Hollow mikro-baserede sensor for Multiplexed Transdermal Elektrokemisk Sensing

Summary

Denne artikel indeholder oplysninger om opførelse af en multiplex mikronål-baserede sensor. Indretningen bliver udviklet til in situ prøveudtagning og elektrokemisk analyse af flere analytter i en hurtig og selektiv måde. Vi forestiller klinisk medicin og biomedicinsk forskning anvender for disse mikro-baserede sensorer.

Abstract

Udviklingen af ​​en minimalt invasiv multiplex overvågningssystem for hurtig analyse af biologisk relevante molekyler kunne tilbyde personer, der lider af kroniske medicinske tilstande facile vurdering af deres umiddelbare fysiologiske tilstand. Desuden kunne det tjene som et forskningsværktøj til undersøgelse af komplekse, multifaktoriel medicinske tilstande. For en sådan multianalyte sensor skal udnyttes, skal det være minimalt invasiv, prøveudtagning af interstitielt fluid skal forekomme uden smerte eller skade på brugeren, og analyse skal være hurtig og selektiv.

Oprindeligt udviklet til smertefri lægemiddeladministration, er mikronåle blevet anvendt til at levere vacciner og farmakologiske midler (fx insulin) gennem huden. ^1-2 Da disse indretninger åbne interstitielle rum kan mikronåle, der er integreret med mikroelektroder anvendes som transdermal elektrokemiske sensorer. Selektiv detektering af glucose, glutamat, lactat, hydrogen peroxid og ascorbinsyre er blevet demonstreret ved hjælp af integrerede mikronål-elektrodeanordninger med carbonfibre, modificerede carbon pastaer og platin-coatede polymer mikronåle, der tjener som transducerende elementer. ^3-7,8

Dette mikro-sensor-teknologi har muliggjort en ny og sofistikeret analytisk tilgang til in situ og samtidig påvisning af flere analytter. Multipleksing giver mulighed for at overvåge komplekse mikromiljøer, som ellers er vanskelige at karakterisere en hurtig og minimalt invasiv måde. For eksempel kunne denne teknik anvendes til samtidig monitorering af ekstracellulære niveauer af glucose, lactat og pH ^9, som er vigtige metaboliske indikatorer af sygdomstilstande ^7,10-14 (f.eks cancerproliferation) og anstrengelsesudløst acidose. ¹⁵

Protocol

1. Mikro Fabrication

1. Brug tre-dimensionel modellering software Solidworks (Dassault Systemes SA, Velizy, Frankrig), designe en pyramideformet-formet hul mikronålarray (figur 1). ^3-5
2. Design en støtte struktur for mikronålarray bruge magi RP 13 software (Materialise NV, Leuven, Belgien). Bærestrukturen tillader harpiksen at dræne fra indretningen under fremstilling og tilvejebringer en base, hvor mikronålene er bygget. Et eksempel bærestruktur er vist i figur 1.
3. Det er forbundet støtte og mikronålarray filer er uploaded til Perfactory RP software (EnvisionTEC GmbH, Gladbeck, Tyskland), der styrer produktionsprocessen. Inden for denne softwarepakke, skal du vælge antallet af mikronålen arrays skal fremstilles og bestemme placeringen af ​​enheder på fabrikation pladen.
4. Kør kalibrering ultraviolet tilstand ved 180 mW til Perfactory hurtig prototyping fremstilling systemet og kontrollere afvigelsen i energi er indenfor ± 2 mW.
5. Når fremstillingen er afsluttet, fjernes mikronålen arrays fra grundpladen og udvikle sig i isopropanol i 15 minutter. Tørre arrays med komprimeret luft og hærde mikronåle ved stuetemperatur i 50 sekunder i Otoflash Postcuring System (EnvisionTEC GmbH, Gladbeck, Tyskland) for at sikre fuldstændig polymerisation.
6. Valider mikro fabrikation via mikroskopi og kontrollere, at hver enkelt mikro hul er hul og uhindret. Fuldt færdige mikronåle er vist i figur 2.

2. Fabrikation af Carbon Sæt Elektrode Arrays

1. Anvende en 60 W Model 6,75 CO ₂ raster / vektor lasersystem (Universal Laser Systems, Inc., Scottsdale, AZ) for at lave huller og blotlægge underliggende individuelt adresserbare forbinder kobbertråde i en flad fleksibel ledning (21.039 til 0249), der var opnået fra en kommerciel kilde (Molex Connector Corp, Lisle, IL) (figur 3 (A og B)). Læg de flade fleksible kabler i en jig til korrekt tilpasse dem på laserablation pladen. Anvende en rastering fremgangsmåde til at skabe 500 um diameter hulrum i den isolerende del af det fleksible kabel. Mønstre til ablation er skabt i CorelDraw (Corel, Ottawa, Ontario) og sendt til laser systemet.
2. Rengør modificerede flade fleksible kabler med en airbrush der sprøjter acetone ved 40 psi. Slut rense dem ved skylning med isopropanol og deioniseret vand. Kontroller under et mikroskop, der ikke isolerende film forbliver over de udsatte kobberstrimlerne.
3. Det næste trin er at oprette et holdingselskab hulrum til pakning af kulstof pastaer. Melinex tape (0,002 "tykkelse overtrukket på én side med et trykfølsomt acrylisk adhæsiv) er ablateres med det samme mønster som de elektrodestrimler, indrettet i det ablaterede elektrodestrimler og komprimeres ved 3000 psi i 2 minutter for at sikre en korrekt forbindelse. I denne CASE, hulrummet diameter 750 um.
4. Et ekstra lag af Melinex tape (0,004 "tykkelse coatet på begge sider med et trykfølsomt acrylklæbemiddel) efterfølgende poleres i det samme mønster som enkeltsidet klæbebånd og anvendes efter justering til at binde mikronålen arrays til carbon pasta elektrode-arrays .

3. Syntese af funktionelle Carbon pastaer og pakning af Elektrode Huller

1. Glucose følsomme carbon pasta baseret ud fra en tidligere opskrift og opnås ved at blande 10 mg glucoseoxidase og 2,2 mg poly (ethylenimin), indtil en homogen blanding er opnået. ¹⁶ Til denne blanding 60 mg rhodium på carbon pulver ( 5% nyttelast) tilsættes. 40 mg mineralolie tilsættes og blandes derefter. Pastaerne opbevares ved 4 ° C indtil anvendelse, pastaerne anvendes op til en uge efter fremstilling.
2. Den pH-følsomme carbon pasta fremstilles ved blanding 30% (vægt / vægt) mineralolie og 70% (w / w) grafit powder. Pak indsæt ind i elektroden hulrum som beskrevet i afsnit 3,4. Gør opløsning af 10 mM Fast Blue RR diazoniumsaltet (4-benzoylamino-2 ,5-dimethoxybenzenediazonium chlorid hemi (zinkchlorid) salt) i 0,5 M phosphorsyre. ^17, anbringes en 20 ul dråbe af denne opløsning over den pakkede pasta elektrode 30 minutter til spontant chemisorb Fast Blå PR diazoniumsalt. Skylles med deioniseret vand og opbevares i buffer eller deioniseret vand, når den ikke er i brug.
3. Lactat følsomme carbon pasta baseret ud fra en tidligere opskrift og opnås ved at blande 2,5 mg rhodium på carbon pulver og 2,5 mg lactatoxidase, skiftevis mellem 5 minutter ved sonikering og 5 minutter ved hvirvelbehandling i fem omdrejninger. ¹⁸
4. Pakning af de modificerede pastaer i den fremstillede flade fleksible kabel opnås ved at anvende de respektive pastaer over elektrodestrukturerne hulrum. Ved hjælp af et tyndt stykke af plast (f.eks en kant af et plastmateriale vejer båd) som en murske og pakning than indsætte indtil en glat overflade opnås. Gentag med en anden ren vejebåd indtil overskydende pasta er fjernet. Vaskes med deioniseret vand. En skematisk fremstilling af laser ablation at skabe hulrum, pakning af kulstof-pastaer, og mikro-integration (beskrevet i afsnit 2 og 3) er præsenteret i figur 3.

4. Detection og sensor kalibrering

1. Lactat detektering opnås ved at måle chronoamperometric reaktion af sensoren ved -0,15 V og registrere det aktuelle efter 15 sekunder i 0,1 M phosphatpuffer (pH = 7,5). Figur 4 (a) indeholder en skematisk afbildning af elektrokatalytiske reaktion til detektion af lactat .
2. Glucose detektering udføres på en lignende måde ved at måle chronoamperometric reaktion af sensoren ved -0,05 V og registrere det aktuelle efter 15 sekunder i 0,1 M phosphatbuffer (pH 7,0). Figur 4 (b) indeholder en skematisk afbildning af elektrokatalytiske reaktion i detection af glucose.
3. pH overvåges ved at køre cykliske voltametriske scanninger fra -0,7 V til 0,8 V ved 100 mV / s, og registrering af placeringen af ​​den oxidative spidsspænding. En skematisk gengivelse af de redoxreaktioner til pH detektering er vist i figur 5.
4. Kalibreringskurver for glucose og lactat sensorer kan skabes ved successive tilsætninger af den respektive analytten chronoamperometric målinger udføres efter hver analyt tilsætning som beskrevet i afsnit 5.1 og 5.2. Alternativt kan faste potentielle chronoamperometric målinger foretages under omrøring samtidig med at tilstrækkelig tid (ca. 10-100 sekunder) i mellem hver analyt Ud for den nuværende stabilisering.
5. pH kalibreringskurver kan skabes ved at måle positionen af ​​det oxidative spidsspænding over en række af kendte pH-værdier fra 5 til 8 1,0 pH-enhed trin og registrere cykliske voltammogrammer som beskrevet i afsnit 5.3.

5. Repræsentant Resultaterne

Når der skal opnås chronoamperometric kurver (fx for glukose detektion eller laktat detektion) i rolige løsninger med modificeret kulstof indsæt-fyldt mikronåle, vil den aktuelle umiddelbart falde efter ansøgning fra den pågældende afsløring potentiale. Det vil til sidst nedbrydes til en stabil tilstand værdi. Et repræsentativt resultat er vist i figur 6, hvilket resultat blev opnået fra 2 mM tilsætninger af lactat og registrering på lactat mikronålen. Opløsningen skal kort omrøres efter hver laktat tilsætning. Den aktuelle efter 15 sekunder stiger ved forøgelse af koncentrationen af ​​lactat; den aktuelle reaktion kan derefter anvendes til at bestemme koncentrationen af ​​lactat i en ukendt opløsning. Alternativt kan kontinuerlig overvågning kan anvendes i en omrørt opløsning (eller i en flydende opløsning) som vist for en opløsning med en stigende glucosekoncentration (figur 5). Igen, forøgelse i strøm ved forøgelse tHan koncentrationen af ​​glucose kan anvendes til at standardisere glucose reaktion på en ukendt løsning. Tilstrækkelig tid skal tillades efter hver pig med henblik på at tillade opløsningen at stabilisere. Cykliske voltammogrammer på pH-følsomme mikronålen i 0,1 M phosphatbuffer, er vist i fire forskellige pH-løsninger fra 5 til 8 i en pH-enhed trin i figur 6. De oxidative spidsspænding skift med stigende pH, dette fænomen anvendes som en indikator af pH-værdien.

Figur 1. Billeder af STL fil af mikronålarray oprettet i Solidworks (A) og af trykket skærmen, som viser bærestrukturen (B).

Figur 2. SEM af mikronålarray (A) og en enkelt mikronål i denne række (B).

Figur 3. Skematisk af flade, fleksible kabler. De involverede trin omfatter at modificere den faste fleksibelt kabel (A), ablatere de mønstrede cirkler (B), tilsætning af først ablateres Melinex lag, som er fyldt med kulstof pasta (C), såvel som at tilsætte det andet ablateret Melinex lag og parre mikronålarray (D). Klik her for at se større figur .

Figur 4. Kalibrering af lactat-følsom pasta med 15 sekunders chronoamperometric scanninger på -0,15 V i 0,1 M phosphatpuffer (pH = 7,5). Hver stigning i aktuelle svarer til en 2 mM tilsætning af lactat.

Figur 5.

Figur 6. Cyklisk voltammogram (CV) af pH-følsomt carbon indsætte i 0,1 M phosphatpuffer med pH 5-8 i 1 pH-enhed trin (TEAL = pH 8,0, grøn = pH 7,0, lilla = pH 6,0, rød = pH 5,0). En femte CV blev anvendt til analyse versus Ag / AgCl reference og Pt-tråd modelektroder.

Discussion

Flere aspekter af udformningen af ​​denne mikronålen-baserede sensor blev anset før enhed fabrikation. For at kunne bruge denne sensor for real-time detektering, skal responstiden for sensoren være lav, i denne protokol, udstillet hver testet sensor en responstid under femten sekunder. Indsætter benyttes i denne protokol blev også valgt for deres selektivitet i in vivo-miljøer, som indeholder elektroaktive biomolekyler, der kan forstyrre elektrode svar. Ud over pastasammensætning blev drift potentialer valgt for at minimere indflydelsen af ​​interfererende elektroaktive. Vellykket fremstilling af mikronålarray involverer udvælgelse af en egnet mikronål design og mikro materiale. Disse to aspekter vil afgøre, om mikronålen kan punktere huden, beskytte elektroderne mod fysisk beskadigelse, og udelukker elektrode-væv kontakt. Det skal bemærkes, at en ekstern Ag / AgCl og Pt referererskab og modelektroderne blev anvendt under målingerne, in vivo anvendelse af denne anordning med humane eller animalske patienter ville kræve, at disse elektroder inkorporeres i indretningen.

Hver komponent af mikronålen-baserede sensor har funktioner, der skal valideres for at sikre korrekt funktion. Kvalitetskontrol under modifikation af den flade fleksible kabel (figur 3B) involverer at sikre, at det isolerende lag er fuldstændigt fjernet fra overfladen af fortinnede kobbertråde efter laserablation (figur 3). Manglende fjernelse af isolerende lag fra overfladen af ​​kobbertråden efter laserablation kan forårsage uregelmæssige reaktioner på grund af ufuldstændig elektrisk kontakt. Laser-ablateret Melinex tape skal undersøges med et mikroskop for at sikre, at diameteren af ​​hver åbning er i overensstemmelse med den definerer det arbejdsområde af elektroden. Ved anvendelse af kulstof masse på laser-ablaterede Melinex tape hulrum,pastaen bør svare til den nøjagtige huldiameteren uden overskud for at undgå signal variationer på grund af forskelle i overfladeareal. Under chronoamperometric målinger med modificerede carbonatomer pastaer, skal signalet stabilisere en begrænsende værdi, før strømmen registreres. Disse resultater kan variere lidt på grund af blandings-virkninger. Mekanisk testning af mikronålen arrays blev udført forud for sensoren inkorporering, i en tidligere undersøgelse, vores gruppe udviste disse arrays var i stand til at punktere svinehud, som blev anvendt som en analog til human hud ³ mikronål arrays ikke undergår deformation eller brud under transport. hudpenetreringshjælpemidler, da disse processer kan føre til elektroden beskadigelse.

Denne protokol er beskrevet konstruktionen af ​​en ny transdermal indretning til elektrokemisk overvågning. Vi forestiller den fremtidige indsats med mikro-sensorer med et endnu større antal individuelt adresserbare mikronålene og et større udvalg af transducers. Denne indretning blev udviklet til analyse af interstitielvæske hos mennesker; anvendelse med dyr, er også mulig med passende species-specifikke modifikationer mikro design. Fremtidige retninger med denne teknologi, indbefatter, men er ikke begrænset til den fjerntliggende patientovervågningssystem samt kobling med en medikamentleveringsindretning til automatiseret sensing-drug delivery.