Summary

Protein Kompleksi belirlenmesi<em> Escherichia coli</em> Tandem Kütle Spektrometresi ile Kombine Sıralı Peptid Affinity Arıtma kullanarak

Published: November 12, 2012
doi:

Summary

Kütle spektrometrisi (antipersonel mayınları) ile kombinasyon halinde etiketli proteinlerin saflaştırılması Affinity protein etkileşimi ağların sistematik eşleme için ve biyolojik süreçlerin mekanistik temeli araştırmak için güçlü bir yöntem. Burada, bakteri için geliştirilmiş optimize edilmiş sıralı peptid afinite (SPA) antipersonel mayınları prosedürü tarif<em> Escherichia coli</em> Bile hücre başına düşük kopya sayıları başlayarak yakın homojenliği kararlı multi-protein kompleksleri izole ve karakterize etmek için kullanılan olabilir.

Abstract

Çoğu hücresel süreçler makromoleküler meclisleri, protein-protein etkileşimlerinin sistematik tanımlama (ÜFE) ve kompleksleri gen fonksiyonu içgörü sağlamak ve biyolojik sistemleri 1, 2 anlayışı artırabilir çoklu-protein alt ünitesi kompozisyon tespiti aracılık beri. Fiziksel etkileşimler kütle spektrometrisi (antipersonel mayınları) ile kombinasyon halinde kromozomal-etiketli proteinlerin afinite arıtma esas yakın fizyolojik koşullar altında endojen protein komplekslerinin yüksek güven vialarge ölçekli izolasyonu ve karakterizasyonu ile eşlenebilir. Bu yaklaşım başarılı maya, sinek, solucan, memeli hücreleri ve bakteriler 1-6 gibi evrimsel farklı organizmaların, tatbik edilmiştir. Özellikle, ge kullanılarak kültive gram-negatif Escherichia coli afinite arıtma doğal protein kompleksleri için bir karboksi-terminal Sıralı Peptid Affinity (SPA) çift etiketleme sistemi meydana getirmiştirtemel biyoloji ve prokaryotlar 1, 2, 7 korunmuş süreçlerinin genom araştırmaları için çok uygundur netically-uysal ana laboratuar suşları. Bizim SPA-etiketleme sistemi maya 8, 9 başlangıçta geliştirilen tandem afinite saflaştırma yöntemi ile benzerdir ve bir kalmodulin bağlayıcı derece özel tütün etch virüsü (TEV) proteaz için bölünme sitesinin takip peptid (CBP) ve üç nüsha oluşur benzeşim zenginleştirme üst üste iki tur için izin BAYRAK epitopu (3X BAYRAK), ve. Kaset amplifikasyon sonra, SPA-etiketi ve bir seçilebilir işaretleyici kodlayan sekans spesifik lineer PCR ürünleri entegre edilmiş ve geçici bir yüksek verimli heterolog bakteriyofaj lambda rekombinasyon sistemi 10 ifade indüklenen bir DY330 arka planda karboksi-terminal füzyon olarak çerçeve içinde ifade. Kalmodulin ve anti-FLAG afinite boncuklar kullanılarak daha sonraki iki aşamalı bir saflaştırma son derece seçici sağlayanbüyük ölçekli kültürlerden bile düşük bolluk protein komplekslerinin ve etkili kurtarma. Tandem kütle spektrometrisi sonra yüksek duyarlılık (düşük nanogram tespit limitleri) ile stabil olarak eş-temizleyici proteinleri belirlemek için kullanılır.

Burada, biz yaygın sistematik protein etiketleme, saflaştırma ve kitle E. çözünür protein komplekslerinin spektrometresi tabanlı analiz için kullanmak ayrıntılı adım adım prosedürleri tarif büyütülüyor ve potansiyel Recombineering mükellef olan belirli fırsatçı patojenler dahil olmak üzere diğer bakteri türlerinin, uygun olabilir coli. Sonuçlanan fiziksel etkileşimler genellikle ilginç beklenmeyen bileşenleri ve roman mekanistik bağlantılar düşündüren bağlantılarını ortaya çıkarabilir. Örneğin genetik (gen-gen) etkileşimleri ve tahminler iki içinde çok protein komplekslerinin küresel moleküler organizasyonun aydınlatılması kolaylaştırabilir genomik-bağlam (GC) gibi alternatif moleküler birleşme verileri ile ÜFE verileri Entegrasyonuological yollar. E. için oluşturulan ağlar coli fonksiyonel açıklamaları anda eksik olan diğer mikroplar orthologous gen ürünlerinin fonksiyonel mimarisi hakkında fikir edinmek için kullanılabilir.

Protocol

1. E. Gen özgü SPA-etiketleme İnşaatı coli DY330 Gerinim Plazmid pJL148 SPA-etiket DNA sekansı ve kanamisin antibiyotik direnç işaretleyicisi kaset (Kan R) içeren polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) amplifikasyon 7'de bir şablon olarak kullanılır. Bir 27 bp (5'-AGCTGGAGGATCCATGGAAAAGAGAAG -3 ') etiket spesifik ileri primer ile çerçeve içinde hedef gen stop kodonu arasında hemen akış yukarı yer alan bir 45 nt gen spesifik ileri primer, ve bir…

Representative Results

Once tagged bait proteins, which are expressed at endogenous levels are affinity-purified from logarithmic phase cultures the samples were run on a silver-stain gel to visualize the individual polypeptide components of the isolated stable complexes. We also subjected a second portion of the affinity-purified protein samples to gel-free tandem mass spectrometry (LCMS) to identify the corresponding polypeptide sequences. The effectiveness of this APMS procedure is shown with a representative SDS-PAGE analysis of the compon…

Discussion

Burada açıklanan SPA tabanlı antipersonel mayınları yaklaşımın önemli bir yönü olduğunu etiketleme böylece normal gen regülasyonu sağlamak korunur (yani. Yerel yem organizatörü dolayısıyla ekspresyon düzeyleri tedirgin değil, korunmuş) ve stabil ilişkili yerli olup, doğal kromozomal çerçevede yapılan olmasıdır protein kompleksleri yakın endojen düzeylerde geri kazanılır. Operon polarite konuları da seçilebilir işaretleyici bir dışa dönük organizatörü dahil önlenir. Bu …

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Bu çalışma Yenilik, Genom Kanada, Ontario Genomik Enstitüsü, İnovasyon Ontario Bakanlığı ve JG için Sağlık Araştırma hibe Kanada Enstitüleri ve AE Kırmızı-eksprese eden E. için Kanada Vakfı fonları tarafından desteklenen coli suşu DY330 Donald L. Mahkemesi (Ulusal Kanser Enstitüsü, Frederick, MD) bir tür hediye oldu.

Materials

Materials Vendor and Catalog Numbers  
      I. Antibiotics
Kanamycin Bioshop #KAN201  
Ampicillin Bioshop #AMP201  
      2. Terrific-Broth medium
Bio-Tryptone Bioshop #TRP 402  
Yeast extract Bioshop #YEX 555  
Glycerol Bioshop #GLY 002  
K2HPO4 Bioshop #PPM 302  
KH2PO4 Bioshop #PPM 303  
      3. Bacterial Strain and Plasmid
DY330   Yu et al. (2000)10  
pJL148   Zeghouf et al. (2004)7  
      4. PCR and Electrophoresis Reagents
Taq DNA polymerase Fermentas # EP0281  
10 X PCR buffer Fermentas # EP0281  
10 mM dNTPs Fermentas # EP0281  
25 mM MgCl2 Fermentas # EP0281  
Agarose Bioshop # AGA002  
Loading dye NEB #B7021S  
Ethidium bromide Bioshop # ETB444  
10X TBE buffer Thermo Scientific #28355  
Tris Base Bioshop #TRS001  
Boric acid Bioshop #BOR001  
0.5 M EDTA (pH 8.0) Sigma # E6768  
DNA ladder NEB #N3232L  
      5. Plasmid isolation and Clean-up Kits
Plasmid Midi kit Qiagen #12143  
QIAquick PCR purification kit Qiagen #28104  
      6. PCR and Transformation Equipments
Thermal cycler BioRad iCycler  
Agarose gel electrophoresis BioRad    
Electroporator Bio-Rad GenePulser II  
0.2 cm electroporation cuvette Bio-Rad    
42 °C water bath shaker   Innova 3100  
Beckman Coulter TJ-25 centrifuge Beckman Coulter TS-5.1-500  
32 °C Shaker New Brunswick Scientific, USA    
32 °C large Shaker New Brunswick Scientific, USA    
32 °C plate incubator Fisher Scientific    
      7. Electrophoresis and Western blotting
Acrylamide monomer, N,N’- methylenebis-acrylamide Bio-Rad #161-0125  
Ammonium persulfate Bioshop # AMP001  
n-butanol Sigma # B7906  
TEMED Bioshop #TEM001  
Whatman No. 1 filter paper Fischer Scientific #09-806A  
Mini protean 3 cell Bio-Rad #165-3301  
iBlot gel transfer device Invitrogen #IB1001  
Nitrocellulose membranes Bio-Rad #162-0115  
Monoclonal Anti-Flag M2 antibody Sigma #F3165  
Horseradish peroxidase Amersham #NA931V  
Pre-stained protein molecular weight standards Bio-Rad #161-0363  
Chemiluminescence reagent PIERCE #1856136  
Autoradiography film Clonex Corp #CLEC810  
Quick Draw blotting paper Sigma #P7796  
C2 platform rocking shaker New Brunswick Scientific, USA    
      8. Sonication Equipment and Reagents
Sonicator Branson Ultrasonic #23395  
NaCl Bioshop #SOD001  
Protease inhibitors Roche #800-363-5887  
0.5 mM TCEP-HCl Thermo Scientific #20490  
      9. Affinity Purification Reagents and Equipment
0.8 x 4 cm Bio-Rad polypropylene column Bio-Rad #732-6008  
Benzonase nuclease Novagen #70746  
Anti-FLAG M2 agarose beads Sigma #A2220  
Calmodulin-sepharose beads GE Healthcare #17-0529-01  
TEV protease Invitrogen #12575-015  
Triton X-100 Sigma #T9284  
CaCl2 Sigma #C2661  
EGTA Sigma #E3889  
LabQuake Shaker Thermolyne #59558  
      10. Silver Staining Reagents
Methanol Bioshop #MET302  
Acetic acid Bioshop t#ACE222  
Sodium-thiosulfate Sigma #S-7143  
Silver nitrate Fischer Scientific #S181-100  
Formaldehyde Bioshop #FOR201  
Sodium carbonate Bioshop #SOC512  
      11. Reagents and Equipment for Protein Identification
Trypsin Gold, Mass Spectrometry Grade Promega # V5280  
50 mM NH4HCO3 Bioshop #AMC555  
1 mM CaCl2 Bioshop #CCL302  
Acetonitrile Sigma #A998-4  
Formic acid Sigma #F0507  
HPLC grade water Sigma #95304  
Iodoacetamide Sigma #16125  
Millipore Zip-Tip Millipore # ZTC18M960  
~10 cm of 3 μm Luna-C18 resin Phenomenex    
Proxeon nano HPLC pump Thermo Fisher Scientific    
LTQ Orbitrap Velos mass spectrometer   Thermo Fisher Scientific  
      12. Labware
4 liter conical flasks VWR #89000-372  
50 ml polypropylene falcon tubes Any Vendor    
1.5 ml micro-centrifuge tubes Any Vendor    
250 ml conical flaks VWR #29140-045  
15 ml sterile culture tubes Thermo Scientific #366052  
Cryogenic vials VWR #479-3221  
-80 °C freezer Fisher Scientific #13-990-14  
Speed vacuum system Thermo Scientific    
     

Buffers and Solutions

1. 1 liter Terrific Broth (TB) media

11 g Bio-Tryptone
22 g Yeast Extract
2% Glycerol
50 ml potassium salt stock solution

2. Potassium Salt Stock Solution

1.5 M K2HPO4
0.35 M KH2PO4

3. Sonication Buffer

20 mM Tris-HCl (pH 7.9)
150 mM NaCl
0.2 mM EDTA
10% Glycerol
Before use add protease inhibitor (PI) and 0.1-0.5 mM TCEP

4. AFC buffer

30 mM Tris-HCl (pH 7.9)
150 mM NaCl
0.1% detergent
Before use add PI and 0.1-0.5 mM TCEP

5. TEV cleavage buffer

30 mM Tris-HCl (pH 7.9)
150 mM NaCl
0.2 mM EDTA
0.1% detergent
Before use add PI and 0.1-0.5 mM TCEP

6. Calmodulin binding buffer

30 mM Tris-HCl (pH 7.9)
150 mM NaCl
2 mM CaCl2
0.1% detergent
Before use add PI and 0.1-0.5 mM TCEP

7. Calmodulin wash buffer

30 mM Tris-HCl pH 7.9
150 mM NaCl
2 mM CaCl2
0.1-0.5 mM TCEP

8. Calmodulin elution buffer

30 mM Tris-HCl (pH 7.9)
100 mM NaCl
10 mM EGTA
0.1-0.5 mM TCEP

9. Developing solution (1L)

37% Formaldehyde
30 g sodium carbonate
1000 ml distilled water

10. Digestion buffer

50 mM NH4HCO3
1 mM CaCl2

11. Wetting and Equilibration solution

70% acetonitrile (ACN) in 0.1% formic acid

12. Washing solution

100% H2O in 0.1% formic acid

References

  1. Butland, G., et al. Interaction network containing conserved and essential protein complexes in Escherichia coli. Nature. 433, 531-537 (2005).
  2. Hu, P., Janga, S. C., Babu, M., Diaz-Mejia, J. J., Butland, G. Global functional atlas of Escherichia coli encompassing previously uncharacterized proteins. PLoS Biol. 7, e1000096 (2009).
  3. Krogan, N. J., et al. Global landscape of protein complexes in the yeast Saccharomyces cerevisiae. Nature. 440, 637-643 (2006).
  4. Mak, A. B., et al. A lentiviral functional proteomics approach identifies chromatin remodeling complexes important for the induction of pluripotency. Mol. Cell Proteomics. 9, 811-823 (2010).
  5. Polanowska, J., et al. Tandem immunoaffinity purification of protein complexes from Caenorhabditis elegans. Biotechniques. 36, 778-782 (2004).
  6. Veraksa, A., Bauer, A., Artavanis-Tsakonas, S. Analyzing protein complexes in Drosophila with tandem affinity purification-mass spectrometry. Dev. Dyn. 232, 827-834 (2005).
  7. Zeghouf, M., et al. Sequential Peptide Affinity (SPA) system for the identification of mammalian and bacterial protein complexes. J. Proteome Res. 3, 463-468 (2004).
  8. Puig, O., et al. The tandem affinity purification (TAP) method: a general procedure of protein complex purification. Methods. 24, 218-229 (2001).
  9. Rigaut, G., et al. A generic protein purification method for protein complex characterization and proteome exploration. Nat. Biotechnol. 17, 1030-1032 (1999).
  10. Yu, D., et al. An efficient recombination system for chromosome engineering in Escherichia coli. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 97, 5978-5983 (2000).
  11. Kislinger, T., et al. PRISM, a generic large scale proteomic investigation strategy for mammals. Mol. Cell Proteomics. 2, 96-106 (2003).
  12. Vlasblom, J., et al. GenePro: a Cytoscape plug-in for advanced visualization and analysis of interaction networks. Bioinformatics. 22, 2178-219 (2006).
  13. de Berardinis, V., et al. A complete collection of single-gene deletion mutants of Acinetobacter baylyi ADP1. Mol. Syst. Biol. 4, 174 (2008).
  14. Babu, M., et al. Sequential peptide affinity purification system for the systematic isolation and identification of protein complexes from Escherichia coli. Methods Mol. Biol. 564, 373-400 (2009).

Play Video

Cite This Article
Babu, M., Kagan, O., Guo, H., Greenblatt, J., Emili, A. Identification of Protein Complexes in Escherichia coli using Sequential Peptide Affinity Purification in Combination with Tandem Mass Spectrometry. J. Vis. Exp. (69), e4057, doi:10.3791/4057 (2012).

View Video