Summary
Affinitetsoprensning af mærkede proteiner i kombination med massespektrometri (APMS) er en kraftig fremgangsmåde til systematisk kortlægning af protein-interaktion net og til undersøgelse af den mekanistiske basis af biologiske processer. Her beskriver vi en optimeret sekventiel peptid affinitet (SPA) APMS fremgangsmåde udviklet til bakterien
Abstract
Da de fleste cellulære processer er medieret af makromolekylære forsamlinger, den systematiske identifikation af protein-protein interaktioner (PPI) og identifikation af subunit sammensætning af multi-protein komplekser kan give indblik i genfunktion og øge forståelsen af biologiske systemer 1, 2. Fysiske interaktioner kan kortlægges med stor sikkerhed vialarge omfattende isolering og karakterisering af endogene protein-komplekser under næsten fysiologiske betingelser baseret på affinitetsoprensning af kromosomalt-mærkede proteiner i kombination med massespektrometri (APMS). Denne strategi er blevet anvendt med succes i evolutionært forskellige organismer, herunder gær, fluer, orme, pattedyrceller og bakterier 1-6. Især har vi skabt en carboxyterminal sekventiel Peptide Affinity (SPA) to tagging system til affinitets-oprensning af native protein-komplekser fra dyrkede gramnegative Escherichia coli ved hjælp af genetically-medgørlig vært laboratoriestammer, der er velegnet til genom-dækkende undersøgelser af den grundlæggende biologi og bevarede processer prokaryoter 1, 2, 7. Vores SPA-mærkningssystem er analog med tandem affinitetsoprensning fremgangsmåde oprindeligt udviklet til gær 8, 9, og består af en calmodulin-bindende peptid (CBP) efterfulgt af spaltningsstedet for den meget specifikke Tobacco Etch Virus (TEV) protease og tre kopier af FLAG-epitopen (3X FLAG), der giver mulighed for to på hinanden følgende runder af affinitetsberigelse. Efter kassette amplifikation, er sekvensspecifikke lineære PCR-produkter koder for SPA-tag og en selekterbar markør integreret og udtrykt i rammen som carboxyterminale fusioner i en DY330 baggrunden, som induceres til transient udtrykker en meget effektiv heterolog bakteriofag lambda rekombination system 10. Efterfølgende to-trins oprensning under anvendelse af calmodulin og anti-FLAG-affinitetsperler muliggør meget selektiveog effektiv inddrivelse af selv lav hyppighed proteinkomplekser fra store kulturer. Tandem-massespektrometri anvendes derefter til at identificere de stabilt co-oprensning af proteiner med høj følsomhed (lavt nanogram detektionsgrænser).
Her beskriver vi detaljerede trin-for-trin procedurer, vi almindeligvis bruger til systematisk protein tagging, oprensning og massespektrometri-baseret analyse af opløselige proteinkomplekser fra E. coli, hvilket kan skaleres op og potentielt tilpasset andre bakteriearter, herunder visse opportunistiske patogener, der er modtagelige for recombineering. De resulterende fysiske interaktioner kan ofte afsløre interessante uventede komponenter og forbindelser tyder nye mekanistiske links. Integration af PPI data med alternative molekylære forening data såsom genetiske (gen-gen) interaktioner og genomisk-sammenhæng (GC) forudsigelser kan lette opklaringen af den globale molekylære organisation af multi-protein-komplekser i bigiske pathways. De netværk genereret for E. coli kan anvendes til at opnå indsigt i den funktionelle arkitektur ortologe genprodukter i andre mikrober, for hvilke funktionelle annotationer i øjeblikket mangler.
Protocol
1. Konstruktion af Gene-specifik SPA-tagging i E. coli DY330 Strain
- Plasmidet pJL148 der omfatter SPA-tag DNA-sekvensen og kanamycin antibiotikumresistensmarkør kassette (kanR) anvendes som template i polymerasekædereaktion (PCR)-amplifikation 7. En 45 nt genspecifikke forward primer, som er placeret umiddelbart opstrøms for målgenet stopcodon i ramme med en 27 bp (5'-AGCTGGAGGATCCATGGAAAAGAGAAG -3 ') tag specifik fremadrettet primer og en 45 nt gen-specifik revers primer, placeret umiddelbart nedstrøms for målgenet stopcodon i ramme med en 27 bp (5'-GGCCCCATATGAATATCCTCCTTAGTT -3 ') tag specifik revers primer, der anvendes til at amplificere SPA-tag og Kan R kassetten fra pJL148 anvendelse af følgende PCR-cyklusbetingelser: 94 ° C i 5 minutter, 30 cykler ved 94 ° C i 1 min, 55 ° C i 1 min, 68 ° C i 2 minutter 10 sekunder, efterfulgt af 68 ° C i 10 minutter. Disse amplificerede sekvenser tjene ens substrater for ektopisk indført λ-Red homolog rekombination maskiner (se nedenfor).
- PCR-produktet oprenses ved anvendelse af en QIAquick PCR Purification Kit til fjernelse af salte, der kan interferere med elektroporering. Det oprensede PCR produkt derefter rettet til at integrere i 3'-enden (umiddelbart opstrøms for det native stopkodon) af et specifikt gen i DY330 stammen, i hvilken λ-Red rekombination maskiner udtrykkes 10.
- Den DY330 λ-Red udtrykker stamme dyrkes natten over i 2 ml Luria-Bertani (LB) medium ved 32 ° C ved omrystning ved 180 rpm. 1 ml af overnatskulturen efterfølgende inokuleret i 70 ml frisk LB-medium i 500 ml konisk kolbe. Inokulum dyrkes ved 32 ° C ved omrystning ved 180 rpm, indtil OD600 når ~ 0.8.
- Kulturen overføres til en frisk 250 ml konisk kolbe, hvor cellerne induceres ved at inkubere kolben i et vandbad ved 42 ° C ved forsigtig omrystning ved180 rpm i 15 min. Umiddelbart efter induktionen fyldes kolben inkuberes i et is vandopslæmning badet i mindst 30 minutter under omrystning.
- Den iskolde kultur øjeblikkeligt placeres i præ-kølet 50 ml polypropylenrør og underkastet centrifugering ved 3993 x g i 6 min ved 4 ° C. Cellepelleten resuspenderes i 50 ml iskoldt sterilt vand og centrifugeres igen ved 3.993 x g i 6 min ved 4 ° C. Cellepelleten resuspenderes derefter i 1 ml koldt vand og overført til et 1,5 ml Effendorf rør og centrifugeret ved maksimal hastighed i 20 sekunder ved 4 ° C. Efter to eller tre vasketrin med iskoldt vand, er cellepelleten resuspenderes endeligt i 700 pi af iskoldt sterilt vand, hvilket resulterer i elektro-kompetente celler.
- Ved elektroporering er den ene ul af det oprensede amplikon indføres i 40 pi af elektro-kompetente celler. Cellerne elektroporeret i en Bio-Rad GenePulser II med de følgende indstillinger: 2,5 kV, 25 uF med pulscontroller på 200 Ω. Efter homolog rekombination og integration, er transformanterne, der med held rekombineret mærket / kassetten i kromosomet vælges på grundlag af resistens over for Kan (figur 1A). Flere transformanter selekteres for Western blotting for at verificere den korrekte generation (dvs. positivt signal) af SPA-mærkede fusionsproteiner med anti-FLAG-M2-antistof, der er selektivt over for FLAG-epitoper af SPA-tag.
- Opretholdt carboxyterminale SPA-tag fusion stamme dyrkes i stor målestok til at isolere opløselige proteinkomplekser fra høstede celler ved hjælp af SPA oprensningsprotokol. Omridset af de trin, der er involveret i affinitetsmærket oprensningsproceduren er vist i figur 1B.
2. Dyrkning og Sonikering
- Pode 100 pi af en SPA-mærket E. coli glycerol stock i 50 ml Terrific Broth (TB) flydende medium suppleret med 50 pi af 25 ug / ml of Kan opløsning i en 250 ml konisk kolbe. Dyrke kulturen natten over ved 32 ° C.
Bemærk: Eftersom temperatur-inducerbare λ Red kassette i stamme DY330 er under kontrol af en temperaturfølsom repressor 10 er SPA-mærkede E. coli-stamme dyrket ved 32 ° C. - Overfør 10 ml af overnatskulturen i 990 ml frisk TB suppleret med 25 ug / ml Kan i en 4 liters kolbe. Kulturen dyrkes ved 32 ° C under konstant omrystning ved 250 rpm, for 5-6 timer, indtil OD600 når til ~ 2-3.
- Overfør 1 liter E. coli SPA-tag kulturen at rengøre centrifugering flasker og spinde cellerne ved 4 ° C i Beckman J6-HC centrifuge @ 3993 x g i 15 min.
- Supernatanten fjernes fra centrifugeringen flasker. Resuspender E. coli-cellepellets med 25 ml sonikeringsbuffer. Sikre at holde centrifugering flasker på is hele tiden.
- Den resuspenderede pellet eroverført til 50 ml polypropylen Falcon-rør og nedfrosset ved hjælp af flydende nitrogen. De frosne celler opbevares ved -80 ° C for langvarig brug.
- Forud for sonikering, tø de frosne celler fuldstændigt ved at holde disse pellets på is. De optøede prøver overført til et sterilt rustfrit stål cup anbragt på is i sonication. Proben er nedsænket i prøven og sonikeret i 3 minutter. Et yderligere 2 min får lov at afkøle prøven i at blive overophedet.
- Den sonikerede cellelysat overført til præ-kølet sterilt centrifugerør, og underkastet centrifugering ved 4 ° C i Beckman centrifuge med en JA-17 rotor @ 35.267 x g (16.000 rpm) i 15 minutter to gange.
Bemærk: I tilfælde af membranprotein rensning, er den sonikerede cellelysat centrifugeret én gang i 15 minutter, da vi ikke ved, hvor fraktionen af membranproteiner er, det vil sige enten i pelleten eller i supernatantfraktionen. Så for at undgå for stort tab af membran proteiner, vi spinde cellerne i 15 minutter ved høj hastighed centrifugering, og supernatanten efterfølgende behandles til oprensning (se nedenstående trin), hvor 1% detergent anvendes til at solubilisere membranproteiner. - Supernatanten fra centrifugering røret forsigtigt overført til et 50 ml polypropylen Falcon-rør og nedfrosset ved hjælp af flydende nitrogen. Den sonikerede frosne celleekstrakt opbevares i en periode på højst 6 måneder ved -80 ° C til senere brug.
3. Affinitetsoprensning
- Før anvendelse er 100 gl anti-flag M2 beads vasket med 10 volumener AFC-puffer (30 mM Tris-HCI, 150 mM NaCI, 0,1% detergent, og 0,1 til 0,5 mM TCEP [tris (2-carboxyethyl) phosphin - saltsyre]) uden detergent og reduktionsmidlet TCEP (tris (2-carboxyethyl) phosphin).
- Den frosne, lydbehandlet celleekstrakt optøs ved at placere røret i koldt vand. Den optøede celleekstrakt inkuberet med 3 ul benzonase nuclease i 30 minutter ved 4 ° C. Til denne blanding ikke-ionisk detergent tilsættes Triton X-100 (slutkoncentration af detergent bør være 0,1%) og 200 ul suspensioner af anti-flag M2 agarose beads.
Bemærk: For alle opløselige protein oprensninger, Triton X-100 0,1% anvendes til at minimere ikke-specifik adsorption, hvor som til oprensning af et membranprotein, forskellige milde non-ioniske detergenter, såsom C12E8 (Octaethylene glycol dodecyl ether), DDM ( n-dodecyl β-D-maltosid) og maltose-neopentylglycol (MNG) kan anvendes på en 1% detergentkoncentration at forbedre solubiliseringen. Eftersom forskellige detergenter har varierende solubilisering effektivitet membranproteiner, anbefales det at udføre uafhængige protein oprensninger anvendes mere end en detergent. - Indholdet forsigtigt blandet ved at dreje røret i 3 timer ved 4 ° C under anvendelse af en LabQuake rysteapparat. Efter 3 timer af rotation, er røret centrifugeret ved 1700 x g i 6 min. Supernatanten er derefter removed omhyggeligt, så meget som muligt, uden at forstyrre det løse perle pellet.
- Pelleten resuspenderes i den resterende supernatant og derefter overført til en 0,8 x 4 cm Bio-Rad polypropylen prep-søjle. Sikre at fjerne bundafløbet stik på søjlen, så eluaterne til dræning ved tyngdestrømning. Kolonnen udvaskes 5 gange med TEV spaltningstrin.
- Efter dræning de vaskede eluater, er bundafløbet af søjlen lukkes. Til den samme kolonne, er spaltning udført ved tilsætning ~ 5-10 pi (50 enheder) af TEV protease og 400 ul 1X AFC-puffer på søjlen. Sikre at lukke toppen af kolonnen med en hætte. Søjlen indeholder perlerne roteret blidt natten over ved 4 ° C natten over under anvendelse af en LabQuake rysteapparat.
- Fjern låget på toppen og udløbet proppen i bunden af kolonnen, og tøm eluaterne udvundet efter TEV spaltning i en frisk søjle indeholdende 200 ul suspensioner af calmodulin-sepharoseperler, som vaskes med 10volumener af calmodulin bindingsbuffer.
- Både toppen og bunden af søjlen er fastgjort stramt, og indholdet i søjlen blandes forsigtigt ved at dreje i 3 timer ved 4 ° C under anvendelse af en LabQuake rysteapparat.
- Efter 3 timer af rotation, er eluatet drænes ved at fjerne den øverste hætte og bundproppen af søjlen. Søjlen vaskes fire gange med 200 gl 1X calmodulin bindingsbuffer efterfulgt af en stringent vask med 400 pi af calmodulin vaskepuffer.
- Det bundne protein elueres i fire fraktioner på 50 ul i et rent eppendorfrør med 1X calmodulin elueringspuffer. Den eluerede fraktion fordeles i to rene Eppendorf-rør i lige store volumener. Begge rørene tørres efterfølgende med en hastighed vakuum.
- Det tørrede eluat fra en rør anvendes til at drive en sølvfarvning gel, mens den anden er lagret i -80 ° C, før anvendelse af massespektrometri.
4. Sølvfarvning
- For sølv staining, vil halvdelen af volumenet af 3X SDS (natriumdodecylsulfat) prøvebuffer sættes til 50 pi af den tørrede eluat. Efter kogning af blandingen i 5 minutter, er prøverne påsat en SDS-polyacrylamidgel.
- Efter at gelen er færdig med at køre, bliver den omhyggeligt anbragt i fikseringsopløsning (50% methanol og 10% eddikesyre) og omrørt forsigtigt på et roterende rysteapparat i 20 minutter. Gelen er derefter skyllet i 20% ethanol i 10 min.
- Den faste gel vaskes to gange grundigt med 500 ml dobbeltdestilleret vand i 10 minutter for at sikre lav ensartet baggrund.
- Gelen omrøres derefter forsigtigt i 500 ml natrium-thiosulfat i 1 min, efterfulgt af to vasketrin med destilleret vand for 20 sec.
- Vandet kasseres, og gelen inkuberes i 200 ml 0,1% sølvnitrat i 30 min. Efter den tid er sølvnitrat fjernet, og gelen vaskes med destilleret vand i 20 sekunder for at fjerne overskydende sølvnitrat.
- Gelen endeligt håndlavede omrøres i 75 mlaf fremkalderopløsningen. Når den ønskede intensitet er opnået, fremkalderopløsningen kasseres og 80 ml eddikesyre tilsættes for at standse reaktionen. Sikre at inkubere gelen i eddikesyre i mindst 20 min for korrekt visualisering af gelbånd.
5. Proteolyse og Sample Preparation for massespektrometri
- Til den tørrede prøve, 50 pi af fordøjelsen puffer og 0,9 ul 100 mM TCEP-HCI (tris (2-carboxyethyl) phosphin - saltsyre) tilsættes og inkuberes blandingen i 45 min ved stuetemperatur til reduktionstrinet. Dernæst 1 pi af 500 mM iodacetamid og inkuberes i mørke i yderligere 40 minutter for at tillade prøven alkylering.
- Efter den anden runde af inkubation tilsættes 1 ug af immobiliseret trypsin til blandingen og inkuberes enten ved 37 ° C i 5 timer eller natten over ved stuetemperatur. Sikre at standse reaktionen ved tilsætning af 1 ml af eddikesyre.
- Pre-wet den Millipore Zip-Tip pipettespidsen ved sugning 10 ul af befugtning og ekvilibreringsopløsning. Dispenser løsningen til spilde. Efterfølgende aspireres 10 ul vaskeopløsning og dispensere opløsningen til affald. Gentag dette trin to gange.
- Til effektiv binding af peptidblandingen til spidsen, blandes pipette peptidblandingen 20 gange. Peptidblandingen der klæbet til spidsen vaskes ved opsugning og dispensering vaskeopløsningen. Dette gentages to gange til effektiv binding af peptidblandingen til spidsen.
- Med spidsen indeholdende det bundne peptid, aspireres 10 ul af befugtning og ekvilibreringsopløsning, og dispensere i et rent Eppendorf-rør. Gentag dette trin to gange. Efter tørring de eluerede prøver i hastighed vakuum, kan prøverne analyseres umiddelbart ved massespektrometri eller opbevaret ved -80 ° C før anvendelse.
6. Protein Identifikation af LTQ Orbitrap Velos massespektrometer
The polypeptid komponenter i de isolerede komplekser, identificeres under anvendelse af en LTQ Orbitrap Velos hybrid tandem-massespektrometer. Den Orbitrap har exceptionel opløsningsevne (> 60.000 Full Width Half Maximum, eller FWHM) og masse nøjagtighed (<2 ppm), der minimerer MS / MS sampling af irrelevante ikke-specifikke baggrund forurenende stoffer fundet i kontrol oprensninger, mens den høje hastighed Velos ionfælde komponent kan opdage og fragment lav hyppighed peptider ved hjælp af både elektron overførsel dissociation og kollision-induceret dissociation tilstande. Stor tillid kampe blandt resulterende MS / MS spektre er kortlagt til henvisning E. coli-proteinsekvenser ved hjælp databasesøgning algoritme som SEQUEST og hver matchende sekvens evalueret under en sandsynlighed algoritme som STATQUEST 11. Det samlede antal spektre, peptidsekvensen egenart og fælles baggrund kontaminanter påvist i negativ kontrol (dvs.. Mock) oprensninger anses for at opnå en lav empirisk falsk disselvopdagende sats. De følgende trin udføres for protein identifikation:
- Micro-kolonner er pakket med ~ 10 cm af 3 um Luna-C 18 harpiks og er forbundet med en Proxeon nanoelectrospray ionkilde, der er placeret på linje med Orbitrap instrument.
- En Proxeon nano flow binære HPLC-pumpe anvendes til at levere et stabilt spids strømningshastighed på ~ 300 nl min -1 i peptid-separationer.
- At opnå peptid-eluering er en organisk buffer gradient opstilles efter prøvens kompleksitet. For eksempel er den følgende gradient typisk indstillet til E. coli SPA prøver: solvent B er steget fra 2% til 6% i 1 min, til 24% i 38 min, til 100% i næste 4 min, som blev afholdt med 100% i 1 min, og derefter faldt til 2% i 1 min, og endelig fastholdelse ved 2% i 15 min. Den mobile fase opløsningsmiddel A med 95% HPLC gradient vand og 5% ACN med 0,1% myresyre, og opløsningsmiddel B er 5% HPLC gradient vand og 95% ACN med 0,1% myresyre ACId. Strømningshastigheden ved kanylespidsen er indstillet til 300 nl min -1 i 60 minutter.
- Da de massespektrometer cykler køre gennem en hel masse scanning ved 60.000 resolutioner, der 10 samtidige tandem fragmentering masse scanninger indsamlet til den mest intense prækursor-ioner. Dynamisk udelukkelse, monoisotopic masse valg, og realtidsdata-afhængige erhvervelse instrument funktioner er aktiveret.
- Spektrene søges under anvendelse af en database søgealgoritme såsom SEQUEST en database over E. coli-proteinsekvenser, og resultatet er statistisk filtreret under anvendelse af en sandsynlighed algoritme, såsom STAQUEST 11 til at sikre en lav falsk opdagelse rate. Kun høj tillid (99% sandsynlighed) kandidater er valgt, mens kampene viser mere end 10 ppm masse fejl i forhold til den teoretiske peptidmasse elimineres fra yderligere overvejelser.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Et centralt aspekt af SPA-baserede APMS tilgang beskrevet her, er, at kodning er udført inden for det naturlige kromosomale sammenhæng og dermed sikre normal genregulering opretholdes (dvs.. Native agn promotor bevaret, og derfor ekspressionsniveauer ikke forstyrres) og native stabilt-associeret proteinkomplekser bliver indbetalt på nær-endogene niveauer. Operon polaritet problemer undgås også ved at indbefatte en udadvendende promotoren i den selekterbare markør. Dette SPA-tagging fremgangsmåde er effektiv nok til at oprense komponenterne af lav tæthed komplekser til næsten homogenitet, herunder membran-associerede enheder, selv om underenhederne udtrykkes ned til nogle få molekyler pr bakteriecelle. Samlet set kan denne protokol være nemt opskaleres til rensning af store-sæt mærkede opløselige proteiner i E. coli eller i princippet alle andre bakteriearter, som tagging via recombineering er muligt, eller dem, der besidder naturligt højt omdannelsetion kapacitet, såsom Acinetobacter, en ny arbejdshest af bakterielle genetik, som har været anvendt, for eksempel, at opbygge en stamme bibliotek af målrettede gen-knockouts 13.
En stor bekymring uløseligt forbundet med store proteom tilgange er identifikationen af promiskuøse uspecifikke interaktionskandidater og falsk sporforurening. På trods af to runder af berigelse, regelmæssigt vores rutinemæssige SPA oprensninger detektere hyppige kontaminanter, der normalt høj overflod rengøring proteiner, såsom ribosomale proteiner og chaperoner, som binder ikke-specifikt til den chromatografiske harpiks og / eller lokkemad proteiner. Dette problem kan afhjælpes på to måder. For det første er det samlede spektrale antal og unikke i hvert protein identificeret med en bestemt agn ses i forhold til et bredere udvalg af oprensninger af ikke-relaterede protein lokkemad og fra umærket (dvs.. Vildtype) negative kontrolstammer (dvs.. Mock affinitetsoprensning experiments) for at minimere falsk positive associationer. For det andet bør kandidat-protein-interaktioner valideres ved hjælp af gensidig tagging og oprensning af det formodede bindingspartner, med det formål uafhængigt bekræfter individuelle protein-protein-interaktioner for at undgå sjældne tilfælde, hvor tilstedeværelsen af SPA-tag forstyrrer inkorporeringen af native proteiner i det endogene protein-samling.
APMS-baserede proteom undersøgelser er begrænset af mangel på følsomhed med hensyn til at identificere forbigående eller sub-støkiometrisk interaktioner. I sådanne tilfælde kan éttrins oprensningsprocedurer anvendes til at øge detektion af svagere interaktion partnere. I løbet af vores løbende, årti lange undersøgelse af E. coli interactome har vi set detektionsevnen af den nye generation massespektrometre forbedre støt. Ældre instrumentering er forspændt til tilbagevendende identifikation af meget rigelige proteiner, ofte udelukker detektion af mindre abundant men potentielt meget vigtig interagerende proteiner. Omvendt Orbitrap Velos hybrid massespektrometer vi bruger i øjeblikket har markant forbedret opløsning, masse nøjagtighed og følsomhed hvorved langt mere effektiv, high throughput påvisning af lav hyppighed proteiner, herunder forbigående interaktioner. Endelig, hvis karakteren af interaktionen er fuldstændig ukendt foreslår vi forskere til: (i) anvende strenge kriterier for at tildele tillid scores til alle formodede databasesøgning kampe. Proteiner med to eller flere entydige peptider er normalt betragtes som positivt, idet det antages hver kamp går med et minimum sandsynlighed tærskel cut-off på 99% eller derover sandsynlighed, (ii) Sørg for at undersøge specificiteten af kandidat protein interaktionskandidater optaget med den mærkede agn i sammenligning med resultater opnået med negativ kontrol ukodede stammer (mock eksperimenter) eller ikke-forbundne protein lokkemad, (iii) gensidigt bekræfte potentielle interaktioner indeholdende et ukendt protein af interest ved at skabe den tilsvarende SPA tag agn fusion for storstilet oprensning eller validere parvise interaktioner ved hjælp af traditionel co-immunpræcipitering med protein specifikke eller tag specifikke antistoffer.
Til dato, ved hjælp af denne systematiske tilgang har vi formået at mærke og rense omkring to tredjedele af den ~ 2.750 E. coli opløselige proteiner, som påviseligt udtrykt under kultur i rigt medium 1, 2. Vi har også tilpasset denne samme grundlæggende metode til systematisk isolere membran-associerede protein-komplekser, og forsøger nu at oprense hver af de resterende ~ 1000 E. coli-proteiner forventes at være membranbundet. Mens oprensning af membranproteiner ofte udgør unikke problemer, fordi den ofte ikke effektivt solubiliseret ved ekstraktionspufferen som vi normalt bruges til SPA-metoden, tilsætning af ikke-ioniske detergenter til vores buffere muliggør opløseliggørelse og oprensning af et flertal af E. coli </ Em> membranproteiner, vi har forsøgt at dato (Babu et al. Upublicerede data).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Ingen interessekonflikter erklæret.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af midler fra den canadiske Institut for Innovation, Genome Canada, Ontario Genomics Institute, Ontario Ministeriet for Innovation, og den canadiske Institutes of Health Research tilskud til JG og AE The Red-udtrykkende E. coli-stamme DY330 var en slags gave fra Donald L. Court (National Cancer Institute, Frederick, MD).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| I. Antibiotics | |||
| Kanamycin | Bioshop | #KAN201 | |
| Ampicillin | Bioshop | #AMP201 | |
| 2. Terrific-Broth medium | |||
| Bio-Tryptone | Bioshop | #TRP 402 | |
| Yeast extract | Bioshop | #YEX 555 | |
| Glycerol | Bioshop | #GLY 002 | |
| K2HPO4 | Bioshop | #PPM 302 | |
| KH2PO4 | Bioshop | #PPM 303 | |
| 3. Bacterial Strain and Plasmid | |||
| DY330 | Yu et al. (2000)10 | ||
| pJL148 | Zeghouf et al. (2004)7 | ||
| 4. PCR and Electrophoresis Reagents | |||
| Taq DNA polymerase | Fermentas | # EP0281 | |
| 10 X PCR buffer | Fermentas | # EP0281 | |
| 10 mM dNTPs | Fermentas | # EP0281 | |
| 25 mM MgCl2 | Fermentas | # EP0281 | |
| Agarose | Bioshop | # AGA002 | |
| Loading dye | NEB | #B7021S | |
| Ethidium bromide | Bioshop | # ETB444 | |
| 10X TBE buffer | Thermo Scientific | #28355 | |
| Tris Base | Bioshop | #TRS001 | |
| Boric acid | Bioshop | #BOR001 | |
| 0.5 M EDTA (pH 8.0) | Sigma | # E6768 | |
| DNA ladder | NEB | #N3232L | |
| 5. Plasmid isolation and Clean-up Kits | |||
| Plasmid Midi kit | Qiagen | #12143 | |
| QIAquick PCR purification kit | Qiagen | #28104 | |
| 6. PCR and Transformation Equipments | |||
| Thermal cycler | BioRad | iCycler | |
| Agarose gel electrophoresis | BioRad | ||
| Electroporator | Bio-Rad | GenePulser II | |
| 0.2 cm electroporation cuvette | Bio-Rad | ||
| 42 °C water bath shaker | Innova 3100 | ||
| Beckman Coulter TJ-25 centrifuge | Beckman Coulter | TS-5.1-500 | |
| 32 °C Shaker | New Brunswick Scientific, USA | ||
| 32 °C large Shaker | New Brunswick Scientific, USA | ||
| 32 °C plate incubator | Fisher Scientific | ||
| 7. Electrophoresis and Western blotting | |||
| Acrylamide monomer, N,N'- methylenebis-acrylamide | Bio-Rad | #161-0125 | |
| Ammonium persulfate | Bioshop | # AMP001 | |
| n-butanol | Sigma | # B7906 | |
| TEMED | Bioshop | #TEM001 | |
| Whatman No. 1 filter paper | Fischer Scientific | #09-806A | |
| Mini protean 3 cell | Bio-Rad | #165-3301 | |
| iBlot gel transfer device | Invitrogen | #IB1001 | |
| Nitrocellulose membranes | Bio-Rad | #162-0115 | |
| Monoclonal Anti-Flag M2 antibody | Sigma | #F3165 | |
| Horseradish peroxidase | Amersham | #NA931V | |
| Pre-stained protein molecular weight standards | Bio-Rad | #161-0363 | |
| Chemiluminescence reagent | PIERCE | #1856136 | |
| Autoradiography film | Clonex Corp | #CLEC810 | |
| Quick Draw blotting paper | Sigma | #P7796 | |
| C2 platform rocking shaker | New Brunswick Scientific, USA | ||
| 8. Sonication Equipment and Reagents | |||
| Sonicator | Branson Ultrasonic | #23395 | |
| NaCl | Bioshop | #SOD001 | |
| Protease inhibitors | Roche | #800-363-5887 | |
| 0.5 mM TCEP-HCl | Thermo Scientific | #20490 | |
| 9. Affinity Purification Reagents and Equipment | |||
| 0.8 x 4 cm Bio-Rad polypropylene column | Bio-Rad | #732-6008 | |
| Benzonase nuclease | Novagen | #70746 | |
| Anti-FLAG M2 agarose beads | Sigma | #A2220 | |
| Calmodulin-sepharose beads | GE Healthcare | #17-0529-01 | |
| TEV protease | Invitrogen | #12575-015 | |
| Triton X-100 | Sigma | #T9284 | |
| CaCl2 | Sigma | #C2661 | |
| EGTA | Sigma | #E3889 | |
| LabQuake Shaker | Thermolyne | #59558 | |
| 10. Silver Staining Reagents | |||
| Methanol | Bioshop | #MET302 | |
| Acetic acid | Bioshop | t#ACE222 | |
| Sodium-thiosulfate | Sigma | #S-7143 | |
| Silver nitrate | Fischer Scientific | #S181-100 | |
| Formaldehyde | Bioshop | #FOR201 | |
| Sodium carbonate | Bioshop | #SOC512 | |
| 11. Reagents and Equipment for Protein Identification | |||
| Trypsin Gold, Mass Spectrometry Grade | Promega | # V5280 | |
| 50 mM NH4HCO3 | Bioshop | #AMC555 | |
| 1 mM CaCl2 | Bioshop | #CCL302 | |
| Acetonitrile | Sigma | #A998-4 | |
| Formic acid | Sigma | #F0507 | |
| HPLC grade water | Sigma | #95304 | |
| Iodoacetamide | Sigma | #16125 | |
| Millipore Zip-Tip | Millipore | # ZTC18M960 | |
| ~10 cm of 3 μm Luna-C18 resin | Phenomenex | ||
| Proxeon nano HPLC pump | Thermo Fisher Scientific | ||
| LTQ Orbitrap Velos mass spectrometer | Thermo Fisher Scientific | ||
| 12. Labware | |||
| 4 liter conical flasks | VWR | #89000-372 | |
| 50 ml polypropylene falcon tubes | Any Vendor | ||
| 1.5 ml micro-centrifuge tubes | Any Vendor | ||
| 250 ml conical flaks | VWR | #29140-045 | |
| 15 ml sterile culture tubes | Thermo Scientific | #366052 | |
| Cryogenic vials | VWR | #479-3221 | |
| -80 °C freezer | Fisher Scientific | #13-990-14 | |
| Speed vacuum system | Thermo Scientific | ||
| Buffers and Solutions 1. 1 liter Terrific Broth (TB) media 11 g Bio-Tryptone 2. Potassium Salt Stock Solution 1.5 M K2HPO4 3. Sonication Buffer 20 mM Tris-HCl (pH 7.9) 4. AFC buffer 30 mM Tris-HCl (pH 7.9) 5. TEV cleavage buffer 30 mM Tris-HCl (pH 7.9) 6. Calmodulin binding buffer 30 mM Tris-HCl (pH 7.9) 7. Calmodulin wash buffer 30 mM Tris-HCl pH 7.9 8. Calmodulin elution buffer 30 mM Tris-HCl (pH 7.9) 9. Developing solution (1L) 37% Formaldehyde 10. Digestion buffer 50 mM NH4HCO3 11. Wetting and Equilibration solution 70% acetonitrile (ACN) in 0.1% formic acid 12. Washing solution 100% H2O in 0.1% formic acid |
|||
References
- Butland, G., et al. Interaction network containing conserved and essential protein complexes in Escherichia coli. Nature. 433, 531-537 (2005).
- Hu, P., Janga, S. C., Babu, M., Diaz-Mejia, J. J., Butland, G. Global functional atlas of Escherichia coli encompassing previously uncharacterized proteins. PLoS Biol. 7, e1000096 (2009).
- Krogan, N. J., et al. Global landscape of protein complexes in the yeast Saccharomyces cerevisiae. Nature. 440, 637-643 (2006).
- Mak, A. B., et al. A lentiviral functional proteomics approach identifies chromatin remodeling complexes important for the induction of pluripotency. Mol. Cell Proteomics. 9, 811-823 (2010).
- Polanowska, J., et al. Tandem immunoaffinity purification of protein complexes from Caenorhabditis elegans. Biotechniques. 36, 778-782 (2004).
- Veraksa, A., Bauer, A., Artavanis-Tsakonas, S. Analyzing protein complexes in Drosophila with tandem affinity purification-mass spectrometry. Dev. Dyn. 232, 827-834 (2005).
- Zeghouf, M., et al. Sequential Peptide Affinity (SPA) system for the identification of mammalian and bacterial protein complexes. J. Proteome Res. 3, 463-468 (2004).
- Puig, O., et al. The tandem affinity purification (TAP) method: a general procedure of protein complex purification. Methods. 24, 218-229 (2001).
- Rigaut, G., et al. A generic protein purification method for protein complex characterization and proteome exploration. Nat. Biotechnol. 17, 1030-1032 (1999).
- Yu, D., et al. An efficient recombination system for chromosome engineering in Escherichia coli. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 97, 5978-5983 (2000).
- Kislinger, T., et al. PRISM, a generic large scale proteomic investigation strategy for mammals. Mol. Cell Proteomics. 2, 96-106 (2003).
- Vlasblom, J., et al. GenePro: a Cytoscape plug-in for advanced visualization and analysis of interaction networks. Bioinformatics. 22, 2178-219 (2006).
- de Berardinis, V., et al. A complete collection of single-gene deletion mutants of Acinetobacter baylyi ADP1. Mol. Syst. Biol. 4, 174 (2008).
- Babu, M., et al. Sequential peptide affinity purification system for the systematic isolation and identification of protein complexes from Escherichia coli. Methods Mol. Biol. 564, 373-400 (2009).
