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Biology

Identificación de los complejos de proteínas en doi: 10.3791/4057 Published: November 12, 2012

Summary

La purificación por afinidad de las proteínas etiquetadas en combinación con espectrometría de masas (APMS) es un potente método para la asignación sistemática de las redes de interacción de proteínas y para la investigación de la base mecánica de los procesos biológicos. A continuación, se describe un péptido secuencial optimizado afinidad (SPA) APMS procedimiento desarrollado por la bacteria

Abstract

Como la mayoría de los procesos celulares están mediadas por las asambleas macromoleculares, la identificación sistemática de las interacciones proteína-proteína (PPI) y la identificación de la composición de la subunidad de multi-proteína complejos pueden dar una idea de la función de genes y mejorar la comprensión de los sistemas biológicos 1, 2. Interacciones físicas se pueden mapear con alta confianza vialarge escala aislamiento y caracterización de complejos de proteínas endógenas en condiciones próximas a las condiciones fisiológicas basado en la purificación por afinidad de proteínas cromosómicamente etiquetados en combinación con espectrometría de masas (APMS). Este enfoque ha sido aplicado con éxito en diversos organismos evolutivamente, incluyendo levaduras, moscas, gusanos, células de mamíferos, bacterias y 1-6. En particular, hemos generado una afinidad carboxi-terminal del péptido secuencial (SPA) Sistema de marcado doble para los complejos de purificación por afinidad de proteínas nativas de cultivos de bacterias gram-negativas Escherichia coli, utilizando genetically-tratables cepas huésped de laboratorio que están bien adaptados para todo el genoma investigaciones de la biología fundamental y los procesos conservados de procariotas 1, 2, 7. Nuestro SPA-tagging sistema es análogo al método de purificación de afinidad en tándem desarrollado originalmente para la levadura 8, 9, y consta de un péptido de unión a calmodulina (CBP), seguido por el sitio de escisión para la proteasa altamente específica tabaco etch virus (TEV) y tres copias del epítopo FLAG (FLAG 3X), permitiendo por dos rondas consecutivas de enriquecimiento de afinidad. Después de la amplificación casete, específicas de secuencia lineales productos de PCR que codifican el SPA-tag y un marcador seleccionable se integran y se expresa en marco como carboxi-terminal de fusiones en un fondo DY330 que es inducida para expresar transitoriamente un muy eficiente sistema de recombinación heteróloga bacteriófago lambda 10. Posterior de doble etapa de purificación usando calmodulina y anti-FLAG perlas de afinidad permite que el altamente selectivoy la recuperación eficaz de incluso complejos de baja abundancia de proteínas de cultivos a gran escala. La espectrometría de masas se utiliza para identificar los purificadores de manera estable co-proteínas con alta sensibilidad (bajos límites de detección de nanogramos).

A continuación, describimos detalladas paso a paso los procedimientos que comúnmente se utilizan para el etiquetado sistemático de proteínas, purificación y espectrometría de masas basado en el análisis de complejos de proteínas solubles de E. coli, que pueden ser ampliadas y potencialmente adaptado a otras especies bacterianas, incluyendo ciertos patógenos oportunistas que son susceptibles de recombinería. Las interacciones físicas resultantes a menudo pueden revelar interesantes componentes y conexiones inesperadas que sugieren nuevos enlaces mecánicos. La integración de los datos de PPI con alternativas datos de la asociación molecular, tales como genéticos (gen-gen) las interacciones y el contexto genómico-(GC) predicciones pueden facilitar la elucidación de la organización mundial molecular de los complejos multi-proteína dentro de bivías metodológicas. Las redes generadas por E. coli se puede utilizar para obtener una perspectiva de la arquitectura funcional de los productos de genes ortólogos en otros microbios para que las anotaciones funcionales están faltando.

Protocol

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1. Construcción de Genes específicos de SPA-tagging en E. DY330 coli cepa

  1. El plásmido pJL148 que abarca la secuencia de ADN SPA-tag y el antibiótico kanamicina casete marcador de resistencia (Kan R) se utiliza como una plantilla en la reacción en cadena de polimerasa (PCR) 7. A 45 nt de genes específicos de cebador directo, que se encuentra inmediatamente aguas arriba del codón de parada del gen diana en el marco con un 27 bp ('5'-AGCTGGAGGATCCATGGAAAAGAGAAG -3) tag cebador específico, y un 45 nt de genes específicos de cebador inverso, situado inmediatamente abajo del codón de parada del gen diana en el marco con un pb 27 (5'-GGCCCCATATGAATATCCTCCTTAGTT -3 ') cebador inverso etiqueta específica, se usan para amplificar el SPA-tag y casete Kan R de la pJL148 utilizando las siguientes condiciones de ciclo de PCR: 94 ° C durante 5 min, 30 ciclos de 94 ° C por 1 min, 55 ° C durante 1 min, 68 ° C durante 2 min 10 seg, seguido de 68 ° C durante 10 min. Estas secuencias amplificadas servir uns sustratos para la ectópica introducido λ-Rojo maquinaria de recombinación homóloga (véase a continuación).
  2. El producto de PCR se purifica utilizando un kit de purificación de PCR QIAquick para eliminar las sales que pueden interferir con la electroporación. El producto de PCR purificado es posteriormente dirigida a integrar en el extremo 3 '(inmediatamente aguas arriba del codón de parada nativa) de un gen específico en DY330 cepa en la que se expresa el λ-Rojo maquinaria de recombinación 10.
  3. El DY330 λ-Red cepa que expresa se cultivaron durante la noche en 2 ml de medio Luria-Bertani (LB) a 32 ° C con agitación a 180 rpm. 1 ml del cultivo durante toda la noche posteriormente se inocularon en 70 ml de medio LB fresco en 500 ml matraz cónico. El inóculo se cultivaron a 32 ° C con agitación a 180 rpm hasta que la DO 600 alcanza ~ 0,8.
  4. El cultivo se transfirió a un nuevo matraz de 250 ml cónico, donde las células son inducidas mediante la incubación el matraz en un baño de agua a 42 ° C agitando suavemente en180 rpm durante 15 min. Inmediatamente después de la inducción, el matraz se incuba en un baño de hielo suspensión en agua durante al menos 30 min con agitación.
  5. El cultivo enfriado con hielo se transfiere inmediatamente en pre-refrigerada 50 ml tubo de polipropileno y se sometieron a centrifugación a 3.993 xg durante 6 min a 4 ° C. El sedimento celular se resuspendió en 50 ml de helado de agua estéril y se centrifugaron de nuevo a 3.993 xg durante 6 min a 4 ° C. El sedimento de células se resuspende en 1 ml de agua fría y se transfirió a un tubo de 1,5 ml Effendorf, y se centrifugó a velocidad máxima durante 20 segundos a 4 ° C. Después de dos o tres etapas de lavado con agua fría de hielo, el precipitado celular se resuspendió finalmente en 700 l de agua enfriada con hielo estéril, resultando en electro-competentes células.
  6. A través de la electroporación, una l de la amplicón purificado se introduce en 40 l de las células electro-competentes. Las células se someten a electroporación en un II Bio-Rad GenePulser con los siguientes ajustes: 2,5 kV, 25 mF con pulsocontrolador de 200 Ω. Después de la recombinación homóloga y la integración, los transformantes que recombinados con éxito la etiqueta / casete en el cromosoma se seleccionan basándose en la resistencia a Kan (Figura 1A). Varios transformantes se seleccionan para el Western Blot para verificar la correcta generación (es decir, la señal positiva) de SPA-etiquetados proteínas de fusión con anticuerpos anti-FLAG M2 que es selectivo contra los epítopos bandera de la SPA-tag.
  7. Confirmado carboxi terminal SPA-tag cepa de fusión se cultivaron en una gran escala para aislar complejos proteína soluble a partir de células cosechadas utilizando el protocolo de purificación de SPA. El esquema de los pasos implicados en el procedimiento de purificación por afinidad etiqueta se muestra en la Figura 1B.

2. El cultivo y la sonicación

  1. Inocular 100 l de una E. SPA-etiquetado Imágenes coli glicerol en 50 ml de caldo Terrific (TB) medio líquido suplementado con 50 l de 25 mg / ml of Kan solución en un matraz cónico de 250 ml. Mantener el cultivo durante la noche a 32 ° C.
    Nota: Puesto que el casete λ temperatura inducible Red en la cepa DY330 está bajo el control de un represor sensible a la temperatura 10, la cepa SPA-etiquetados E. coli se hace crecer a 32 ° C.
  2. Transferir 10 ml del cultivo durante la noche en 990 ml de TB fresco suplementado con 25 g / ml de Kan en un matraz de 4 litros. El cultivo se hace crecer a 32 ° C con agitación constante a 250 rpm, durante 5 a 6 horas, hasta que la DO 600 alcanza a ~ 2 a 3.
  3. Transferir el 1 litro E. coli SPA-etiqueta cultura para limpiar botellas de centrifugación y centrifugar las células a 4 º C en Beckman J6-HC centrífuga @ 3993 xg durante 15 min.
  4. El sobrenadante se elimina de las botellas de centrifugación. Resuspender el E. gránulos coli células con 25 ml de tampón de sonicación. Asegúrese de mantener las botellas de centrifugación sobre hielo en todo momento.
  5. El precipitado resuspendido setransferido a 50 ml de polipropileno tubo Falcon y se congelan con nitrógeno líquido. Las células congeladas se almacenan a -80 ° C para uso a largo plazo.
  6. Antes de la sonicación, las células congeladas descongelar completamente, manteniendo los gránulos en hielo. Las muestras descongeladas se transfirió a un vaso de acero inoxidable estéril colocó en hielo durante la sonicación. La sonda se sumerge en la muestra y se sonicó durante 3 min. Un adicional de 2 min se deja enfriar la muestra del sobrecalentamiento.
  7. El lisado celular sonicado se transfiere en el tubo de centrifugación pre-refrigerada estéril, y se sometió a centrifugación a 4 ° C en una centrífuga Beckman usando un rotor JA-17 @ 35.267 xg (16.000 rpm) durante 15 min dos veces.
    Nota: En el caso de la purificación de proteínas de membrana, el lisado celular sonicado se centrifuga sólo una vez durante 15 min, ya que no sabe en qué fracción de las proteínas de membrana son, es decir, ya sea en el sedimento o en la fracción sobrenadante. Así que para evitar pérdida excesiva de memproteínas de membrana, hacemos girar las células durante 15 min a centrifugación a alta velocidad y el sobrenadante se procesa posteriormente para la purificación (ver pasos abajo) donde el 1% se usa un detergente para solubilizar las proteínas de la membrana.
  8. El sobrenadante de la centrifugación en tubo se transfiere cuidadosamente a un tubo de 50 ml de polipropileno Falcon y se congelaron con nitrógeno líquido. El extracto sonicado de células congeladas se almacena durante un período máximo de 6 meses a -80 ° C para su uso futuro.

3. Purificación por afinidad

  1. Antes de su uso, 100 l de anti-FLAG M2 perlas se lavan por 10 volúmenes de tampón de AFC (30 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, 0,1% de detergente, y 0.1-0.5 mM TCEP [tris (2-carboxietil) fosfina - ácido clorhídrico]) sin el detergente y el agente reductor de TCEP (tris (2-carboxietil) fosfina).
  2. El extracto congelado, sonicado celular se descongela colocando el tubo en agua fría. El extracto de células descongeladas se incubaron con 3 l de benzonase nucleasa durante 30 min a 4 ° C. A esta mezcla, agregar un detergente no iónico Triton X-100 (concentración final del detergente debe ser 0,1%) y 200 l de suspensiones anti-FLAG M2 perlas de agarosa.
    Nota: Para todas las purificaciones de proteína soluble, 0,1% de Triton X-100 se utiliza para minimizar la adsorción no específica, mientras que para la purificación de una proteína de membrana, diferentes suaves detergentes no iónicos, tales como C12E8 (éter de octaetilenglicol dodecil glicol), DDM ( n-dodecil-β-D-maltósido) y maltosa-neopentilglicol (MNG) se puede utilizar en una concentración de detergente 1% para mejorar la solubilización. Ya que los detergentes diferentes tienen diferentes eficiencia de solubilización de proteínas de membrana, se recomienda llevar a cabo purificaciones independientes de proteínas utilizando más de un detergente.
  3. El contenido se mezcla suavemente haciendo girar el tubo durante 3 horas a 4 ° C usando un agitador de LabQuake. Después de 3 horas de rotación, el tubo se centrifugó a 1.700 xg durante 6 min. El sobrenadante es entonces removed cuidadosamente, tanto como sea posible, sin perturbar el sedimento suelto perla.
  4. El sedimento se resuspende en el sobrenadante restante y luego se transfiere a un 0,8 x 4 cm de columna Bio-Rad polipropileno prep. Asegúrese de quitar los tapones de salida inferior de la columna, para permitir que los eluatos para drenar por gravedad. Lavar la columna con 5 veces el paso de escisión TEV.
  5. Después de drenar los eluatos lavados, la salida del fondo de la columna está cerrado. Para la misma columna, la escisión se lleva a cabo mediante la adición de ~ 5 a 10 l (50 unidades) de la proteasa TEV y 400 l de 1X tampón de AFC en la columna. Asegúrese de cerrar la parte superior de la columna con una tapa. La columna que contiene las perlas se gira suavemente durante la noche a 4 ° C durante la noche usando un agitador LabQuake.
  6. Quitar el tapón en la parte superior y el tapón de salida en la parte inferior de la columna, y la fuga de los eluatos recuperados después de la escisión TEV en una columna reciente que contenía 200 l de suspensiones calmodulina-sepharose bolas, que se lava por 10volúmenes de tampón de unión a calmodulina.
  7. Tanto la parte superior y la parte inferior de la columna se sujetan firmemente, y el contenido de la columna se mezcló suavemente por rotación durante 3 horas a 4 ° C usando un agitador de LabQuake.
  8. Después de 3 horas de rotación, el eluato se drena mediante la eliminación de la tapa superior y el tapón de fondo de la columna. La columna se lava cuatro veces con 200 l de 1X tampón de unión a calmodulina seguido por un lavado riguroso con 400 l de tampón de lavado calmodulina.
  9. La proteína unida se eluyó en cuatro fracciones de 50 l en un tubo Eppendorf usando 1X tampón de elución calmodulina. La fracción eluida se distribuye en dos tubos Eppendorf limpios en volúmenes iguales. Tanto los tubos se secan posteriormente usando un vacío de velocidad.
  10. El eluato se secó de un tubo se utiliza para el funcionamiento de un gel de tinción de plata, mientras que la otra se almacena en -80 ° C, antes de usar la espectrometría de masas.

4. Silver Staining

  1. Para la plata staining, la mitad del volumen de 3X SDS (dodecil sulfato sódico) tampón de muestra se añade a 50 l de eluato se secó. Después de hervir la mezcla durante 5 min, las muestras se cargaron en un gel de poliacrilamida SDS.
  2. Después de que el gel ha finalizado la ejecución, que se coloca cuidadosamente en la solución de fijación (50% de metanol y 10% de ácido acético) y se agitó suavemente en un agitador rotatorio durante 20 min. El gel después se enjuaga con 20% de etanol durante 10 min.
  3. El gel fijo se lava dos veces a fondo con 500 ml de agua doblemente destilada durante 10 minutos para asegurar fondo uniforme bajo.
  4. Después el gel se agitó suavemente en 500 ml de tiosulfato de sodio durante 1 min, seguido por dos etapas de lavado con agua destilada durante 20 segundos.
  5. El agua se elimina, y el gel se incuba en 200 ml de nitrato de plata 0,1% durante 30 min. Después de ese tiempo, el nitrato de plata se retira y se lava el gel con agua destilada durante 20 segundos para eliminar el exceso de nitrato de plata.
  6. El gel es finalmente a mano agita en 75 mlde la solución de revelado. Cuando la intensidad deseada, la solución de revelado se descarta y 80 ml de ácido acético se añade para detener la reacción. Asegúrese de incubar el gel en ácido acético durante un mínimo de 20 min para la correcta visualización de bandas de gel.

5. La proteólisis y preparación de muestras para espectrometría de masas

  1. Para la muestra seca, se añaden 50 l de tampón de digestión y 0,9 l de 100 mM TCEP-HCl (tris (2-carboxietil) fosfina - ácido clorhídrico) y se incuba la mezcla durante 45 min a temperatura ambiente para la etapa de reducción. A continuación, 1 l de yodoacetamida 500 mM y se incuba en la oscuridad durante 40 min adicionales para permitir la alquilación de la muestra.
  2. Después de la segunda ronda de la incubación, añadir 1 g de tripsina inmovilizada a la mezcla e incubar bien a 37 ° C durante 5 horas o durante la noche a temperatura ambiente. Asegúrese de detener la reacción mediante la adición de 1 l de ácido acético.
  3. Humedecer previamente el Millipore Zip-Tip punta de pipeta de aspiración 10 l de la solución humectante y equilibrado. Vierta la solución a los residuos. Posteriormente aspirar 10 l de la solución de lavado y dispensar la solución a los residuos. Repita este paso dos veces.
  4. Para una unión eficaz de la mezcla de péptidos a la punta, pipeta mezclar la mezcla de péptidos 20 veces. La mezcla de péptidos que se adhería a la punta es lavado por aspiración y dispensación de la solución de lavado. Repita este procedimiento dos veces para una unión eficiente de la mezcla de péptidos a la punta.
  5. Con la punta que contiene el péptido unido, aspire 10 l de la solución humectante y la equilibración, y se distribuye en un tubo eppendorf limpio. Repita este paso dos veces. Después de secar las muestras eluidas en vacío velocidad, las muestras pueden ser analizadas por espectrometría de masas inmediatamente o se almacenaron a -80 ° C antes de su uso.

6. Identificación de proteínas por LTQ Velos Orbitrap Espectrómetro de Masas

Thcomponentes electrónicos de polipéptidos de los complejos aislados se identifican utilizando una Orbitrap LTQ Velos híbrido espectrómetro de masas en tándem. El Orbitrap tiene una potencia excepcional resolver (> 60.000 Máximo completa Media Ancho, o FWHM) y exactitud de la masa (<2 ppm) que minimiza MS / MS de muestreo de irrelevantes contaminantes de fondo no específicas detectadas en purificaciones de control, mientras que la velocidad alta Velos trampa de iones componente puede detectar y péptidos fragmento baja abundancia utilizando tanto la transferencia de electrones y la disociación inducida por colisión modos de disociación. Partidos de alta confianza entre resultante MS / MS espectros de referencia se asignan a E. secuencias de proteínas coli utilizando el algoritmo de búsqueda de base de datos como SEQUEST y cada secuencia correspondiente evaluados durante un algoritmo de probabilidad como STATQUEST 11. El número total de espectros, la singularidad y la secuencia de péptidos contaminantes comunes fondo detectados en el control negativo (es decir. Simulado) purificaciones son consideradas para lograr la máxima empírico falso disdescubrimiento tasa. Los siguientes pasos se realizan para la identificación de proteínas:

  1. Las columnas micro-se embalan con ~ 10 cm de 3 m Luna C-18 de resina y están interconectados a una fuente de iones de nanoelectropulverización Proxeon que se coloca en línea con el instrumento Orbitrap.
  2. Un Proxeon flujo binario nano HPLC bomba se utiliza para proporcionar una velocidad de punta de flujo estable de ~ 300 nl min -1 durante las separaciones de péptidos.
  3. Para conseguir la elución de péptidos, un gradiente de tampón orgánico se establece de acuerdo a la complejidad de la muestra. Por ejemplo, el siguiente gradiente normalmente se configura para E. muestras coli SPA: disolvente B se aumentó de 2% a 6% en 1 min, a 24% en 38 min, a 100% en los próximos 4 min, se mantuvo a 100% durante 1 min, y luego se redujo a 2% en 1 min, y final de mantener a 2% durante 15 min. La fase móvil disolvente A tiene 95% HPLC gradiente de agua y 5% de ACN con 0,1% de ácido fórmico, mientras que el disolvente B tiene 5% HPLC gradiente de agua y 95% de ACN con fórmico 0,1% acid. La velocidad de flujo en la punta de la aguja se establece en -1 300 nl min durante 60 min.
  4. A medida que los ciclos del espectrómetro de masas ejecutar a través de un ciclo completo de masas en 60.000 resoluciones, 10 concomitantes tándem escaneos masivos de fragmentación son recogidos por los iones precursores más intensos. Exclusión dinámico, selección masal monoisotópico, y en tiempo real los datos que dependen de características del instrumento de adquisición han sido habilitadas.
  5. Los espectros se buscan utilizando un algoritmo de búsqueda de bases de datos tales como SEQUEST contra una base de datos de E. coli secuencias de proteínas, y el resultado es estadísticamente filtrada utilizando un algoritmo de probabilidad como STAQUEST 11 para garantizar una baja tasa de falsos descubrimiento. Sólo los candidatos de confianza alto (99% de probabilidad) se seleccionan, mientras que los partidos que muestra más de 10 ppm de masa de error en comparación con la masa del péptido teórico se eliminaron de otros estudios.

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Discussion

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Un aspecto clave del enfoque basado en SPA APMS descrito aquí es que el marcado se realiza en el contexto cromosómico natural, garantizando así la regulación de genes normales se mantiene (es decir. Cebo promotor nativo conserva, por lo tanto, los niveles de expresión no es perturbado) y nativo de manera estable asociada a complejos de proteínas se recuperan casi a los niveles endógenos. Cuestiones operón polaridad también se evitan mediante la inclusión de un promotor orientada hacia fuera en el marcador seleccionable. Este enfoque SPA-etiquetado es lo suficientemente eficaz para purificar los componentes de baja abundancia de complejos cerca de la homogeneidad, como asociadas a la membrana ensamblados, incluso si las subunidades se expresan a sólo unas pocas moléculas por célula bacteriana. En general, este protocolo puede ser fácilmente mayor escala para la purificación a gran conjuntos de etiquetado proteínas solubles en E. coli o transformaciones, en principio, ninguna otra especie bacteriana para la cual marcado por recombinería es posible, oa aquellas que poseen naturalmente un altocapacidad ción, como Acinetobacter, un caballo de batalla emergente de la genética bacteriana, que se ha utilizado, por ejemplo, para construir una biblioteca de cepa de gen knockouts dirigidos 13.

Una preocupación importante inherente a gran escala enfoques proteómicos es la identificación de promiscuos no específicos interactores y trazas de contaminación espuria. A pesar de dos rondas de enriquecimiento, nuestros purificaciones SPA rutina regularmente detectar contaminantes frecuentes que son generalmente de alta abundancia de proteínas de limpieza, tales como las proteínas ribosomales y acompañantes, que se unen de forma no específica a la resina cromatográfica y / o proteínas cebo. Este problema se puede mitigar de dos maneras. En primer lugar, el número total espectral y la singularidad de cada proteína identificada con un cebo en particular se asocia a un conjunto más amplio de las purificaciones de varios cebos orgánicos no relacionados y de untagged (es decir. Tipo salvaje) de las cepas de control negativo (es decir. Exper simulacro de purificación por afinidadmentos) para minimizar falsas asociaciones positivas. En segundo lugar, todas las interacciones proteína candidata debe ser validado en el etiquetado recíproca y la purificación de la pareja de unión putativa, con el objetivo de confirmar independientemente individuales interacciones proteína-proteína para evitar los casos raros en los que la presencia de la SPA-tag perturba incorporación de proteínas nativas en el conjunto de la proteína endógena.

APMS encuestas basadas en proteómica están limitadas por la falta de sensibilidad en términos de identificación de interacciones transitorias o sub-estequiométrica. En tales casos, un solo paso los procedimientos de purificación puede ser utilizado para mejorar la detección de compañeros de interacción débiles. Durante el curso de nuestro estudio en curso década, largo de la E. coli interactome, hemos visto la capacidad de detección de los nuevos espectrómetros de masas de generación de mejorar constantemente. Older instrumentación está sesgado a la identificación de recurrente de proteínas muy abundantes, a menudo se opone a la detección de menos abuproteínas que interactúan ndant pero potencialmente muy importante. Por el contrario, la Orbitrap Velos espectrómetro de masas híbrido que usamos actualmente ha mejorado notablemente resolución, precisión de masa y la sensibilidad lo que permite mucho más eficiente, la detección de alto rendimiento de proteínas de baja abundancia, incluyendo las interacciones transitorias. Por último, si la naturaleza de la interacción es completamente desconocido, se aconseja a los investigadores a: (i) aplicar criterios estrictos para asignar puntuaciones de confianza para todos los resultados de búsqueda supuestas bases de datos. Las proteínas con dos o más péptidos únicos generalmente se consideran positivos, suponiendo que cada partido pasa con un umbral de probabilidad mínima de corte de 99% o mayor probabilidad; (ii) asegurarse de que para examinar la especificidad de los interactores proteína candidata registrada con el cebo en etiquetados Comparación de los resultados obtenidos con las cepas de control negativo sin etiquetar (experimentos simulados) o cebos no relacionadas de proteínas, (iii) recíprocamente confirmar las interacciones potenciales que contienen una proteína desconocida de interest creando la etiqueta correspondiente SPA fusión cebo para la purificación a gran escala o validar par-sabia interacciones utilizando tradicional co-inmunoprecipitación con anticuerpos específicos de la proteína o etiqueta específica.

Hasta la fecha, utilizando este enfoque sistemático, hemos logrado etiquetar y purificar alrededor de dos tercios de los ~ 2.750 E. coli proteínas solubles que detectablemente expresadas en cultivo en medio rico 1, 2. También hemos adaptado este mismo método básico para aislar sistemáticamente asociadas a la membrana complejos de proteínas, y están tratando de purificar cada uno de los restantes 1.000 ~ E. proteínas coli prevé que ser unido a la membrana. Mientras que la purificación de proteínas de la membrana a menudo plantea desafíos únicos debido a que a menudo no están eficientemente solubilizado por el tampón de extracción que se utilizan normalmente para el método de SPA, la adición de detergentes no iónicos a nuestros tampones permite la solubilización y purificación de la mayoría de los E. coli </ Em> las proteínas de membrana que hemos tratado hasta la fecha (Babu et al., Datos no publicados).

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Disclosures

No hay conflictos de interés declarado.

Acknowledgments

Este trabajo fue financiado con fondos de la Fundación Canadiense para la Innovación, Genoma Canadá, el Instituto de Genómica de Ontario, Ontario el Ministerio de Innovación, y los Institutos Canadienses de Investigación en Salud de subvención a JG y AE E. Rojo-expresión DY330 coli cepa fue una especie de regalo de Donald L. Corte (National Cancer Institute, Frederick, MD).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
I. Antibiotics
Kanamycin Bioshop #KAN201
Ampicillin Bioshop #AMP201
2. Terrific-Broth medium
Bio-Tryptone Bioshop #TRP 402
Yeast extract Bioshop #YEX 555
Glycerol Bioshop #GLY 002
K2HPO4 Bioshop #PPM 302
KH2PO4 Bioshop #PPM 303
3. Bacterial Strain and Plasmid
DY330 Yu et al. (2000)10
pJL148 Zeghouf et al. (2004)7
4. PCR and Electrophoresis Reagents
Taq DNA polymerase Fermentas # EP0281
10 X PCR buffer Fermentas # EP0281
10 mM dNTPs Fermentas # EP0281
25 mM MgCl2 Fermentas # EP0281
Agarose Bioshop # AGA002
Loading dye NEB #B7021S
Ethidium bromide Bioshop # ETB444
10X TBE buffer Thermo Scientific #28355
Tris Base Bioshop #TRS001
Boric acid Bioshop #BOR001
0.5 M EDTA (pH 8.0) Sigma # E6768
DNA ladder NEB #N3232L
5. Plasmid isolation and Clean-up Kits
Plasmid Midi kit Qiagen #12143
QIAquick PCR purification kit Qiagen #28104
6. PCR and Transformation Equipments
Thermal cycler BioRad iCycler
Agarose gel electrophoresis BioRad
Electroporator Bio-Rad GenePulser II
0.2 cm electroporation cuvette Bio-Rad
42 °C water bath shaker Innova 3100
Beckman Coulter TJ-25 centrifuge Beckman Coulter TS-5.1-500
32 °C Shaker New Brunswick Scientific, USA
32 °C large Shaker New Brunswick Scientific, USA
32 °C plate incubator Fisher Scientific
7. Electrophoresis and Western blotting
Acrylamide monomer, N,N'- methylenebis-acrylamide Bio-Rad #161-0125
Ammonium persulfate Bioshop # AMP001
n-butanol Sigma # B7906
TEMED Bioshop #TEM001
Whatman No. 1 filter paper Fischer Scientific #09-806A
Mini protean 3 cell Bio-Rad #165-3301
iBlot gel transfer device Invitrogen #IB1001
Nitrocellulose membranes Bio-Rad #162-0115
Monoclonal Anti-Flag M2 antibody Sigma #F3165
Horseradish peroxidase Amersham #NA931V
Pre-stained protein molecular weight standards Bio-Rad #161-0363
Chemiluminescence reagent PIERCE #1856136
Autoradiography film Clonex Corp #CLEC810
Quick Draw blotting paper Sigma #P7796
C2 platform rocking shaker New Brunswick Scientific, USA
8. Sonication Equipment and Reagents
Sonicator Branson Ultrasonic #23395
NaCl Bioshop #SOD001
Protease inhibitors Roche #800-363-5887
0.5 mM TCEP-HCl Thermo Scientific #20490
9. Affinity Purification Reagents and Equipment
0.8 x 4 cm Bio-Rad polypropylene column Bio-Rad #732-6008
Benzonase nuclease Novagen #70746
Anti-FLAG M2 agarose beads Sigma #A2220
Calmodulin-sepharose beads GE Healthcare #17-0529-01
TEV protease Invitrogen #12575-015
Triton X-100 Sigma #T9284
CaCl2 Sigma #C2661
EGTA Sigma #E3889
LabQuake Shaker Thermolyne #59558
10. Silver Staining Reagents
Methanol Bioshop #MET302
Acetic acid Bioshop t#ACE222
Sodium-thiosulfate Sigma #S-7143
Silver nitrate Fischer Scientific #S181-100
Formaldehyde Bioshop #FOR201
Sodium carbonate Bioshop #SOC512
11. Reagents and Equipment for Protein Identification
Trypsin Gold, Mass Spectrometry Grade Promega # V5280
50 mM NH4HCO3 Bioshop #AMC555
1 mM CaCl2 Bioshop #CCL302
Acetonitrile Sigma #A998-4
Formic acid Sigma #F0507
HPLC grade water Sigma #95304
Iodoacetamide Sigma #16125
Millipore Zip-Tip Millipore # ZTC18M960
~10 cm of 3 μm Luna-C18 resin Phenomenex
Proxeon nano HPLC pump Thermo Fisher Scientific
LTQ Orbitrap Velos mass spectrometer Thermo Fisher Scientific
12. Labware
4 liter conical flasks VWR #89000-372
50 ml polypropylene falcon tubes Any Vendor
1.5 ml micro-centrifuge tubes Any Vendor
250 ml conical flaks VWR #29140-045
15 ml sterile culture tubes Thermo Scientific #366052
Cryogenic vials VWR #479-3221
-80 °C freezer Fisher Scientific #13-990-14
Speed vacuum system Thermo Scientific

Buffers and Solutions

1. 1 liter Terrific Broth (TB) media

11 g Bio-Tryptone
22 g Yeast Extract
2% Glycerol
50 ml potassium salt stock solution

2. Potassium Salt Stock Solution

1.5 M K2HPO4
0.35 M KH2PO4

3. Sonication Buffer

20 mM Tris-HCl (pH 7.9)
150 mM NaCl
0.2 mM EDTA
10% Glycerol
Before use add protease inhibitor (PI) and 0.1-0.5 mM TCEP

4. AFC buffer

30 mM Tris-HCl (pH 7.9)
150 mM NaCl
0.1% detergent
Before use add PI and 0.1-0.5 mM TCEP

5. TEV cleavage buffer

30 mM Tris-HCl (pH 7.9)
150 mM NaCl
0.2 mM EDTA
0.1% detergent
Before use add PI and 0.1-0.5 mM TCEP

6. Calmodulin binding buffer

30 mM Tris-HCl (pH 7.9)
150 mM NaCl
2 mM CaCl2
0.1% detergent
Before use add PI and 0.1-0.5 mM TCEP

7. Calmodulin wash buffer

30 mM Tris-HCl pH 7.9
150 mM NaCl
2 mM CaCl2
0.1-0.5 mM TCEP

8. Calmodulin elution buffer

30 mM Tris-HCl (pH 7.9)
100 mM NaCl
10 mM EGTA
0.1-0.5 mM TCEP

9. Developing solution (1L)

37% Formaldehyde
30 g sodium carbonate
1000 ml distilled water

10. Digestion buffer

50 mM NH4HCO3
1 mM CaCl2

11. Wetting and Equilibration solution

70% acetonitrile (ACN) in 0.1% formic acid

12. Washing solution

100% H2O in 0.1% formic acid

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References

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Identificación de los complejos de proteínas en<em&gt; Escherichia coli</em&gt; La purificación mediante afinidad del péptido secuencial en combinación con espectrometría de masas tándem
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Babu, M., Kagan, O., Guo, H., Greenblatt, J., Emili, A. Identification of Protein Complexes in Escherichia coli using Sequential Peptide Affinity Purification in Combination with Tandem Mass Spectrometry. J. Vis. Exp. (69), e4057, doi:10.3791/4057 (2012).More

Babu, M., Kagan, O., Guo, H., Greenblatt, J., Emili, A. Identification of Protein Complexes in Escherichia coli using Sequential Peptide Affinity Purification in Combination with Tandem Mass Spectrometry. J. Vis. Exp. (69), e4057, doi:10.3791/4057 (2012).

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