Summary
Affinitetsrensing av kodede proteiner i kombinasjon med massespektrometri (APMS) er en kraftig metode for systematisk kartlegging av protein interaksjon nettverk og for å undersøke den mekanistiske grunnlag av biologiske prosesser. Her beskriver vi en optimalisert sekvensiell peptid affinitet (SPA) APMS prosedyre utviklet for bakterien
Abstract
Siden de fleste cellulære prosesser er mediert av makromolekylære forsamlinger, systematisk identifisering av protein-protein interaksjoner (PPI) og identifikasjon av subenheten sammensetningen av multi-protein komplekser kan gi innsikt i genfunksjon og forbedre forståelsen av biologiske systemer 1, 2. Fysiske interaksjoner kan kartlegges med høy tillit vialarge-skala isolering og karakterisering av endogene protein komplekser under nær-fysiologiske forhold basert på affinitetsrensing av kromosomer-merket proteiner i kombinasjon med massespektrometri (APMS). Denne tilnærmingen har blitt brukt i evolusjonært ulike organismer, inkludert gjær, flue, mark, pattedyrceller, og bakterier 1-6. Spesielt har vi generert en karboksy-terminal Sekvensiell Peptide Affinity (SPA) dual merkesystem for affinitets-rensing innfødte protein komplekser fra dyrkede gram-negative Escherichia coli ved hjelp GEnetically-medgjørlig vert laboratoriestammer som er godt egnet for genom-wide undersøkelser av grunnleggende biologi og bevart prosesser en prokaryoter, 2, 7. Vår SPA-merkesystem er analog til den tandem affinitetsrensing metode utviklet opprinnelig for gjær 8, 9, og består av en kalmodulin bindende peptid (CBP) etterfulgt av kuttesete for svært spesifikk tobakk etch virus (TEV) protease og tre kopier av flagget epitop (3X FLAG), slik at for to påfølgende runder med affinitet berikelse. Etter kassett forsterkning, er sekvens-spesifikke lineære PCR produkter koder for SPA-kode og en selekterbar markør integrert og uttrykt i ramme som karboksy-terminale fusjoner i en DY330 bakgrunn som er indusert til forbigående uttrykke en svært effektiv heterologt bakteriofag lambda rekombinasjon systemet 10. Påfølgende dual-trinns rensing ved hjelp calmodulin og Anti-Flag affinitet perler gjør at svært selektivog effektiv utvinning av selv lave overflod protein komplekser fra store kulturer. Tandem massespektrometri blir så brukt til å identifisere stabilt co-rensende proteiner med høy følsomhet (lav nanogram deteksjonsgrenser).
Her beskriver vi detaljerte steg-for-trinn prosedyrer vi vanligvis bruker for systematisk protein tagging, rensing og massespektrometri-baserte analyser av løselig protein komplekser fra E. coli, som kan skaleres opp og potensielt tilpasset andre bakterielle arter, inkludert visse opportunistiske patogener som kan påvirkes med recombineering. De resulterende fysiske interaksjoner kan ofte avsløre interessante uventede komponenter og forbindelser som tyder nye mekanistiske lenker. Integrering av PPI data med alternative molekylære foreningen data som genetiske (gen-gen) interaksjoner og genomisk sammenhengen (GC) spådommer kan lette klarlegging av den globale molekylære organisering av multi-protein komplekser innen biological veier. Nettverkene som genereres for E. coli kan brukes til å få innsikt i den funksjonelle arkitekturen orthologous genprodukter i andre mikrober som funksjonelle merknader er for tiden mangler.
Protocol
1. Bygging av Gene-spesifikk SPA-merking i E. coli DY330 Strain
- Plasmidet pJL148 omfatter SPA-tag DNA-sekvensen og den kanamycin antibiotikaresistens markør kassett (Kan R) brukes som en mal i polymerase kjedereaksjon (PCR) amplifikasjon 7. En 45 nt gen-spesifikk forward primer, som ligger umiddelbart oppstrøms av målgenet stoppkodonet i ramme med en 27 bp (5'-AGCTGGAGGATCCATGGAAAAGAGAAG -3 ') tag spesifikk forward primer, og en 45 nt gen-spesifikk revers primer, ligger umiddelbart nedstrøms for målgenet stoppkodonet i ramme med en 27 bp (5'-GGCCCCATATGAATATCCTCCTTAGTT -3 ') tag spesifikk revers primer, blir brukt til å forsterke SPA-tag og Kan R kassett fra pJL148 med følgende PCR sykkelforholdene: 94 ° C i 5 min; 30 sykluser av 94 ° C i 1 min, 55 ° C i 1 min, 68 ° C i 2 min 10 sek, etterfulgt av 68 ° C i 10 min. Disse forsterkede sekvenser tjene ens substrater for ectopically introduserte λ-Red homolog rekombinasjon maskineri (se nedenfor).
- PCR-produktet blir renset ved hjelp av en Qiaquick PCR rensing kit for å fjerne salter som kan forstyrre electroporation. Det rensede PCR-produkt blir deretter rettet mot å integrere på 3 'enden (umiddelbart oppstrøms av de innfødte stoppkodonet) for et bestemt gen i DY330 stamme hvori λ-Red rekombinasjon maskiner uttrykkes 10.
- Den DY330 λ-Rød uttrykke tøyning dyrket over natten i 2 ml Luria-Bertani (LB) medium ved 32 ° C ved risting ved 180 rpm. 1 ml av over natten kultur blir deretter inokulert i 70 ml fersk LB medium i 500 ml konisk kolbe. Inokulatet er dyrket ved 32 ° C ved risting ved 180 rpm inntil OD 600 når ~ 0,8.
- Kulturen overføres til en frisk 250 ml erlenmeyerkolbe, der cellene er indusert ved inkubering av kolben i et vannbad ved 42 ° C ved forsiktig risting ved180 rpm i 15 min. Umiddelbart etter induksjon, blir kolben inkubert i et isvannbad oppslemming bad i minst 30 minutter med risting.
- Iskaldt kulturen blir umiddelbart overført til pre-avkjølt 50 ml polypropylenrør og underkastet sentrifugering ved 3993 xg i 6 minutter ved 4 ° C. Cellepelleten resuspenderes i 50 ml is-kaldt sterilt vann og sentrifugert igjen ved 3993 xg i 6 minutter ved 4 ° C. Cellepelleten blir deretter resuspendert i 1 ml kaldt vann og overføres til et 1,5 ml Effendorf rør og sentrifugert ved maksimal hastighet i 20 sek ved 4 ° C. Etter to eller tre vasketrinnene med iskaldt vann, blir cellepelleten resuspendert til slutt i 700 pl iskald sterilt vann, som resulterer i elektro-kompetente celler.
- Gjennom elektroporering blir en ul av det rensede fragment innført i 40 pl av den elektro-kompetente celler. Cellene er electroporated i en Bio-Rad GenePulser II med følgende innstillinger: 2,5 kV, 25 mF med pulskontrolleren på 200 Ω. Etter homolog rekombinasjon og integrasjon, blir transformantene som vellykket rekombinert merkelappen / kassetten inn i kromosomet valgt basert på motstand i Kan (figur 1A). Flere transformanter er valgt for Western blotting å verifisere korrekt generasjon (dvs. positivt signal) av SPA-merkede fusjonsproteiner med Anti-Flag M2 antistoff som er selektiv mot flagget epitoper av SPA-tag.
- Bekreftet karboksy terminal SPA-tag fusion belastning er dyrket i stor skala for å isolere løselig protein komplekser fra høstet celler ved hjelp av SPA rensing protokollen. Omrisset av trinnene involvert i affinitet taggen rensing prosedyren er vist i figur 1B.
2. Dyrking og Sonikering
- Vaksinere 100 ul av en SPA-merket E. coli glyserol lager i 50 ml kjempefint buljong (TB) flytende medium supplert med 50 ul av 25 ug / ml of Kan løsning i en 250 ml erlenmeyerkolbe. Grow kulturen natten ved 32 ° C.
Merk: Siden temperatur-induserbar λ Rød kassett i stamme DY330 er under kontroll av en temperaturfølsom repressor 10 er SPA-tagget E. coli-stamme dyrket ved 32 ° C. - Overfør 10 ml av over natten kultur inn 990 ml fersk TB supplert med 25 ug / ml over Kan i en 4 liters kolbe. Kulturen dyrkes ved 32 ° C med konstant risting ved 250 rpm, for 5 til 6 timer, inntil OD 600 når til ~ 2-3.
- Overfør 1 liter E. coli SPA-tag kultur å rengjøre sentrifugeringstider flasker og spinne cellene ved 4 ° C i Beckman J6-HC sentrifugen @ 3993 xg i 15 min.
- Supernatanten fjernes fra sentrifugeringen flasker. Resuspender E. coli celle pellets med 25 ml sonikering buffer. Sørge for å holde flasker på sentrifugeringstider isen til alle tider.
- Den resuspenderte pellet eroverført til 50 ml polypropylen Falcon rør og frosset ved bruk av flytende nitrogen. De frosne celler lagret ved -80 ° C for langvarig bruk.
- Før sonikering, tine de frosne celler helt ved å holde pellets på is. De tinte prøver overført til en steril rustfri stål cup anbragt på is for sonikering. Sonden er neddykket inn i prøven og sonikert i 3 min. En ytterligere 2 min fikk avkjøles prøven fra overoppheting.
- Den sonikert cellelysat blir overført til den pre-kjølt sterilt sentrifugering tube, og underkastet sentrifugering ved 4 ° C i Beckman sentrifuge ved hjelp av en JA-17 rotor @ 35267 xg (16000 rpm) i 15 minutter to ganger.
Merk: I tilfelle av membran proteinrensing blir sonikert cellelysat sentrifugert bare én gang i 15 minutter, fordi vi ikke vet hvor fraksjon membran proteiner er, er at enten i pellet eller i supernatanten fraksjonen. Så for å unngå overflødig tap av memBrane proteiner, spinne vi cellene i 15 minutter ved høy hastighet sentrifugering og supernatanten deretter bearbeides for rensing (se trinnene nedenfor) hvor 1% vaskemiddel brukes for å oppløse membran proteiner. - Supernatanten fra sentrifugeringen Tuben er forsiktig overført til et 50 ml polypropylen Falcon rør og frosset ved bruk av flytende nitrogen. Den sonikert frosne celleekstrakt er lagret for en periode på høyst 6 måneder ved -80 ° C for fremtidig bruk.
3. Affinitetsrensing
- Før bruk blir 100 ul av anti-Flag M2 perler vasket av 10 volumer AFC buffer (30 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, 0,1% vaskemiddel, og 0,1-0,5 mm TCEP [tris (2-karboksyetyl) fosfin - saltsyre]) uten vaskemiddel og reduksjonsmidlet TCEP (tris (2-karboksyetyl) fosfin).
- Den frosne, sonikert celleekstrakt tines ved å plassere røret i kaldt vann. Den tinte celleekstrakt inkuberes med 3 pl av benzonase nuklease i 30 min ved 4 ° C. Til denne blanding, til ikke-ionisk detergent Triton X-100 (sluttkonsentrasjon av vaskemiddelet bør være 0,1%) og 200 ul suspensjoner av anti-Flag M2 agarosekuler.
Merk: For alle oppløselige protein renselser, 0,1% Triton X-100 blir brukt til å minimalisere ikke-spesifikk adsorpsjon, der som for rensing av et membranprotein, forskjellige milde ikke-ioniske vaskemidler, f.eks C12E8 (Octaethylene glycol dodecyl eter), DDM ( N-dodecyl-D-β maltoside) og maltose-neopentylglykol (MNG) kan brukes på en 1% vaskemiddelkonsentrasjonen å forbedre solubilisering. Siden forskjellige vaskemidler har varierende solubilisering effektiviteten av membran proteiner, er det anbefalt å utføre uavhengige protein renselser bruker mer enn ett vaskemiddel. - Innholdet blir forsiktig blandet ved å rotere røret i 3 timer ved 4 ° C ved hjelp av en LabQuake shaker. Etter 3 hr av rotasjon, er røret sentrifugert ved 1700 xg i 6 min. Supernatanten er deretter removed nøye, så mye som mulig, uten å forstyrre den løse vulsten pelleten.
- Pelleten resuspenderes i den gjenværende supernatant og deretter overført inn i en 0,8 x 4 cm Bio-Rad polypropylen prep kolonne. Sørge for å fjerne de bunnutløp stikkontaktene på kolonnen, tillate den eluatene renne etter gravitasjonsstrømning. Vask kolonnen 5 ganger med TEV cleavage trinn.
- Etter drenering av vaskede eluatene blir bunnutløp av kolonnen lukket. Til samme kolonne, spalting utføres ved tilsetning av ~ 5-10 pl (50 enheter) av TEV protease og 400 pl 1X AFC buffer på kolonnen. Sørge for å lukke toppen av kolonnen med en hette. Kolonnen inneholdende perlene roteres forsiktig over natten ved 4 ° C over natten ved hjelp av en LabQuake shaker.
- Ta av lokket på toppen og utløp plugg på bunnen av kolonnen, og tøm eluatene utvinnes etter TEV spalting til en frisk kolonne inneholdende 200 ul suspensjoner av kalmodulin-Sepharose-kuler, som er vasket med 10volumer av calmodulin bindingsbuffer.
- Både toppen og bunnen av kolonnen er festet tett, og innholdet i kolonnen blandes forsiktig ved å rotere i 3 timer ved 4 ° C ved hjelp av en LabQuake shaker.
- Etter 3 hr av rotasjon, blir eluatet drenert ved å fjerne topplokket og bunnpluggen i kolonnen. Kolonnen vaskes fire ganger med 200 ul 1X kalmodulin bindingsbuffer etterfulgt av en strenge vask med 400 pl kalmodulin vaskebuffer.
- Den bundne protein elueres i fire fraksjoner av 50 ul i en frisk Eppendorf tube med 1X calmodulin elueringsbuffer. Den eluerte fraksjon er fordelt i to rene Eppendorf-rør i samme volum. Begge rørene er deretter tørket ved hjelp av en høyhastighets vakuum.
- Det tørkede eluat fra en rør brukes for å kjøre en sølv flekker gel, mens den andre er lagret i -80 ° C, før bruk massespektrometri.
4. Sølv Farging
- For sølv staining, er halvparten av volumet av 3X SDS (natriumdodecylsulfat) prøvebuffer tilsatt til 50 ul av den tørkede eluatet. Etter koking av blandingen i 5 min, er prøvene lastet opp på en SDS polyakrylamidgel.
- Etter at gelen er ferdig, er den nøye plassert inn festeskrue oppløsning (50% metanol og 10% eddiksyre) og agitert forsiktig på en rotasjonsrister i 20 min. Gelen blir deretter skylt i 20% etanol i 10 min.
- Den faste gel blir vasket to ganger grundig med 500 ml dobbelt destillert vann i 10 min for å sikre lav ensartet bakgrunn.
- Gelen blir deretter agitert forsiktig i 500 ml natrium-tiosulfat i 1 min, etterfulgt av to vasketrinnene med destillert vann for 20 sek.
- Vannet kastes, og gelen inkuberes i 200 ml 0,1% sølvnitrat i 30 min. Etter den tid, er sølvnitrat fjernet og gelen ble vasket med destillert vann for 20 sek for å fjerne det overskytende sølvnitrat.
- Gelen er endelig hånd agiteres i 75 mli utviklingsland løsning. Når den ønskede intensiteten er oppnådd, blir den tredje løsningen kastes og 80 ml eddiksyre tilsettes for å stoppe reaksjonen. Sørge for å inkubere gelen i eddiksyre i et minimum av 20 minutter for riktig visualisering av gel band.
5. Proteolyse og Prøvepreparering for massespektrometri
- Til den tørkede prøven, tilsett 50 pl av fordøyelsen buffer og 0,9 pl av 100 mM TCEP-HCl (tris (2-karboksyetyl) fosfin - saltsyre) og inkuber blandingen i 45 minutter ved romtemperatur for reduksjonen trinn. Deretter ble 1 ul 500 mM jodacetamid tilsatt og inkubert i mørke i 40 minutter for å tillate prøven alkylering.
- Etter den andre runden av inkubering, tilsett 1 ug av immobilisert trypsin til blandingen og inkuber ved 37 ° C i 5 timer eller over natten ved romtemperatur. Sørge for å stoppe reaksjonen ved tilsetning av 1 ul eddiksyre.
- Pre-våt Millipore Zip-Tip pipettespiss ved å aspirere 10 pl tisse og likevekt løsning. Tilsett løsningen til avfall. Senere Aspirer 10 ul av vaskevannet og dispensere løsningen til avfall. Gjenta dette trinnet to ganger.
- For effektiv binding av peptidblandingen til spissen, bland pipette peptidet blandingen 20 ganger. Den peptidblanding som overholdt spissen er vasket av ved å aspirere og dispensering vaskevannet. Gjenta denne fremgangsmåten to ganger for effektiv binding av peptidblandingen til spissen.
- Med spissen inneholdende den bundne peptidet, aspireres 10 pl av den fukting og ekvilibrering løsning, og dispensere inn i en ren Eppendorf rør. Gjenta dette trinnet to ganger. Etter tørking av de eluerte prøvene i hastighet vakuum, kan prøvene analyseres umiddelbart ved massespektrometri eller lagret ved -80 ° C før bruk.
6. Protein Identifikasjon av LTQ Orbitrap Velos Mass Spectrometer
The polypeptid komponenter de isolerte komplekser identifiseres ved hjelp av en LTQ Orbitrap Velos hybrid tandem massespektrometer. Den Orbitrap har eksepsjonell oppløsningsevne (> 60 000 Full Bredde Half Maximum, eller FWHM) og masse nøyaktighet (<2 ppm) som minimerer MS / MS prøvetaking av irrelevante uspesifikke bakgrunn miljøgifter påvist i kontroll renselser, mens den høye hastigheten Velos ion felle komponent kan oppdage og fragment lave overflod peptider ved hjelp av både elektron overføring dissosiasjon og kollisjon-indusert dissosiasjon moduser. Høy tillit samsvar blant resulterer MS / MS spektra er tilordnet referanse E. coli proteinsekvenser bruke databasen søkealgoritme som Sequest og hver matchende sekvens evalueres under en sannsynlighet algoritme som STATQUEST 11. Det totale spektra nummer, peptidsekvens særpreg og felles bakgrunn miljøgifter påvist i negativ kontroll (ie. Mock) renselser anses å oppnå en lav empirisk falske disgjenopprettingsverktøy rate. Følgende trinn utføres for protein identifikasjon:
- Mikro-kolonnene er fullpakket med ~ 10 cm på 3 mikrometer Luna-C 18 harpiks og er koplet til en Proxeon nanoelectrospray ion kilde som er plassert i tråd med Orbitrap instrument.
- En Proxeon nano flyt binær HPLC pumpen brukes til å levere en stabil spiss strømningshastighet av ~ 300 nl min -1 under peptid separasjoner.
- For å oppnå eluering peptid, er en organisk buffer gradient satt opp i henhold til prøven kompleksitet. For eksempel blir følgende gradient vanligvis satt opp for E. coli SPA prøver: løsemiddel B er økt fra 2% til 6% i 1 min, til 24% i 38 min, til 100% i neste 4 min, holdt på 100% i 1 min, deretter reduseres til 2% i 1 min, og endelig hold på 2% i 15 min. Den mobile fase oppløsningsmiddel A har 95% HPLC-gradienten vann og 5% ACN med 0,1% maursyre, mens oppløsningsmiddel B har 5% HPLC gradient vann og 95% ACN med 0,1% maursyre ACId.. Strømningshastigheten på tuppen av nålen er satt til 300 nl min -1 i 60 min.
- Som massespektrometer sykluser kjøre gjennom en hel masse scan på 60.000 oppløsninger, er 10 samtidig tandem fragmentering masse skanner samlet for de mest intense forløperen ioner. Dynamisk uttrekk, monoisotopic masse utvalg, og sanntids data-avhengige oppkjøpet instrument er aktivert.
- Spektrene søkes ved hjelp av en database søkealgoritme som Sequest mot en database av E. coli proteinsekvenser, og resultatet er statistisk filtrert ved hjelp av en sannsynlighet algoritme som STAQUEST 11 for å sikre en lav falsk funnrate. Bare høy tillit (99% sannsynlighet) kandidater er valgt, mens kampene viser mer enn 10 ppm masse feil i forhold til den teoretiske peptid massen er eliminert fra videre vurdering.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
En sentral del av SPA-baserte APMS tilnærming beskrevet her er at merking er utført innenfor den naturlige kromosomal sammenheng, og dermed sikre normal genregulering opprettholdes (ie. Innfødt agn promoter bevart, derav uttrykket nivåene ikke er opprørt) og innfødte stabilt-assosiert protein komplekser blir gjenvunnet på nær endogene nivåer. Operon polaritet problemer er også unngås ved å inkludere en utovervendte promoter i valgbar markør. SPA-merking tilnærmingen er effektivt nok til å rense komponenter lav overflod komplekser til nærheten homogenitet, inkludert membran-assosiert sammenstillinger selv om subenheter er uttrykt ned til bare noen få molekyler per bakteriecelle. Samlet kan denne protokollen enkelt skaleres opp for rensing stor-sett med kodede løselig protein i E. coli eller i prinsippet alle andre bakteriearter som tagging via recombineering er mulig, eller de som besitter naturlig høyt forvandlingsjon evne, som Acinetobacter, en ny arbeidshest av bakterielle genetikk, som har vært brukt, for eksempel, for å bygge en stamme bibliotek av målrettede genet knockouts 13.
En stor bekymring iboende til store proteomikk tilnærminger er identifisering av promiskuøse uspesifikke interactors og falsk spor forurensning. Til tross for to runder med anrikning, våre rutinemessige SPA renselser regelmessig oppdage hyppige forurensninger som vanligvis høy-overflod housekeeping proteiner, slik som proteiner og ribosomale anstand, som binder ikke-spesifikt til den kromatografiske harpiks og / eller agn proteiner. Dette problemet kan reduseres på to måter. Først, er det totale spektral antall og unikt for hver protein identifiseres med en bestemt agn vurderes i forhold til et bredere sett av renselser av flere urelaterte protein baits og fra ukodet (ie. Villtype) negative kontrollstammer (ie. Mock affinitetsrensing kompetanseiments) for å minimere falske positive assosiasjoner. Sekund, bør alle kandidater protein interaksjoner bli validert ved hjelp gjensidig merking og rensing av den antatte bindende partner, med mål om uavhengig bekrefter individuelle protein-protein interaksjoner for å unngå sjeldne tilfeller der nærvær av SPA-tag perturbs inkorporering av innfødte proteiner til endogene protein forsamlingen.
APMS-baserte proteomikk undersøkelser er begrenset av mangel på sensitivitet i forhold identifisere forbigående eller sub-støkiometriske interaksjoner. I slike tilfeller kan single-trinns rensing prosedyrer brukes til å forbedre oppdagelse av svakere interaksjon partnere. I løpet av vår pågående, tiår lang studie av E. coli interactome har vi sett gjenkjenning evner av ny generasjon massespektrometre bedre jevnt og trutt. Eldre instrumentering er forspent til tilbakevendende identifisering av svært rikelig proteiner, ofte utelukker deteksjon av mindre abundant men potensielt svært viktig samspill proteiner. Omvendt, Velos den Orbitrap hybrid massespektrometer vi i dag bruker har blitt kraftig forbedret oppløsning, masse nøyaktighet og følsomhet og dermed gir langt mer effektiv, høy gjennomstrømning påvisning av lave overflod proteiner, inkludert forbigående interaksjoner. Til slutt, hvis arten av samspillet er helt ukjent vi foreslår forskerne å: (i) gjelder strenge kriterier for å tildele tillit score til alle antatte database søk kamper. Proteiner med to eller flere unike peptider er vanligvis betraktet positiv, forutsatt hver kamp passerer med et minimum sannsynligheten terskel cut-off på 99% eller større sannsynlighet, (ii) sørge for å undersøke spesifisiteten av kandidat protein interactors fart med den merkede agn i sammenligning til resultater oppnådd med negative kontrollprøver ukodede stammer (mock eksperimenter) eller urelaterte protein baits, (iii) gjensidig bekrefte potensielle interaksjoner inneholdende et ukjent protein av interest ved å opprette tilsvarende SPA tag agn fusion for storskala rensing eller validere pair-messig interaksjoner ved hjelp av tradisjonell co-immunoutfelling med protein bestemt eller tag spesifikke antistoffer.
Til dags dato, ved hjelp av denne systematiske tilnærmingen, har vi klart å merke og rense rundt to tredjedeler av ~ 2750 E. coli oppløselige proteiner som påviselig uttrykt i henhold kultur i rikt medium 1, 2. Vi har også tilpasset denne samme grunnleggende metode til systematisk isolere membran-assosierte protein komplekser, og forsøker nå å rense hver av de resterende ~ 1000 E. coli proteiner spådd å være membran bundet. Mens rensing av membran proteiner ofte utgjør unike utfordringer fordi de ofte ikke effektivt oppløseliggjøres ved utvinning buffer som vi vanligvis bruker for SPA metoden muliggjør tilsetning av ikke-ioniske vaskemidler for våre buffere solubilisering og rensing av et flertall av E. coli </ Em> membran proteiner vi har forsøkt å date (Babu et al. Upubliserte data).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Ingen interessekonflikter erklært.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av midler fra den kanadiske Foundation for Innovation, Genome Canada, Ontario Genomics Institute, Ontario Ministry of Innovation, og den kanadiske Institutes of Health Research tilskudd til JG og AE The Red-uttrykke E. coli stamme DY330 var en slags gave fra Donald L. Court (National Cancer Institute, Frederick, MD).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| I. Antibiotics | |||
| Kanamycin | Bioshop | #KAN201 | |
| Ampicillin | Bioshop | #AMP201 | |
| 2. Terrific-Broth medium | |||
| Bio-Tryptone | Bioshop | #TRP 402 | |
| Yeast extract | Bioshop | #YEX 555 | |
| Glycerol | Bioshop | #GLY 002 | |
| K2HPO4 | Bioshop | #PPM 302 | |
| KH2PO4 | Bioshop | #PPM 303 | |
| 3. Bacterial Strain and Plasmid | |||
| DY330 | Yu et al. (2000)10 | ||
| pJL148 | Zeghouf et al. (2004)7 | ||
| 4. PCR and Electrophoresis Reagents | |||
| Taq DNA polymerase | Fermentas | # EP0281 | |
| 10 X PCR buffer | Fermentas | # EP0281 | |
| 10 mM dNTPs | Fermentas | # EP0281 | |
| 25 mM MgCl2 | Fermentas | # EP0281 | |
| Agarose | Bioshop | # AGA002 | |
| Loading dye | NEB | #B7021S | |
| Ethidium bromide | Bioshop | # ETB444 | |
| 10X TBE buffer | Thermo Scientific | #28355 | |
| Tris Base | Bioshop | #TRS001 | |
| Boric acid | Bioshop | #BOR001 | |
| 0.5 M EDTA (pH 8.0) | Sigma | # E6768 | |
| DNA ladder | NEB | #N3232L | |
| 5. Plasmid isolation and Clean-up Kits | |||
| Plasmid Midi kit | Qiagen | #12143 | |
| QIAquick PCR purification kit | Qiagen | #28104 | |
| 6. PCR and Transformation Equipments | |||
| Thermal cycler | BioRad | iCycler | |
| Agarose gel electrophoresis | BioRad | ||
| Electroporator | Bio-Rad | GenePulser II | |
| 0.2 cm electroporation cuvette | Bio-Rad | ||
| 42 °C water bath shaker | Innova 3100 | ||
| Beckman Coulter TJ-25 centrifuge | Beckman Coulter | TS-5.1-500 | |
| 32 °C Shaker | New Brunswick Scientific, USA | ||
| 32 °C large Shaker | New Brunswick Scientific, USA | ||
| 32 °C plate incubator | Fisher Scientific | ||
| 7. Electrophoresis and Western blotting | |||
| Acrylamide monomer, N,N'- methylenebis-acrylamide | Bio-Rad | #161-0125 | |
| Ammonium persulfate | Bioshop | # AMP001 | |
| n-butanol | Sigma | # B7906 | |
| TEMED | Bioshop | #TEM001 | |
| Whatman No. 1 filter paper | Fischer Scientific | #09-806A | |
| Mini protean 3 cell | Bio-Rad | #165-3301 | |
| iBlot gel transfer device | Invitrogen | #IB1001 | |
| Nitrocellulose membranes | Bio-Rad | #162-0115 | |
| Monoclonal Anti-Flag M2 antibody | Sigma | #F3165 | |
| Horseradish peroxidase | Amersham | #NA931V | |
| Pre-stained protein molecular weight standards | Bio-Rad | #161-0363 | |
| Chemiluminescence reagent | PIERCE | #1856136 | |
| Autoradiography film | Clonex Corp | #CLEC810 | |
| Quick Draw blotting paper | Sigma | #P7796 | |
| C2 platform rocking shaker | New Brunswick Scientific, USA | ||
| 8. Sonication Equipment and Reagents | |||
| Sonicator | Branson Ultrasonic | #23395 | |
| NaCl | Bioshop | #SOD001 | |
| Protease inhibitors | Roche | #800-363-5887 | |
| 0.5 mM TCEP-HCl | Thermo Scientific | #20490 | |
| 9. Affinity Purification Reagents and Equipment | |||
| 0.8 x 4 cm Bio-Rad polypropylene column | Bio-Rad | #732-6008 | |
| Benzonase nuclease | Novagen | #70746 | |
| Anti-FLAG M2 agarose beads | Sigma | #A2220 | |
| Calmodulin-sepharose beads | GE Healthcare | #17-0529-01 | |
| TEV protease | Invitrogen | #12575-015 | |
| Triton X-100 | Sigma | #T9284 | |
| CaCl2 | Sigma | #C2661 | |
| EGTA | Sigma | #E3889 | |
| LabQuake Shaker | Thermolyne | #59558 | |
| 10. Silver Staining Reagents | |||
| Methanol | Bioshop | #MET302 | |
| Acetic acid | Bioshop | t#ACE222 | |
| Sodium-thiosulfate | Sigma | #S-7143 | |
| Silver nitrate | Fischer Scientific | #S181-100 | |
| Formaldehyde | Bioshop | #FOR201 | |
| Sodium carbonate | Bioshop | #SOC512 | |
| 11. Reagents and Equipment for Protein Identification | |||
| Trypsin Gold, Mass Spectrometry Grade | Promega | # V5280 | |
| 50 mM NH4HCO3 | Bioshop | #AMC555 | |
| 1 mM CaCl2 | Bioshop | #CCL302 | |
| Acetonitrile | Sigma | #A998-4 | |
| Formic acid | Sigma | #F0507 | |
| HPLC grade water | Sigma | #95304 | |
| Iodoacetamide | Sigma | #16125 | |
| Millipore Zip-Tip | Millipore | # ZTC18M960 | |
| ~10 cm of 3 μm Luna-C18 resin | Phenomenex | ||
| Proxeon nano HPLC pump | Thermo Fisher Scientific | ||
| LTQ Orbitrap Velos mass spectrometer | Thermo Fisher Scientific | ||
| 12. Labware | |||
| 4 liter conical flasks | VWR | #89000-372 | |
| 50 ml polypropylene falcon tubes | Any Vendor | ||
| 1.5 ml micro-centrifuge tubes | Any Vendor | ||
| 250 ml conical flaks | VWR | #29140-045 | |
| 15 ml sterile culture tubes | Thermo Scientific | #366052 | |
| Cryogenic vials | VWR | #479-3221 | |
| -80 °C freezer | Fisher Scientific | #13-990-14 | |
| Speed vacuum system | Thermo Scientific | ||
| Buffers and Solutions 1. 1 liter Terrific Broth (TB) media 11 g Bio-Tryptone 2. Potassium Salt Stock Solution 1.5 M K2HPO4 3. Sonication Buffer 20 mM Tris-HCl (pH 7.9) 4. AFC buffer 30 mM Tris-HCl (pH 7.9) 5. TEV cleavage buffer 30 mM Tris-HCl (pH 7.9) 6. Calmodulin binding buffer 30 mM Tris-HCl (pH 7.9) 7. Calmodulin wash buffer 30 mM Tris-HCl pH 7.9 8. Calmodulin elution buffer 30 mM Tris-HCl (pH 7.9) 9. Developing solution (1L) 37% Formaldehyde 10. Digestion buffer 50 mM NH4HCO3 11. Wetting and Equilibration solution 70% acetonitrile (ACN) in 0.1% formic acid 12. Washing solution 100% H2O in 0.1% formic acid |
|||
References
- Butland, G., et al. Interaction network containing conserved and essential protein complexes in Escherichia coli. Nature. 433, 531-537 (2005).
- Hu, P., Janga, S. C., Babu, M., Diaz-Mejia, J. J., Butland, G. Global functional atlas of Escherichia coli encompassing previously uncharacterized proteins. PLoS Biol. 7, e1000096 (2009).
- Krogan, N. J., et al. Global landscape of protein complexes in the yeast Saccharomyces cerevisiae. Nature. 440, 637-643 (2006).
- Mak, A. B., et al. A lentiviral functional proteomics approach identifies chromatin remodeling complexes important for the induction of pluripotency. Mol. Cell Proteomics. 9, 811-823 (2010).
- Polanowska, J., et al. Tandem immunoaffinity purification of protein complexes from Caenorhabditis elegans. Biotechniques. 36, 778-782 (2004).
- Veraksa, A., Bauer, A., Artavanis-Tsakonas, S. Analyzing protein complexes in Drosophila with tandem affinity purification-mass spectrometry. Dev. Dyn. 232, 827-834 (2005).
- Zeghouf, M., et al. Sequential Peptide Affinity (SPA) system for the identification of mammalian and bacterial protein complexes. J. Proteome Res. 3, 463-468 (2004).
- Puig, O., et al. The tandem affinity purification (TAP) method: a general procedure of protein complex purification. Methods. 24, 218-229 (2001).
- Rigaut, G., et al. A generic protein purification method for protein complex characterization and proteome exploration. Nat. Biotechnol. 17, 1030-1032 (1999).
- Yu, D., et al. An efficient recombination system for chromosome engineering in Escherichia coli. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 97, 5978-5983 (2000).
- Kislinger, T., et al. PRISM, a generic large scale proteomic investigation strategy for mammals. Mol. Cell Proteomics. 2, 96-106 (2003).
- Vlasblom, J., et al. GenePro: a Cytoscape plug-in for advanced visualization and analysis of interaction networks. Bioinformatics. 22, 2178-219 (2006).
- de Berardinis, V., et al. A complete collection of single-gene deletion mutants of Acinetobacter baylyi ADP1. Mol. Syst. Biol. 4, 174 (2008).
- Babu, M., et al. Sequential peptide affinity purification system for the systematic isolation and identification of protein complexes from Escherichia coli. Methods Mol. Biol. 564, 373-400 (2009).
