| Protease inhibitors | Roche | #800-363-5887 | |
| 0.5 mM TCEP-HCl | Thermo Scientific | #20490 | |
| 9. Affinity Purification Reagents and Equipment | |||
| 0.8 x 4 cm Bio-Rad polypropylene column | Bio-Rad | #732-6008 | |
| Benzonase nuclease | Novagen | #70746 | |
| Anti-FLAG M2 agarose beads | Sigma | #A2220 | |
| Calmodulin-sepharose beads | GE Healthcare | #17-0529-01 | |
| TEV protease | Invitrogen | #12575-015 | |
| Triton X-100 | Sigma | #T9284 | |
| CaCl2 | Sigma | #C2661 | |
| EGTA | Sigma | #E3889 | |
| LabQuake Shaker | Thermolyne | #59558 | |
| 10. Silver Staining Reagents | |||
| Methanol | Bioshop | #MET302 | |
| Acetic acid | Bioshop | t#ACE222 | |
| Sodium-thiosulfate | Sigma | #S-7143 | |
| Silver nitrate | Fischer Scientific | #S181-100 | |
| Formaldehyde | Bioshop | #FOR201 | |
| Sodium carbonate | Bioshop | #SOC512 | |
| 11. Reagents and Equipment for Protein Identification | |||
| Trypsin Gold, Mass Spectrometry Grade | Promega | # V5280 | |
| 50 mM NH4HCO3 | Bioshop | #AMC555 | |
| 1 mM CaCl2 | Bioshop | #CCL302 | |
| Acetonitrile | Sigma | #A998-4 | |
| Formic acid | Sigma | #F0507 | |
| HPLC grade water | Sigma | #95304 | |
| Iodoacetamide | Sigma | #16125 | |
| Millipore Zip-Tip | Millipore | # ZTC18M960 | |
| ~10 cm of 3 μm Luna-C18 resin | Phenomenex | ||
| Proxeon nano HPLC pump | Thermo Fisher Scientific | ||
| LTQ Orbitrap Velos mass spectrometer | Thermo Fisher Scientific | ||
| 12. Labware | |||
| 4 liter conical flasks | VWR | #89000-372 | |
| 50 ml polypropylene falcon tubes | Any Vendor | ||
| 1.5 ml micro-centrifuge tubes | Any Vendor | ||
| 250 ml conical flaks | VWR | #29140-045 | |
| 15 ml sterile culture tubes | Thermo Scientific | #366052 | |
| Cryogenic vials | VWR | #479-3221 | |
| -80 °C freezer | Fisher Scientific | #13-990-14 | |
| Speed vacuum system | Thermo Scientific | ||
| Buffers and Solutions 1. 1 liter Terrific Broth (TB) media 11 g Bio-Tryptone 2. Potassium Salt Stock Solution 1.5 M K2HPO4 3. Sonication Buffer 20 mM Tris-HCl (pH 7.9) 4. AFC buffer 30 mM Tris-HCl (pH 7.9) 5. TEV cleavage buffer 30 mM Tris-HCl (pH 7.9) 6. Calmodulin binding buffer 30 mM Tris-HCl (pH 7.9) 7. Calmodulin wash buffer 30 mM Tris-HCl pH 7.9 8. Calmodulin elution buffer 30 mM Tris-HCl (pH 7.9) 9. Developing solution (1L) 37% Formaldehyde 10. Digestion buffer 50 mM NH4HCO3 11. Wetting and Equilibration solution 70% acetonitrile (ACN) in 0.1% formic acid 12. Washing solution 100% H2O in 0.1% formic acid |
|||
References
- Butland, G., et al. Interaction network containing conserved and essential protein complexes in Escherichia coli. Nature. 433, 531-537 (2005).
- Hu, P., Janga, S. C., Babu, M., Diaz-Mejia, J. J., Butland, G. Global functional atlas of Escherichia coli encompassing previously uncharacterized proteins. PLoS Biol. 7, e1000096 (2009).
- Krogan, N. J., et al. Global landscape of protein complexes in the yeast Saccharomyces cerevisiae. Nature. 440, 637-643 (2006).
- Mak, A. B., et al. A lentiviral functional proteomics approach identifies chromatin remodeling complexes important for the induction of pluripotency. Mol. Cell Proteomics. 9, 811-823 (2010).
- Polanowska, J., et al. Tandem immunoaffinity purification of protein complexes from Caenorhabditis elegans. Biotechniques. 36, 778-782 (2004).
- Veraksa, A., Bauer, A., Artavanis-Tsakonas, S. Analyzing protein complexes in Drosophila with tandem affinity purification-mass spectrometry. Dev. Dyn. 232, 827-834 (2005).
- Zeghouf, M., et al. Sequential Peptide Affinity (SPA) system for the identification of mammalian and bacterial protein complexes. J. Proteome Res. 3, 463-468 (2004).
- Puig, O., et al. The tandem affinity purification (TAP) method: a general procedure of protein complex purification. Methods. 24, 218-229 (2001).
- Rigaut, G., et al. A generic protein purification method for protein complex characterization and proteome exploration. Nat. Biotechnol. 17, 1030-1032 (1999).
- Yu, D., et al. An efficient recombination system for chromosome engineering in Escherichia coli. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 97, 5978-5983 (2000).
- Kislinger, T., et al. PRISM, a generic large scale proteomic investigation strategy for mammals. Mol. Cell Proteomics. 2, 96-106 (2003).
- Vlasblom, J., et al. GenePro: a Cytoscape plug-in for advanced visualization and analysis of interaction networks. Bioinformatics. 22, 2178-219 (2006).
- de Berardinis, V., et al. A complete collection of single-gene deletion mutants of Acinetobacter baylyi ADP1. Mol. Syst. Biol. 4, 174 (2008).
- Babu, M., et al. Sequential peptide affinity purification system for the systematic isolation and identification of protein complexes from Escherichia coli. Methods Mol. Biol. 564, 373-400 (2009).
