Summary
Förster resonans (FRET) mikroskopi er en kraftfuld teknik til real-time overvågning af signalering begivenheder i levende celler ved hjælp af forskellige biosensorer som reportere. Her beskriver vi, hvordan man opbygger et tilpasset epifluorescens FRET imaging system fra kommercielt tilgængelige komponenter, og hvordan man bruger det til FRET eksperimenter.
Abstract
Förster resonans (FRET) mikroskopi fortsætter med at vinde stigende interesse som en teknik til real-time overvågning af biokemiske og signalere begivenheder i levende celler og væv. Sammenlignet med klassiske biokemiske metoder, er denne nye teknologi kendetegnet ved høj tidslig og rumlig opløsning. FRET forsøg bruge forskellige genetisk kodede biosensorer, som kan udtrykkes og afbildet over tid in situ eller in vivo 1-2. Typiske biosensorer kan enten rapportere protein-protein-interaktioner ved at måle FRET mellem en fluorofor-mærket par proteiner eller konformationelle ændringer i et enkelt protein, der huser donor-og acceptor-fluoroforer indbyrdes forbundet med en bindingsdel til et molekyle af interesse 3-4. Bimolekylære biosensorer for protein-protein interaktioner indbefatter for eksempel, konstruktioner designet til at overvåge G-protein-aktivering i celler 5, mens de unimolekylær sensorer meaSuring konformationelle ændringer er almindeligt anvendt til billede second messengers, såsom calcium 6, cAMP 7-8, inositolphosphater 9 og cGMP 10-11. Her beskriver vi, hvordan man opbygger et tilpasset epifluorescens FRET imaging system fra enkelte kommercielt tilgængelige komponenter og hvordan du kan styre hele opsætningen ved hjælp af Micro-Manager freeware. Denne enkle, men kraftfulde instrument er designet til rutinemæssige eller mere sofistikerede FRET målinger i levende celler. Erhvervede billeder behandles ved hjælp af selvstændig skriftlig plug-ins til at visualisere ændringer i FRET forhold i real-tid under alle eksperimenter, før de lagres i et grafikprogram format kompatibelt med den indbyggede ImageJ freeware anvendes til efterfølgende dataanalyse. Dette billige system er kendetegnet ved høj fleksibilitet og kan med succes anvendes til at overvåge forskellige biokemiske begivenheder og signaleringsmolekyler af et væld af tilgængelige FRET biosensorer i levende celler og væv. Som et eksempel udviser vi how at bruge denne afbildningssystem til at udføre tidstro overvågning af cAMP i levende 293A-celler ved stimulering med en β-adrenerg receptoragonist og blokker.
Protocol
1. Opsætning af en FRET Imaging mikroskop
I princippet kan en inverteret fluorescensmikroskop, som er tilgængelig i laboratoriet og har et kamera port tilpasses til FRET billeddannelse. Den endelige setup skal indeholde følgende vigtige komponenter: et mikroskop, en lyskilde med eller uden yderligere lukker, en bjælke-splitter for emission lys og en CCD-kamera (se figur 1). De hardwareenheder, især den lyskilde, lukkeren og kameraet er integreret i og styret af imaging software, som giver billedet erhvervelse og analyse. Nedenfor beskrives en fremgangsmåde til at samle et simpelt FRET-system fra kommercielt tilgængelige komponenter.
- Tilslut din lyskilde til mikroskopet. For eksempel bruger en enkelt bølgelængde light emitting diode (CoolLED P E-100, 440 nm), som selektivt ophidser forbedret cyan fluorescerende protein (CFP), der anvendes som donor i de fleste FRET biosensorer. Det kan være direktely og let kan forbindes med epifluorescens belysning port af mikroskopet. Der er også multi-bølgelængde LED'er til rådighed, som kan forbindes på en tilsvarende måde. I stedet for LED, andre standard lyskilder såsom XBO75 xenon arc lamp (ofte til Olympus og Zeiss mikroskoper) eller HBO kviksølvlampe (normalt installeret på Nikon mikroskoper) kan anvendes. I tilfælde af et lysstofrør, skal du også placere en lukkertid mellem lampen og belysning port for at aktivere software-assisteret styring af excitationslyset kommer på din prøve. CoolLED kræver ingen yderligere lukker da det kan direkte slås til og fra af softwaren. Ulempen ved de ensfarvede LED-systemer er et begrænset antal excitationsbølgelængder, mens et lysstofrør med forskellige filtersæt er en mere fleksibel løsning, især når der arbejdes med flere og bimolekylær biosensorer. Alternativt kan monokromator lyskilder (f.eks Polychrome V, TILLPhotonics) væreanvendes, de normalt har en integreret lukker som kan være software-styret via en trigger signal.
- Placer en passende filter terning i mikroskopet. For rutine FRET målinger med den fælles fiskeripolitik og øget gult fluorescerende protein (YFP) eller nogen af deres varianter som et FRET-par, vi bruger et simpelt filter terning med en ET436/30M excitationsfilter (som kan udelades, når LED bruges, men er uundværlig når der anvendes en xenon eller kviksølvlampe i stedet LED) og en DCLP455 dichroisk spejl. Mikroskopet bør også være udstyret med en målsætning egnet til en god opløsning fluorescensmikroskopi, for eksempel med en plan-fluor, plan-neofluar eller plan-apochromat 40x, 60x eller 100x olie-fordybelse mål.
- Tænd for fluorescerende lys og kontrollere, om lyspletten er jævnt fordelt over synsfeltet. Hvis dette ikke er tilfældet, er yderligere tilpasning af LED eller en lygte, der kræves for at opnå den optimale belysning af prøven. Dette kan være udøvetwith ved hjælp af de skruer, hvilken position diode eller lampen i rummet.
- Tilslut beam-splitter via en C-mount til en af mikroskopets emission porte. For eksempel bruge DV2 DualView (Photometrics), der opsplitter emissionslyset i to (donor og acceptor) kanaler, som kan samtidigt overvåges på en enkelt CCD-kamera-chippen. Alternativt er der andre lignende produkter, såsom Optosplit (Cairn Research) eller en stråleseparator integreret i Hamamatsu ORCA-D2 dobbelt bølgelængde kamera. For den fælles fiskeripolitik / YFP FRET par, vi bruger 05-EM filtrerer sat indeholdende 505dcxr dichroiske spejl plus ET480/30M og ET535/40M emission filtre til den fælles fiskeripolitik og YFP henholdsvis som følger med DV2. I stedet for en bjælke-splitter, to filter kuber for donor (indeholdende den ET436/30M excitationsfilter for fælles fiskeripolitik, DCLP455 dikroisk spejl og den fælles fiskeripolitik emission filter) og acceptor (indeholdende den fælles fiskeripolitik excitationsfilter, DCLP455 og YFP emission filter) kanaler anvendes iMange FRET-systemer. Alternativt kan et filter terning uden emissionsfilter og en automatisk emissionsfilter hjulstilling inden kameraet skal installeres. I dette tilfælde til en motoriseret mikroskop eller filterhjulet skifter mellem de to emissionsfilter positioner i ~ 200-300 msek udføre ratiometrisk billeddannelse. Denne lille forsinkelse er acceptabel, når billeddannelse ret langsom intracellulære processer, såsom cAMP-signaler, hvor der virkelig samtidige erhvervelse af begge kanaler er ikke kritisk.
- Tilslut CCD-kameraet (brug for eksempel ORCA-03G eller ORCA-R2 fra Hamamatsu Photonics) til stråledeleren. Brug et FireWire-kabel til at slutte kameraet til IEEE1394 computer interface, som beskrevet i vejledningen, der fulgte med kameraet. Installer kamera drivere uden at tænde for kameraet.
- Endelig, for at etablere kommunikation mellem computeren og lyskilden, skal du tilslutte Arduino I / O-kortet (brug for eksempel Arduino Duemilanove eller Arduino Uno) til LED eller to lukkeren ved hjælp af et BNC-kabel, som skal indeholde en normal BNC stik på LED side og to enkelt ledninger på den anden ende forbindes til ben GND (0) og 8 i bestyrelsen som vist i figur 2. Den samlede bestyrelse kan tilsluttes direkte til en USB-port på computeren.
2. Opsætning af Imaging Software
For at kontrollere og synkronisere lyskilden med billedoptagelse af kameraet, skal imaging software er installeret på computeren. Der er flere kommercielt tilgængelige softwarepakker, herunder MetaFluor (Molecular Devices), Slidebook (Intelligent Imaging Innovations), VisiView (Visitron Systems). Her har vi demonstrere brugen af open source Micro-Manager freeware som tilbyder en høj grad af fleksibilitet for billig billeddannelse.
- Hent denne software på http://valelab.ucsf.edu/ ~ MM / MMwiki / index.php / Micro-Manager_Version_Archive. Vi anbefaler at installere den 1.4.5 release, som er let konfigureres i vores hænder.
- Slut Arduino bord til en USB-port på din computer. Download softwaren til at styre Arduino bord fra http://www.arduino.cc/en/Main/software . Følg anvisningerne på denne hjemmeside og køre denne software bare én gang før start Micro-Manager. Upload en kode for brug af tavlen med Micro-Manager-softwaren. Koden kan downloades på http://valelab.ucsf.edu/ ~ MM / MMwiki / index.php / Arduino .
- Tænde LED og kameraet. Start softwaren og konfigurere Micro-Manager kommunikation med kameraet og LED (anden lyskilde og lukkeren) ved at vælge Funktioner> Hardware Configuration Wizard (se figur 3). Tilføj de nødvendige komponenter, herunder dit kamera(Dvs. Hamamatsu_ DCAM) og Arduino Board (tilføje Arduino-Switch, Arduino-Hub og Arduino-Shutter-enheder). I løbet af de næste skridt, bruge standardindstillingerne foreslået af guiden. Gem det nye system konfiguration, når du bliver bedt om af guiden.
- Brug hovedmenuen for at åbne Værktøjer> Device Property Browser. Rul ned til "Arduino Switch stat" og vælg "1". Luk dialogen. Sørg for, at "auto-lukker"-boksen er markeret i den vigtigste software dialogen. Tryk File> Save System State at gemme software konfiguration, som skal åbnes når som helst efter start af softwaren. Dette vil etablere kommunikationen mellem bestyrelsen og den nødvendige software for at udføre billedoptagelse.
- Tryk på "Live"-knappen for at overvåge signalet, der kommer fra kameraet. Sørg for, at fluorescerende lys går på hvilket som helst tidspunkt "Live" eller "Snap"-funktionen er valgt. Før du starter de første målinger, skal du følge instruktionerne til din stråledeler til prdannelse af den optiske justering af begge kanaler.
3. Cell Kultur og Transfektioner
- Fremstilling af 6-brøndsplader med autoklaverede runde 24 mm glas coverslides (1 coverslide per brønd). Alternativt kan glas-bund celle-dyrkningsskåle anvendes.
- Plade 293A-celler på pladerne eller tallerkener i D-MEM-medium (suppleret med 10% FCS, 1% L-glutamin og 1% penicillin / streptomycin-opløsning), således at cellerne nå 50-70% sammenflydning efter en dag.
- 24 timer efter udpladning, transficere cellerne i en laminar strømning bænk med en FRET sensor plasmid anvendelse af calciumphosphat-transfektionsmetode (se 3.5). cAMP biosensor plasmider kan opnås fra vores gruppe efter anmodning. Læseren henvises også til de omfattende vurderinger 7,8 beskriver andre tilgængelige cAMP biosensorer.
- Før transfektion af celler for første gang, forberede transfektionsreagenser. Udgør en 2,5 M CaCl2 og 2xBBS opløsninger (sidstnævnte indeholder1,5 mM Na 2 HPO 4, 50 mM BES, 280 mM NaCI, justeret til pH 6,95 med NaOH) i deioniseret vand. Sterilt filtrat opløsningerne ved anvendelse af en almindelig 0,2 um filter.
- At transficere en 6-brønds plade eller 6 glas-bund retter, blandes 10 ug af FRET sensor plasmid, 50 pi 2,5 M CaCl2-opløsning og sterilt vand op til 500 pi. Bland godt.
- Der tilsættes 500 pi 2 x BBS. Bland grundigt og inkuber blandingen i 10 minutter ved stuetemperatur.
- Afpipetteres 165 ul af transfektion blandingen dråbevis på hver brønd eller skål. Blidt røre pladen og sæt den tilbage i inkubatoren. Celler er normalt klar til FRET målinger 24 timer efter transfektion. At sikre, at cellerne ikke har nået konfluens på dette tidspunkt, da dette kan påvirke aktiviteten af flere celleoverfladereceptorer.
4. FRET Målinger i levende celler
- Før måling for første gang, forberede FRET puffer indeholdende 144 mM NaCl, 5,4 mM KCI, 1mM MgCl2, 2 mM CaCl2, 10 mM HEPES i deioniseret vand, og pH justeres til 7,3 med NaOH. Fortynd forbindelserne, der skal bruges i dine imaging eksperimenter med FRET-puffer.
- Start imaging software. Indlæs tidligere defineret systemets konfiguration. Vælg File> Load System State at vælge den tidligere konfigurerede systemets tilstand.
- Monter en coverslide med adhærente transficerede 293A celler i imaging kammer (f.eks Attofluor cellekammer). Vask cellerne en gang med FRET-puffer, og der tilsættes 400 pi af FRET puffer. Når der anvendes glas-bund celle-dyrkningsskåle vaskes de adhærente celler, og der tilsættes 2 ml puffer pr skålen. Vi udfører alle målinger ved stuetemperatur i FRET puffer indeholdende HEPES, således at ingen CO2 kontrol er nødvendig.
- Sæt nogle immersionsolie på mål og overføre den billeddannende kammer på mikroskopet. Fokus på cellelaget med gennemlysning lys.
- Tænd for fluorescerende Light ved at trykke på "Live"-knappen, og vælg en celle til eksperimentet. Vælg en celle med en optimal sensor udtryk, hvilket betyder, at det bør være ikke alt for lyse og ikke for svagt. Efter at have fundet en egnet celle, skal du slukke fluorescerende lys øjeblikkeligt for at undgå fotoblegning af FRET sensoren.
- Juster eksponeringen tid under "Kameraindstillinger" (normalt 10-50 msek) på en måde, der fører til et godt signal-til-støj-forholdet for den erhvervede billede efter at have trykket på "Snap"-knappen. For lange excitation gange kan resultere i fotoblegning, men for kort tid resulterer i ringe billedkvalitet.
- Tryk på "Multi-D Acq." knappen og indstille antallet af tidspunkter og tidsintervallet for billedoptagelse. For vores cAMP-FRET sensor, erhverver vi et billede hver 5 sek.
- Start målingerne ved at trykke på "Acquire" knappen.
- Under en måling, kan man bruge "FRET online" plug-in (tilgængelig i online-tillægget, skal alle plug-ins være betjentIED ind i "plugins" mappe på din Micro-Manager software, før du starter den) at overvåge FRET gearskift online. Kør denne plug-in, og vælg en region af interesse i FRET forholdet billedet ved hjælp af "Freehand valg" værktøj. Tilføj regionen i ROI manager og tryk på "Få gennemsnitlige" knappen i "Time-serien analysator" vinduet. FRET-forholdet spor vises. For at opdatere spor under målingen, skal du køre "FRETratioOnline2" plug-in og tryk på "GetAverage" knappen.
- Så snart FRET forholdet har nået en stabil basislinje anvender den ønskede forbindelse ved nøjagtig pipettering den i skålen / kammeret. At behandle celler med farmakologiske forbindelser, kan et perfusionssystem stedet for simpel pipettering anvendes på nuværende tidspunkt.
- Efter endt eksperimentet, gemme time-lapse stak billeder. Fjern målekammeret fra mikroskopet og rense målet ved hjælp af en objektiv væv.
- Gå tilbage til trin 4,3 for at gentage målingen med enny prøve.
5. Offline Data Analysis
FRET billeddata kan analyseres offline til enhver tid efter forsøget med ImageJ software. Som supplement til denne protokol, giver vi den "FREToffline" plug-in, der anvendes i vores laboratorium for at opdele de erhvervede billeder ind donor og acceptor-kanaler og måle fluorescerende intensiteter i flere områder af interesse. Disse intensiteter kan endvidere være kopi-indsat i et Excel eller Origin regneark til at beregne den korrigerede FRET forholdet. At visualisere FRET ændringer i unimolekylær biosensorer, er enkel ratiometry anvendes ofte. I dette tilfælde er det kun donorfluoroforen (CFP) spændt, og to billeder er taget FFP og YFP emissionstoppe. Den beregnede YFP / CFP-forhold (undertiden også betegnet som FRET / CFP-forhold) repræsenterer graden af FRET mellem de to fluorophorer. I unimolekylær biosensorer, er antallet af FFP og YFP-dele lige, således at den simple ratiometry er tilstræktilstrækkelig til at repræsentere FRET effektivitet 12.
- Brug ImageJ software til at åbne eksperimentet fil ved at vælge Plugins> Micro-Manager> Open Micro-Manager File.
- Kør "FREToffline" plug-in der opsplitter time-lapse stakken ind individuel fælles fiskeripolitik og YFP kanaler.
- Hvis baggrundskorrektion er påkrævet, kan dette udføres under anvendelse ImageJ software.
- Klik på den YFP stak af billederne og vælge en eller flere regioner af interesse ved hjælp af "Freehand valg" værktøj og tilføje dem til "MultiMeasure" plug-in vindue ved at trykke på knappen "Tilføj".
- Vælg de regioner interesser i "MultiMeasure" vinduet og tryk på "Multi" for at få en tabel med gennemsnitlige grå værdier for hver ramme og hver region. Kopier data til klippebordet ved at vælge alle med Ctrl + A og ved at trykke på Ctrl + C. Åbne en Excel eller Origin regneark og indsætte dataene ved at trykke på Ctrl + V.
De målinger, der udføres af programmet kan konfigureres under Analyse> Indstil M easurements hvor du kan definere de parametre, der skal måles. Vi plejer kun vælge "Mean grå værdi" i denne dialogboks. - Klik ind på den fælles fiskeripolitik stak billeder. Udfør den samme som beskrevet i 5.5. Indsæt den fælles fiskeripolitiks intensitet data i den samme Excel eller Origin regneark.
- Brug Excel eller Origin software, er den korrigerede FRET forholdet beregne. Når simple enkeltkædede unimolekylær biosensorer afbildes, vi korrekte Kun for bleedthrough af donorfluorescensen i acceptor-kanalen. I dette tilfælde er den korrigerede acceptor / donor-forhold:
Ratio = (YFP - B x FFP) / CFP
Hvor B er korrektionsfaktoren, som kan bestemmes ved transfektion af celler med FFP plasmid og måle en procentdel af donorfluorescensen i YFP kanal (B = YFP / CFP). Udelade denne korrektion for unimolekylær biosensorer er mulig, da det blot ville påvirke den samlede amplitude af FRET respons uden nogen kvalitativ indflydelse på formen af kurven.
Figur 1 viser et eksempel på et fuldstændigt samlet FRET billeddannende opsætning bestående af et Nikon inverteret mikroskop, CoolLED, DV2 DualView og Hamamatsu ORCA-03G CCD-kamera. At fastslå kommunikationen mellem hardware-komponenter og computeren, er I / O Arduino board tilsluttet til computeren og til CoolLED som vist i figur 2. For at styre lyskilden og billedoptagelse af kameraet på en synkron måde, Micro-Manager software skal være installeret og konfigureret korrekt (se figur 3). Dette freeware kan nemt tilpasses til individuelle eksperimentelle behov ved at tilføje nødvendige plug-ins. 4A viser en repræsentativ rå FRET forholdet spor fra en måling ved hjælp af cAMP sensor Epac1-lejre 13 udtrykt i 293A-celler til at overvåge virkningerne af β-adrenerg agonist isoproterenol anvendt på tidspunkt 150 sek og den & væddea,-blokker propranolol tilsættes på tidspunktet 300 sek (udført som beskrevet i 4,3-4,10). Disse data kan analyseres offline og korrigeret for bleedthrough af FFP i YFP-kanalen som beskrevet i 5,1-5,7 for at opnå den korrigerede FRET forholdet spor vist i figur 4B. Dette repræsentativt eksperiment viser et langsomt fald i den overvågede FRET-forholdet efter isoproterenol behandling, som angiver en forøgelse af intracellulær cAMP. Propranolol som en β-blokker vender isoproterenol signal, hvilket fører til et fald af cAMP til basale niveauer. Disse ændringer i FRET-signalet kan overvåges online under eventuelle forsøg (som beskrevet i 4.9). Sådanne eksperimenter kan udføres med en række almindeligt anvendte biosensorer til formål at overvåge forskellige sekundære budbringere eller biokemiske processer.
Fig. 1. Indretning af FRET billeddannende opsætning bestående af en CoolLED, ikonverteres Nikon mikroskop DV2 DualView, og ORCA-03G CCD kamera.
Figur 2. Arduino I / O-kortet og dens forbindelser. Brættet er placeret i en selvstændig monteret plastboks. En standard BNC-kabel forbinder LED til stifterne 8 og GND (0) af bestyrelsen.
Figur 3. Screenshots viser integration af systemet komponenter ved hjælp af hardware konfigurationsguiden. A) Start Hardware konfigurationsguiden. B) Tilføj de påkrævede anordninger som nævnt i 2,3. Klik her for at se større figur .
Figur 4. En repræsentant FRET eksperimenterendet som måler cAMP-niveauer i 293A-celler transficeret med Epac1-lejre. Først blev celler stimuleret med β-adrenerge agonist isoproterenol (100 nM, i frame 30 eller ved 150 sek) til at øge cAMP (observeret som et fald i YFP / CFP FRET ratio). Celler blev efterfølgende behandlet med propranolol β-blokker (10 uM, på rammen 60 eller ved 300 sek), hvilket fører til en stigning i FRET ratio, afspejler et fald i cAMP. A) Raw online FRET forhold spor fra et område af interesse, der svarer til en enkelt celle overvåges under forsøget. B) berigtiget forholdet spor efter offline data-analyse udført som beskrevet i 5,1-5,7.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
i denne protokol, viser vi, hvordan man opbygger en simpel billig, men kraftig FRET imaging system til rutinemæssige applikationer med en bred vifte af tilgængelige biosensorer. Systemet præsenteres her er designet til CFP og YFP eller lignende typer fluorescerende proteiner, som donor-acceptor-par. Samtidig har andre individuelle biosensorer bliver tilgængelige som bruger for eksempel grønne og røde fluorescerende proteiner 14. At tilpasse det beskrevne system for andre farver, skal passende lyskilder og / eller filter sæt vælges. I tilfælde af LED, en anden enkelt LED line, 490 nm for eksempel at excitere grønt fluorescerende protein, kan anvendes. Single-bølgelængde lysdioder kan være let (inden for sekunder) afmonteres og udveksles. Alternativt er der LED-arrays til rådighed, som indeholder flere linjer til at vække forskellige fluorescerende proteiner (f.eks pE-2 CoolLED). At muliggøre målinger med alternative FRET par, kan andre fluorescerende filter terninger anbringes i Microsc ope, og i sidste ende emissions stråle-splitter filtre skal udveksles. Photometrics tilbyder yderligere emission filter skydere til DV2 DualView. Nogle nyligt udviklede programmer anvender to eller flere biosensorer samtidigt at overvåge flere processer på samme tid, for eksempel cAMP og cGMP sammen i en celle 15. I dette tilfælde kan en QuadView (Photometrics) indeholdende fire emissions kanaler der anvendes, den ImageJ plug-in for billedet spaltning og analyse kan derefter tilpasses til anvendelse sammen med fire kanaler og til at beregne to FRET forhold. ImageJ software er meget fleksibel med hensyn til billedanalyse og online-gengivelse af resultaterne. Simpel tekst-redigeret plug-ins tillader tilpasning af software algoritme til behovene i enhver individuel imaging system og eksperimentere. Dette er undertiden meget hjælpsomme og tilbyder hurtige løsninger på de tekniske problemer, som kan kræve lange gange, når de skal implementeres i enhver kommerciel softwarepakke.
indhold "> Når du gør FRET eksperimenter, er det afgørende at undgå fotoblegning som vises, når anslagssteder tider er for lang, eller når billederne er taget alt for ofte. I dette tilfælde kan en foton-induceret kemisk beskadigelse eller kovalente modifikationer af fluoroforer forekomme og falde FRET effektivitet. at undgå fotoblegning kan man reducere eksponeringstiden og hyppigheden af billedoptagelse. Der er også etableret protokoller 12,16 at korrigere for dette fænomen. Under dataanalyse, er det muligt at korrigere for krydstale mellem donor-og acceptorgruppen kanaler (bleedthrough). Ved anvendelse unimolekylær FRET biosensorer (i hvilket tilfælde donor-og acceptor-fluoroforer altid udtrykkes på samme niveau) til simple ratiometrisk målinger, kan det være tilstrækkeligt at korrigere blot for bleedthrough af donoren til acceptoren kanal eller endog udelade denne korrektion helt, fordi det ikke kvalitativt påvirke formen af FRET forholdet kurve. bleedthrough af the acceptor ind i donor-kanalen er normalt ubetydelig. Når bimolekylære biosensorer bestående af to forskellige proteiner anvendes, kan disse udtrykkes på forskellige niveauer. I dette tilfælde er det bleedthrough korrektion og en yderligere korrektion for den direkte YFP excitation ved 440 nm lys også tilrådeligt. Se venligst den publicerede protokol 12, hvor alle korrektionsprocedurer er beskrevet mere detaljeret. Yderligere omfattende information om udviklingen af biosensorer, FRET mikroskopi, mulige faldgruber for teknikken og om dataanalyse findes i tidligere offentliggjorte protokoller 17-18. Sammenfattende tilvejebringer enkel og effektiv afbildningssystem beskrevet her en fleksibel platform for at overvåge forskellige biokemiske begivenheder og signalmolekyler med høj tidsmæssig og rumlig opløsning i levende celler.Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Ingen interessekonflikter erklæret.
Acknowledgments
Forfatterne vil gerne takke Anke Rüttgeroth og Karina Zimmermann til teknisk bistand. Dette arbejde blev støttet af Deutsche Forschungsgemeinschaft (tilskud NI 1301/1-1 til VON) og universitetet i Göttingen Medical Center ("pro Futura" tilskud til VON).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BES Buffer Grade | AppliChem | A1062 | |
| CaCl2 dihydrate | Sigma-Aldrich | C5010 | |
| Glass coverslides | Thermo Scientific | 004710781 | Diameter 24 mm |
| Glass-bottomed cell-culture dishes | World Precision Instruments | FD3510-100 | |
| D-MEM medium | Biochrom AG | F0445 | |
| Fetal calf serum (FCS) | Thermo Scientific | SH30073.02 | |
| L-Glutamine | Biochrom AG | K0283 | |
| HEPES | Sigma | H4034 | |
| KCl | Sigma | P5405 | |
| MgCl2 hexahydrate | AppliChem | A4425 | |
| NaCl | AppliChem | A1149 | |
| Na2HPO4 | Sigma-Aldrich | S9707 | |
| Penicillin/Streptomycin | Biochrom AG | A2213 | |
| Inverted fluorescent microscope | e.g. Nikon | Request at Nikon | |
| CoolLED | CoolLED | pE-100 | 440 nm |
| DualView | Photometrics | DV2-SYS | |
| DualView filter slider | Photometrics | 05-EM | |
| CFP/YFP filter set | Chroma Technology | 49052 | without the emission filter |
| ORCA-03G camera | Hamamatsu Photonics | C8484-03G02 | |
| Arduino I/O board | Sparkfun Electronics | DEV-00666 | |
| Attofluor cell chamber | Invitrogen | A-7816 | |
| Personal computer with WindowsXP or Windows7 system | Any supplier | Include hard-drive with high capacity |
References
- Zaccolo, M. Use of chimeric fluorescent proteins and fluorescence resonance energy transfer to monitor cellular responses. Circ. Res. 94, 866-873 (2004).
- Mehta, S., Zhang, J. Reporting from the field: genetically encoded fluorescent reporters uncover signaling dynamics in living biological systems. Annu. Rev. Biochem. 80, 375-401 (2011).
- Zhang, J., Campbell, R. E., Ting, A. Y., Tsien, R. Y. Creating new fluorescent probes for cell biology. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 3, 906-918 (2002).
- Miyawaki, A. Visualization of the spatial and temporal dynamics of intracellular signaling. Dev. Cell. 4, 295-305 (2003).
- Bunemann, M., Frank, M., Lohse, M. J. Gi protein activation in intact cells involves subunit rearrangement rather than dissociation. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100, 16077-16082 (2003).
- Kotlikoff, M. I. Genetically encoded Ca2+ indicators: using genetics and molecular design to understand complex physiology. J. Physiol. 578, 55-67 (2007).
- Willoughby, D., Cooper, D. M. Live-cell imaging of cAMP dynamics. Nat. Methods. 5, 29-36 (2008).
- Nikolaev, V. O., Lohse, M. J. Monitoring of cAMP synthesis and degradation in living cells. Physiology (Bethesda). 21, 86-92 (2006).
- Tanimura, A. Use of Fluorescence Resonance Energy Transfer-based Biosensors for the Quantitative Analysis of Inositol 1,4,5-Trisphosphate Dynamics in Calcium Oscillations. J. Biol. Chem. 284, 8910-8917 (2009).
- Nikolaev, V. O., Lohse, M. J. Novel techniques for real-time monitoring of cGMP in living cells. Handb. Exp. Pharmacol. , 229-243 (2009).
- Nausch, L. W., Ledoux, J., Bonev, A. D., Nelson, M. T., Dostmann, W. R. Differential patterning of cGMP in vascular smooth muscle cells revealed by single GFP-linked biosensors. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 365-370 (2008).
- Borner, S. FRET measurements of intracellular cAMP concentrations and cAMP analog permeability in intact cells. Nat. Protoc. 6, 427-438 (2011).
- Nikolaev, V. O., Bunemann, M., Hein, L., Hannawacker, A., Lohse, M. J. Novel single chain cAMP sensors for receptor-induced signal propagation. J. Biol. Chem. 279, 37215-37218 (2004).
- Hong, K. P., Spitzer, N. C., Nicol, X. Improved molecular toolkit for cAMP studies in live cells. BMC Res. Notes. 4, 241-24 (2011).
- Niino, Y., Hotta, K., Oka, K. Simultaneous live cell imaging using dual FRET sensors with a single excitation light. PLoS One. 4, e6036 (2009).
- Palmer, A. E., Tsien, R. Y. Measuring calcium signaling using genetically targetable fluorescent indicators. Nat. Protoc. 1, 1057-1065 (2006).
- Brumbaugh, J., Schleifenbaum, A., Stier, G., Sattler, M., Schultz, C. Single- and dual-parameter FRET kinase probes based on pleckstrin. Nat. Protoc. 1, 1044-1055 (2006).
- Aoki, K., Matsuda, M. Visualization of small GTPase activity with fluorescence resonance energy transfer-based biosensors. Nat. Protoc. 4, 1623-1631 (2009).
