Summary
Forster प्रतिध्वनि ऊर्जा हस्तांतरण (झल्लाहट) माइक्रोस्कोपी जीवित कोशिकाओं में घटनाओं संकेत संवाददाताओं से के रूप में विभिन्न biosensors का उपयोग करने की वास्तविक समय की निगरानी के लिए एक शक्तिशाली तकनीक है. यहाँ हम वर्णन कैसे एक स्वनिर्धारित epifluorescence बनाने के व्यावसायिक रूप से उपलब्ध उपकरणों और कैसे इसे इस्तेमाल के लिए प्रयोगों झल्लाहट झल्लाहट इमेजिंग प्रणाली.
Protocol
1. स्थापना एक झल्लाहट इमेजिंग खुर्दबीन
सिद्धांत रूप में, किसी भी औंधा प्रतिदीप्ति सूक्ष्मदर्शी है जो प्रयोगशाला में उपलब्ध है और एक कैमरा बंदरगाह है अनुकूलित किया जा के लिए इमेजिंग झल्लाहट कर सकते हैं. एक खुर्दबीन के साथ एक प्रकाश स्रोत या बिना अतिरिक्त शटर, उत्सर्जन प्रकाश और एक सीसीडी कैमरा (चित्रा 1 देखें) के लिए एक बीम फाड़नेवाला: अंतिम सेटअप निम्नलिखित महत्वपूर्ण घटकों को शामिल करना चाहिए. हार्डवेयर उपकरणों, विशेष रूप से प्रकाश स्रोत, शटर और कैमरे में एकीकृत कर रहे हैं और इमेजिंग सॉफ्टवेयर है जो छवि अधिग्रहण और विश्लेषण की अनुमति देता है के द्वारा नियंत्रित है. नीचे हम एक व्यावसायिक रूप से उपलब्ध उपकरणों से एक सरल प्रणाली झल्लाहट को इकट्ठा करने की प्रक्रिया का वर्णन करता है.
- खुर्दबीन के लिए अपने प्रकाश स्रोत से कनेक्ट करें. उदाहरण के लिए, एक एकल तरंगदैर्ध्य प्रकाश उत्सर्जक डायोड (CoolLED p E-100, 440 एनएम) है जो चुनिंदा उत्तेजित बढ़ाया सियान फ्लोरोसेंट प्रोटीन (CFP) में सबसे अधिक एक दाता के रूप में इस्तेमाल किया biosensors झल्लाहट का उपयोग. यह प्रत्यक्ष हो सकता हैly और आसानी से माइक्रोस्कोप के epifluorescence रोशनी बंदरगाह से जुड़ा है. वहाँ भी बहु तरंगदैर्ध्य एल ई डी उपलब्ध है जो एक समान तरीके में जोड़ा जा सकता है. इसके बजाय एलईडी, अन्य XBO75 क्सीनन चाप (अक्सर ओलिंप और Zeiss सूक्ष्मदर्शी के लिए प्रयोग किया जाता है) दीपक या एचबीओ पारा दीपक (आमतौर पर Nikon सूक्ष्मदर्शी पर स्थापित) के रूप में इस तरह के मानक प्रकाश स्रोतों का इस्तेमाल किया जा सकता है. एक फ्लोरोसेंट लैंप के मामले में, आप भी दीपक और रोशनी उत्तेजना अपने नमूना पर आने वाले प्रकाश के सॉफ्टवेयर की मदद से नियंत्रण सक्षम बंदरगाह के बीच एक शटर जगह चाहिए. CoolLED किसी भी अतिरिक्त शटर की आवश्यकता नहीं है क्योंकि यह सीधे सॉफ्टवेयर के द्वारा किया जा सकता है पर और बंद स्विच करता है. एकल रंग एलईडी प्रणाली का नुकसान उत्तेजना तरंगदैर्य की एक सीमित संख्या है, जबकि विभिन्न फिल्टर सेट के साथ एक फ्लोरोसेंट लैंप एक और अधिक लचीला विकल्प है, खासकर जब कई और bimolecular biosensors साथ काम कर रहा है. वैकल्पिक रूप से, monochromator प्रकाश स्रोतों (जैसे विचित्र वी, TILLPhotonics) हो सकता हैइस्तेमाल किया; वे आम तौर पर एक एकीकृत शटर है जो सॉफ्टवेयर एक ट्रिगर संकेत के माध्यम से नियंत्रित किया जा सकता है.
- माइक्रोस्कोप में एक उपयुक्त फिल्टर घन रखें. दिनचर्या के लिए CFP और बढ़ाया पीले फ्लोरोसेंट प्रोटीन (YFP) या उनके वेरिएंट के किसी भी रूप में एक जोड़ी झल्लाहट के साथ माप झल्लाहट, हम एक साधारण फिल्टर एक ET436/30M उत्तेजना (फिल्टर है जो छोड़ा जा सकता है जब एलईडी प्रयोग किया जाता है जिसमें घन का उपयोग करते हैं, लेकिन है अपरिहार्य जब एक या क्सीनन पारा बजाय दीपक एलईडी) और एक DCLP455 dichroic दर्पण का उपयोग कर. माइक्रोस्कोप भी एक एक अच्छा संकल्प प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी के लिए उपयुक्त उद्देश्य के साथ लैस किया जाना चाहिए, उदाहरण के लिए एक योजना fluor, योजना NEOFLUAR या योजना APOCHROMAT 40x, 60x या 100x तेल विसर्जन उद्देश्य के साथ किया जाना है.
- फ्लोरोसेंट रोशनी पर स्विच और जाँच करें कि क्या प्रकाश स्थान में समान रूप से देखने के क्षेत्र भर में वितरित किया जाता है. यदि यह मामला नहीं है, एलईडी के अतिरिक्त संरेखण या दीपक नमूना के इष्टतम रोशनी प्राप्त करने के लिए आवश्यक है. यह प्रदर्शन किया जा सकता हैशिकंजा जो दीपक या अंतरिक्ष में डायोड की स्थिति का उपयोग करके मेड.
- माइक्रोस्कोप उत्सर्जन बंदरगाहों में से एक के माध्यम से एक C-माउंट बीम फाड़नेवाला कनेक्ट. उदाहरण के लिए, DV2 (Photometrics) DualView है जो दो चैनल (दाता और स्वीकर्ता) जो एक साथ एक एकल सीसीडी कैमरा चिप पर नजर रखी जा सकती है में उत्सर्जन प्रकाश विभाजन का उपयोग करें. वैकल्पिक रूप से, वहाँ (केयर्न अनुसंधान) Optosplit या एक बीम फाड़नेवाला हमामात्सू ORCA-D2 कैमरा दोहरे तरंगदैर्य में एकीकृत रूप में अन्य तुलनीय उत्पादों हैं. CFP / YFP जोड़ी झल्लाहट, हम 05 EM फ़िल्टर 505dcxr dichroic दर्पण प्लस ET480/30M और ET535/40M CFP और YFP के लिए उत्सर्जन फिल्टर, क्रमशः, जो DV2 साथ आपूर्ति की है जिसमें सेट. के बजाय एक बीम फाड़नेवाला, दाता के लिए दो फिल्टर cubes (CFP, DCLP455 dichroic दर्पण और CFP उत्सर्जन फिल्टर के लिए ET436/30M उत्तेजना फिल्टर युक्त) और (स्वीकर्ता CFP उत्तेजना फिल्टर, DCLP455 और YFP उत्सर्जन फिल्टर युक्त) चैनलों में उपयोग किया जाता हैकई प्रणालियों झल्लाहट. वैकल्पिक रूप से, किसी भी उत्सर्जन और कैमरे के सामने एक स्वचालित उत्सर्जन फिल्टर पहिया स्थिति फिल्टर के बिना एक फिल्टर घन स्थापित किया जा सकता है. इस मामले में, एक motorized खुर्दबीन या दो ~ 200-300 मिसे भीतर उत्सर्जन फिल्टर पदों के बीच फ़िल्टर पहिया alternates ratiometric इमेजिंग प्रदर्शन करने के लिए. इस छोटी सी देरी स्वीकार्य है जब इमेजिंग बल्कि शिविर संकेतों जैसे intracellular प्रक्रियाओं, धीमी गति से जहां दोनों चैनलों का सही मायने में एक साथ अधिग्रहण महत्वपूर्ण नहीं है.
- बीम फाड़नेवाला सीसीडी कैमरा (ORCA-03G या ORCA-R2 हमामात्सू फोटोनिक्स से उदाहरण के लिए प्रयोग) से कनेक्ट करें. एक FireWire केबल का उपयोग IEEE1394 कंप्यूटर इंटरफेस कैमरे को जोड़ने के रूप में कैमरे के साथ आपूर्ति की मैनुअल में वर्णित है. कैमरे पर स्विचन के बिना कैमरा ड्राइवरों स्थापित.
- अंत में, कंप्यूटर और प्रकाश स्रोत के बीच संचार की स्थापना, एलईडी या टी Arduino मैं / हे बोर्ड (Arduino Duemilanove या Arduino ऊनो उदाहरण के लिए उपयोग) कनेक्टजो एलईडी पक्ष और दूसरे छोर पर दो सिंगल तारों पिंस (0) GND और बोर्ड के 8 में जुड़ा के रूप में चित्रा 2 में दिखाया पर एक सामान्य BNC प्लग शामिल करना चाहिए एक bnc केबल का उपयोग करके शटर ओ. इकट्ठे बोर्ड सीधे अपने कंप्यूटर के यूएसबी पोर्ट से जुड़ा जा सकता है.
2. इमेजिंग सॉफ्टवेयर की स्थापना
यह नियंत्रित करने के लिए और छवि कैमरे द्वारा कब्जा करने के साथ प्रकाश स्रोत सिंक्रनाइज़, इमेजिंग सॉफ्टवेयर कंप्यूटर पर स्थापित किया जाना चाहिए. (आणविक उपकरणों) MetaFluor, Slidebook (इंटेलिजेंट इमेजिंग नवाचार), VisiView (Visitron सिस्टम) सहित कई व्यावसायिक रूप से उपलब्ध सॉफ्टवेयर संकुल रहे हैं. यहाँ हम खुले स्रोत फ्रीवेयर माइक्रो प्रबंधक जो कम लागत इमेजिंग के लिए लचीलेपन की एक उच्च डिग्री प्रदान करता है के उपयोग के प्रदर्शन.
- पर इस सॉफ्टवेयर को डाउनलोड करें http://valelab.ucsf.edu/ ~ MM / MMwiki / सूचकांक.php / लघु Manager_Version_Archive. हम 1.4.5 रिलीज जो आसानी से हमारे हाथ में विन्यास है स्थापित करने की सिफारिश.
- अपने कंप्यूटर के यूएसबी पोर्ट के लिए Arduino बोर्ड कनेक्ट. से Arduino बोर्ड को नियंत्रित करने के लिए सॉफ्टवेयर डाउनलोड http://www.arduino.cc/en/Main/software . इस वेबसाइट पर दिए गए निर्देशों का पालन करें और इस सॉफ्टवेयर सिर्फ एक माइक्रो प्रबंधक शुरू करने से पहले एक समय चला. माइक्रो प्रबंधक सॉफ्टवेयर के साथ बोर्ड का उपयोग करने के लिए एक कोड अपलोड. कोड पर डाउनलोड किया जा सकता है http://valelab.ucsf.edu/ ~ / MM / MMwiki / index.php Arduino .
- एलईडी और कैमरे पर स्विच. सॉफ्टवेयर शुरू और कैमरा और एलईडी (अन्य प्रकाश स्रोत और शटर) के साथ माइक्रो प्रबंधक संचार उपकरण> हार्डवेयर कॉन्फ़िगरेशन विज़ार्ड (चित्र देखें 3) का चयन करके कॉन्फ़िगर. अपने कैमरे सहित आवश्यक घटक जोड़ें(यानी Hamamatsu_ DCAM) और Arduino बोर्ड (है Arduino स्विच, Arduino हब और Arduino शटर उपकरणों जोड़). अगले चरणों के दौरान मूलभूत विज़ार्ड द्वारा सुझाए सेटिंग्स का उपयोग करें. नई प्रणाली के विन्यास जब विज़ार्ड द्वारा प्रेरित सहेजें.
- मुख्य मेनू का उपयोग करने के लिए उपकरण> डिवाइस संपत्ति ब्राउज़र खोलें. "Arduino स्विच राज्य" के लिए नीचे स्क्रॉल और "1" का चयन करें. संवाद बंद करें. यकीन है कि "ऑटो शटर" मुख्य सॉफ्टवेयर संवाद बॉक्स ticked है. फ़ाइल प्रेस> सिस्टम राज्य को बचाने के लिए जो सॉफ्टवेयर को शुरू करने के बाद कभी भी खोला जाना चाहिए सॉफ्टवेयर विन्यास को बचाने के लिए. यह बोर्ड और सॉफ्टवेयर छवि अधिग्रहण करने की जरूरत के बीच संचार स्थापित करेगा.
- कैमरे से आने के संकेत पर नजर रखने के लिए "लाइव" बटन दबाएं. सुनिश्चित करें कि फ्लोरोसेंट रोशनी किसी भी समय "लाइव" या "तस्वीर" समारोह में चुना जाता है पर चला जाता है. पहले मापन के लिए शुरू करने से पहले, प्रति अपने बीम फाड़नेवाला के साथ आपूर्ति निर्देशों का पालन करेंदोनों चैनलों के ऑप्टिकल संरेखण फार्म.
3. सेल संस्कृति और Transfections
- 6 अच्छी तरह प्लेटें autoclaved दौर 24 मिमी कांच coverslides (अच्छी तरह से प्रति 1 coverslide) के साथ तैयार है. वैकल्पिक रूप से, गिलास तली सेल संस्कृति बर्तन का इस्तेमाल किया जा सकता है.
- प्लेट D-सदस्य मध्यम में प्लेटों या व्यंजन पर 293A कोशिकाओं (10% FCS, 1% एल glutamine और 1% पेनिसिलिन / स्ट्रेप्टोमाइसिन समाधान के साथ पूरक) इतना है कि कोशिकाओं को 50-70% एक दिन के बाद confluency तक पहुँचने.
- चढ़ाना के बाद 24 घंटा, एक लामिना का प्रवाह बेंच में एक प्लाज्मिड झल्लाहट सेंसर कैल्शियम फॉस्फेट अभिकर्मक (3.5 देखें) विधि का उपयोग कर के साथ कोशिकाओं transfect. शिविर biosensor plasmids अनुरोध पर हमारे समूह से प्राप्त किया जा सकता है. पाठक भी व्यापक समीक्षा 7,8 अन्य उपलब्ध शिविर biosensors का वर्णन करने के लिए जाना जाता है.
- पहली बार के लिए कोशिकाओं transfecting से पहले, अभिकर्मक अभिकर्मकों तैयार. एक 2.5 एम 2 CACL और 2xBBS समाधान (उत्तरार्द्ध युक्त1.5 मिमी ना 2 4 HPO, 50 मिमी BES, 280 मिमी NaCl, विआयनीकृत जल में NaOH साथ 6.95 पीएच) समायोजित करें. बाँझ छानना एक नियमित रूप से 0.2 सुक्ष्ममापी फिल्टर का उपयोग समाधान.
- 6-अच्छी तरह से करने के लिए एक थाली या 6 गिलास तली व्यंजन transfect मिश्रण की 10 ग्राम सेंसर प्लाज्मिड, 2.5M CACL 2 समाधान और 500 μl बाँझ पानी की 50 μl झल्लाहट. अच्छी तरह से मिलाएं.
- 2x BBS की 500 μl जोड़ें. अच्छी तरह मिक्स और कमरे के तापमान पर 10 मिनट के लिए मिश्रण सेते हैं.
- 165 μl विंदुक अभिकर्मक मिश्रण के प्रत्येक अच्छी तरह से या डिश पर dropwise. धीरे थाली हलचल और यह इनक्यूबेटर में वापस डाल दिया. कोशिकाओं को आम तौर पर कर रहे हैं के लिए तैयार माप अभिकर्मक के बाद 24 घंटे झल्लाहट. सुनिश्चित करें कि इस बिंदु पर कोशिकाओं confluency तक पहुँच नहीं है, के रूप में यह कई सेल सतह रिसेप्टर्स की गतिविधि प्रभावित हो सकता है.
4. जीवित कोशिकाओं में माप झल्लाहट
- पहली बार को मापने के लिए करने से पहले, झल्लाहट 144 मिमी NaCl, 5.4 मिमी KCl, 1 युक्त बफर तैयारमिमी 2 MgCl, 2 मिमी 2 CACL, विआयनीकृत पानी में 10 मिमी HEPES और 7.3 के लिए NaOH साथ पीएच समायोजित. अपने इमेजिंग प्रयोगों के में बफर झल्लाहट के साथ इस्तेमाल किया जा यौगिकों पतला.
- इमेजिंग सॉफ्टवेयर शुरू करो. पहले से परिभाषित प्रणाली विन्यास लोड. फ़ाइल> लोड सिस्टम राज्य का चयन करने के लिए पहले से कॉन्फ़िगर प्रणाली राज्य का चयन करने के लिए.
- इमेजिंग कक्ष (जैसे Attofluor सेल कक्ष) में पक्षपाती ट्रांसफ़ेक्ट 293A कोशिकाओं के साथ एक coverslide माउंट. कोशिकाओं को एक बार धोने के साथ बफर झल्लाहट और बफर झल्लाहट के 400 μl जोड़ें. जब प्रयोग गिलास तली सेल संस्कृति व्यंजन पक्षपाती कोशिकाओं धोने और पकवान प्रति बफर के 2 मिलीलीटर जोड़ें. हम झल्लाहट HEPES युक्त बफर में कमरे के तापमान पर सभी मापन का प्रदर्शन, इतना है कि कोई सीओ 2 नियंत्रण आवश्यक है.
- उद्देश्य पर कुछ विसर्जन तेल डाल और माइक्रोस्कोप पर इमेजिंग कक्ष हस्तांतरण. सेल transillumination प्रकाश का उपयोग परत पर ध्यान दें.
- फ्लोरोसेंट lig पर स्विच"लाइव" बटन दबाने, और प्रयोग के लिए एक सेल का चयन करके ht. एक इष्टतम सेंसर अभिव्यक्ति के साथ एक सेल चुनें, जिसका अर्थ है कि यह बहुत उज्ज्वल है और मंद भी नहीं होना चाहिए. एक उपयुक्त कक्ष खोजने के बाद, फ्लोरोसेंट रोशनी तुरंत स्विच सेंसर झल्लाहट के photobleaching से बचने के.
- एक तरीका है कि "तस्वीर" बटन दबाने के बाद अधिग्रहीत छवि का एक अच्छा संकेत करने वाली शोर अनुपात होता है में "कैमरा सेटिंग" (आमतौर पर 10-50 मिसे) के तहत समय जोखिम समायोजित करें. बहुत लंबा उत्तेजना बार photobleaching में परिणाम है, जबकि कम छवि गुणवत्ता में बहुत कम बार परिणाम हो सकता है.
- "मल्टी - डी ACQ." दबाएं बटन और समय अंक की संख्या और छवि अधिग्रहण के लिए समय अंतराल सेट. हमारे सेंसर शिविर झल्लाहट के लिए, हम एक छवि हर 5 हासिल.
- मोल "बटन दबाकर मापन शुरू करो.
- किसी भी माप के दौरान, एक पुलिस "झल्लाहट ऑनलाइन" (प्लग में ऑनलाइन अनुपूरक में उपलब्ध सभी प्लग इन होना चाहिए का उपयोग कर सकते हैंplugins "" इसे शुरू करने से पहले अपने सॉफ्टवेयर माइक्रो प्रबंधक फ़ोल्डर) में ied पर नजर रखने के अनुपात में परिवर्तन झल्लाहट. इस प्लग में चलाने के लिए और अनुपात झल्लाहट "मुक्तहस्त चयन" उपकरण का उपयोग कर छवि में ब्याज की एक क्षेत्र का चयन करें. आरओआई प्रबंधक में क्षेत्र जोड़ें और "समय श्रृंखला विश्लेषक" खिड़की में "औसत" बटन दबाएँ. अनुपात ट्रेस झल्लाहट प्रदर्शित किया जाएगा. माप के दौरान ट्रेस अद्यतन, "FRETratioOnline2" प्लग में चलाने के लिए और "GetAverage" बटन दबाएँ.
- के रूप में जल्द ही के रूप में झल्लाहट अनुपात तक पहुँच गया है एक स्थिर आधारभूत सही यह पकवान / चेंबर में pipetting द्वारा वांछित यौगिक लागू. औषधीय यौगिकों के साथ कोशिकाओं का इलाज, सरल pipetting के बजाय एक छिड़काव प्रणाली इस स्तर पर इस्तेमाल किया जा सकता है.
- प्रयोग को खत्म करने के बाद, समय चूक छवियों के ढेर को बचाने के लिए. माइक्रोस्कोप से माप कक्ष निकालें और एक उद्देश्य ऊतक का उपयोग उद्देश्य साफ है.
- 4.3 कदम एक साथ माप दोहराने वापस जाओनया नमूना.
5. ऑफ़लाइन डेटा विश्लेषण
झल्लाहट इमेजिंग डेटा ImageJ सॉफ्टवेयर का उपयोग कर प्रयोग के बाद किसी भी समय ऑफ़लाइन विश्लेषण कर सकते हैं. इस प्रोटोकॉल के लिए एक पूरक के रूप में, हम "FREToffline" प्लग में हमारी प्रयोगशाला में इस्तेमाल करने के लिए दाता और स्वीकर्ता चैनलों में अधिग्रहण कर लिया छवियों को विभाजित और हित के कई क्षेत्रों में फ्लोरोसेंट तीव्रता को मापने प्रदान करते हैं. ये तीव्रता आगे कॉपी किया जा सकता है एक एक्सेल या उत्पत्ति स्प्रेडशीट में चिपकाया सही अनुपात झल्लाहट की गणना. कल्पना unimolecular biosensors के परिवर्तन झल्लाहट, सरल ratiometry अक्सर किया जाता है. इस मामले में, केवल दाता fluorophore (CFP) उत्साहित है, और दो छवियों CFP और YFP उत्सर्जन चोटियों पर लिया जाता है. अनुपात की गणना / YFP CFP (कभी कभी भी रूप में अनुपात झल्लाहट / CFP संदर्भित) दो fluorophores के बीच झल्लाहट की डिग्री का प्रतिनिधित्व करता है. , Unimolecular biosensors CFP और YFP moieties की संख्या के बराबर कर रहे हैं, तो यह है कि सरल ratiometry suffi हैcient 12 दक्षता झल्लाहट का प्रतिनिधित्व करते हैं.
- ImageJ सॉफ्टवेयर का उपयोग करने के लिए Plugins> माइक्रो प्रबंधक फ़ाइल> ओपन माइक्रो प्रबंधक का चयन करके प्रयोग फ़ाइल खोलने के लिए.
- "FREToffline" प्लग में चलाने के लिए जो व्यक्ति CFP और YFP चैनलों में ढेर समय चूक विभाजन.
- यदि पृष्ठभूमि सुधार की आवश्यकता है, इस ImageJ सॉफ्टवेयर का उपयोग किया जा सकता है.
- छवियों के YFP ढेर पर क्लिक करें और एक या "मुक्तहस्त चयन" टूल का इस्तेमाल हित के कई क्षेत्रों का चयन करें और उन्हें "जोड़ें" बटन दबाकर विंडो में प्लग "MultiMeasure" जोड़ने.
- "MultiMeasure" खिड़की में हितों के क्षेत्रों का चयन करें और प्रेस "बहु" प्रत्येक फ्रेम और प्रत्येक क्षेत्र के लिए मतलब ग्रे मूल्यों के साथ एक मेज प्राप्त. Ctrl का उपयोग कर सभी का चयन क्लिपबोर्ड में डेटा कॉपी + और Ctrl + C दबाकर एक एक्सेल या उत्पत्ति स्प्रैडशीट खोलें और Ctrl + V दबाकर डेटा पेस्ट
इस कार्यक्रम के द्वारा प्रदर्शन माप> सेट M विश्लेषण के तहत विन्यस्त किया जा सकता है easurements जहाँ आप मापदंडों मापा जा परिभाषित कर सकते हैं. हम आम तौर पर चयन केवल इस संवाद में "ग्रे मूल्य का मतलब है". - छवियों के CFP ढेर पर क्लिक करें. एक ही प्रदर्शन के रूप में 5.5 में वर्णित किया है. समान Excel या उत्पत्ति स्प्रेडशीट में CFP तीव्रता डेटा चिपकाएँ.
- एक्सेल या उत्पत्ति सॉफ्टवेयर का उपयोग करना, सही अनुपात झल्लाहट की गणना. जब सरल एकल श्रृंखला unimolecular biosensors imaged कर रहे हैं, हम स्वीकर्ता चैनल में दाता प्रतिदीप्ति bleedthrough के लिए ही सही है. इस मामले में, सही अनुपात / स्वीकर्ता दाता है:
अनुपात = (YFP - बी x CFP) CFP /
जहां बी सुधार कारक जो CFP प्लाज्मिड के साथ कोशिकाओं transfecting और YFP चैनल (बी = / YFP CFP) में दाता प्रतिदीप्ति के एक प्रतिशत को मापने के द्वारा निर्धारित किया जा सकता है. Unimolecular biosensors के लिए इस सुधार को छोड़ना संभव है, क्योंकि यह केवल वक्र के आकार पर कोई गुणात्मक प्रभाव के बिना प्रतिक्रिया झल्लाहट के समग्र आयाम को प्रभावित करेगा.
चित्रा 1 का एक उदाहरण से पता चलता है कि एक पूरी तरह से इकट्ठे झल्लाहट इमेजिंग सेटअप एक Nikon औंधा माइक्रोस्कोप, CoolLED, DV2 DualView और हमामात्सू ORCA-03G सीसीडी कैमरे से मिलकर. हार्डवेयर उपकरणों और कंप्यूटर के बीच संचार की स्थापना के लिए, मैं / हे Arduino बोर्ड कंप्यूटर और CoolLED चित्रा 2 में दिखाया के रूप में जुड़ा हुआ है. प्रकाश स्रोत और एक तुल्यकालन फैशन में कैमरे द्वारा कब्जा छवि को नियंत्रित करने के लिए, माइक्रो प्रबंधक सॉफ्टवेयर के लिए स्थापित किया गया है और ठीक से विन्यस्त (3 चित्रा देखें). प्लग - इन्स आवश्यक जोड़कर इस फ्रीवेयर आसानी से किया जा सकता है व्यक्तिगत प्रयोगात्मक आवश्यकताओं के अनुकूल 4A चित्रा से पता चलता है एक प्रतिनिधि एक शिविर सेंसर Epac1 शिविरों 13 293A कोशिकाओं में व्यक्त करने के लिए उपयोग कर माप से कच्चे झल्लाहट अनुपात ट्रेस β एड्रीनर्जिक agonist के प्रभाव की निगरानी. isoproterenol समय बिंदु 150 सेकंड में आवेदन किया है और शर्तएक अवरोधक प्रोप्रानोलोल समय बिंदु 300 सेकंड (प्रदर्शन के रूप में 4.3-4.10 में वर्णित) में जोड़ा है. इन आंकड़ों का विश्लेषण किया जा सकता है ऑफलाईन और YFP चैनल में CFP के bleedthrough के लिए सही रूप में 5.1-5.7 में वर्णित प्राप्त करने के लिए सही अनुपात 4B चित्र में दिखाया ट्रेस झल्लाहट. यह प्रतिनिधि प्रयोग isoproterenol उपचार पर झल्लाहट पर नजर रखी अनुपात जो intracellular शिविर के एक वृद्धि का संकेत में एक धीमी गति से कमी को दर्शाता है. प्रोप्रानोलोल के रूप में एक β अवरोधक isoproterenol संकेत पराजयों, बेसल स्तर के लिए एक शिविर का कमी करने के लिए अग्रणी. में ये परिवर्तन झल्लाहट संकेत किसी भी प्रयोगों (के रूप में 4.9 में वर्णित) के दौरान ऑनलाइन निगरानी कर सकते हैं. इस तरह के प्रयोगों को सामान्य रूप से उपयोग किए जाने के लिए अलग 2 दूत या जैव रासायनिक प्रक्रियाओं की निगरानी करने के लिए डिज़ाइन किया biosensors की एक किस्म के साथ किया जा सकता है.
चित्रा 1. लेआउट इमेजिंग एक CoolLED शामिल सेटअप झल्लाहट में,verted Nikon माइक्रोस्कोप, DV2 DualView, और ORCA-03G सीसीडी कैमरा.
चित्रा 2 Arduino मैं / हे बोर्ड और उसके कनेक्शन. बोर्ड एक स्वयं घुड़सवार प्लास्टिक के बॉक्स में तैनात है. एक मानक bnc केबल 8 पिन और बोर्ड के GND (0) के लिए एलईडी जोड़ता है.
चित्रा 3 प्रणाली हार्डवेयर कॉन्फ़िगरेशन विज़ार्ड का उपयोग घटकों के एकीकरण का प्रदर्शन स्क्रीनशॉट.) हार्डवेयर कॉन्फ़िगरेशन विज़ार्ड प्रारंभ बी) आवश्यक उपकरणों को जोड़ने के रूप में 2.3 में उल्लेख किया है. बड़ा आंकड़ा देखने के लिए यहां क्लिक करें .
चित्रा 4 एक प्रतिनिधि experimen झल्लाहटजो टी 293A Epac1 शिविरों के साथ ट्रांसफ़ेक्ट कोशिकाओं में शिविर के स्तर के उपाय. सबसे पहले, कोशिकाओं β एड्रीनर्जिक agonist (100 एनएम, फ्रेम में 30 या 150 सेकंड) isoproterenol शिविर में वृद्धि (YFP / CFP में कमी के रूप में मनाया अनुपात झल्लाहट) के साथ प्रेरित थे. कोशिकाओं बाद प्रोप्रानोलोल β अवरोधक (60 फ्रेम पर या 300 पर 10 सेकंड सुक्ष्ममापी) जो झल्लाहट अनुपात की एक वृद्धि की ओर जाता है, शिविर में एक कमी को दर्शाती के साथ इलाज किया गया.) कच्चे ऑनलाइन इसी हित के एक क्षेत्र से झल्लाहट अनुपात ट्रेस एक प्रयोग के दौरान एक निगरानी सेल). बी सही अनुपात का पता लगाने के बाद ऑफ़लाइन डेटा विश्लेषण के रूप में प्रदर्शन किया 5.1-5.7 में वर्णित है.
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Discussion
इस प्रोटोकॉल में, हम दिखाना है कि कैसे एक साधारण कम लागत लेकिन शक्तिशाली झल्लाहट उपलब्ध biosensors की एक किस्म के साथ नियमित अनुप्रयोगों के लिए इमेजिंग प्रणाली का निर्माण करने के लिए. यहाँ प्रस्तुत प्रणाली CFP और YFP, या फ्लोरोसेंट प्रोटीन के समान प्रकार के लिए बनाया गया है, दाता स्वीकर्ता जोड़ी के रूप में. इस बीच, अन्य व्यक्ति biosensors उपलब्ध है जो हरे और लाल फ्लोरोसेंट प्रोटीन 14 उदाहरण के लिए उपयोग हो. अन्य रंग के लिए वर्णित प्रणाली अनुकूलन, उपयुक्त प्रकाश स्रोतों और / या फिल्टर सेट चुना जाना चाहिए. एलईडी, एक और एक एलईडी लाइन के मामले में, उदाहरण के लिए 490 एनएम को उत्तेजित करने के लिए हरी फ्लोरोसेंट प्रोटीन का इस्तेमाल किया जा सकता है. एकल तरंगदैर्ध्य एल ई डी आसानी से (सेकंड के भीतर) dismounted और आदान - प्रदान कर सकते हैं. वैकल्पिक रूप से, वहाँ एलईडी उपलब्ध arrays जो कई लाइनों को रोकने के लिए विभिन्न फ्लोरोसेंट प्रोटीन (जैसे पीई CoolLED-2) उत्तेजित हैं. वैकल्पिक माप के साथ सक्षम जोड़े झल्लाहट, अन्य फ्लोरोसेंट फिल्टर cubes microsc में रखा जा सकता है ope, और अंततः उत्सर्जन बीम फाड़नेवाला फिल्टर का आदान - प्रदान किया जाना चाहिए. Photometrics DV2 DualView के उत्सर्जन के लिए अतिरिक्त फिल्टर स्लाइडर्स प्रदान करता है. कुछ हाल ही में विकसित आवेदन एक साथ दो या दो से अधिक biosensors का उपयोग करने के लिए एक ही समय में एकाधिक प्रक्रियाओं की निगरानी करने के लिए, उदाहरण के शिविर के लिए और एक 15 सेल में एक साथ cGMP. इस मामले में, एक (Photometrics) QuadView चार उत्सर्जन चैनलों युक्त इस्तेमाल किया जा सकता है, ImageJ प्लग में के लिए छवि बंटवारे और विश्लेषण तो चार चैनलों के साथ इस्तेमाल किया जा अनुकूलित कर सकते हैं और गणना करने के लिए दो अनुपात झल्लाहट. ImageJ सॉफ्टवेयर छवि विश्लेषण और परिणामों की ऑनलाइन प्रतिनिधित्व के मामले में बहुत लचीला है. सरल पाठ संपादित प्लग - इन किसी भी व्यक्ति इमेजिंग प्रणाली और प्रयोग की जरूरतों के लिए सॉफ्टवेयर एल्गोरिथ्म के अनुकूलन की अनुमति देते हैं. कभी कभी यह बहुत उपयोगी है और तकनीकी समस्याओं, जो लंबे समय की आवश्यकता होती है जब वे किसी भी व्यावसायिक सॉफ्टवेयर पैकेज में लागू किया जाना हो सकता है तेजी से समाधान प्रदान करता है.
जब प्रयोगों झल्लाहट कर रही है, यह photobleaching जो प्रकट होता है जब उत्तेजना बार भी लंबे समय या जब चित्र भी अक्सर लिया जाता है से बचने के लिए महत्वपूर्ण है. "सामग्री> इस मामले में, एक रासायनिक फोटोन प्रेरित क्षति या fluorophores के सहसंयोजक संशोधन होते हैं और हो सकता है दक्षता झल्लाहट कमी photobleaching से बचने के लिए, एक जोखिम समय और छवि अधिग्रहण की आवृत्ति कम भी 12,16 प्रोटोकॉल स्थापित कर रहे हैं इस घटना के लिए सही कर सकते हैं. डेटा विश्लेषण के दौरान, यह संभव है के बीच पार से बात के लिए सही में दाता और स्वीकर्ता (bleedthrough) चैनल. unimolecular biosensors साधारण ratiometric माप के लिए (जो मामले में दाता और स्वीकर्ता fluorophores हमेशा एक ही स्तर पर व्यक्त कर रहे हैं) का उपयोग झल्लाहट, यह पर्याप्त होगा स्वीकर्ता में दाता के bleedthrough के लिए सिर्फ सही कर सकते हैं चैनल या यहां तक कि इस सुधार को पूरी तरह न आना क्योंकि यह गुणात्मक अनुपात झल्लाहट वक्र के आकार को प्रभावित नहीं करता है. वें की bleedthroughदाता चैनल में ई स्वीकर्ता आमतौर पर नगण्य है. Bimolecular biosensors दो अलग प्रोटीन शामिल किया जाता है, इन विभिन्न स्तरों पर व्यक्त किया जा सकता है. इस मामले में, bleedthrough सुधार और 440 एनएम प्रकाश द्वारा प्रत्यक्ष YFP उत्तेजना के लिए एक अतिरिक्त सुधार भी उचित है. कृपया, प्रकाशित 12 प्रोटोकॉल जहां सुधार प्रक्रिया को और अधिक विस्तार में वर्णित हैं उल्लेख. अतिरिक्त biosensors के विकास के बारे में व्यापक जानकारी, माइक्रोस्कोपी झल्लाहट, तकनीक और डेटा विश्लेषण के बारे में संभव नुकसान पहले प्रकाशित 17-18 प्रोटोकॉल में उपलब्ध हैं. अंत में, सरल और शक्तिशाली इमेजिंग प्रणाली यहाँ वर्णित एक लचीला जीवित कोशिकाओं में उच्च अस्थायी और स्थानिक संकल्प के साथ विभिन्न जैव रासायनिक घटनाओं और संकेतन अणुओं की निगरानी करने के लिए एक मंच प्रदान करता है.Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.
Acknowledgments
लेखकों के लिए तकनीकी सहायता के लिए Anke Rüttgeroth और करीना Zimmermann धन्यवाद देना चाहूंगा. यह काम ड्यूश Forschungsgemeinschaft (अनुदान एनआई वॉन 1301/1-1) और गौटिंगेन मेडिकल सेंटर के विश्वविद्यालय ("समर्थक FUTURA" वॉन के लिए अनुदान) द्वारा समर्थित किया गया.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BES Buffer Grade | AppliChem | A1062 | |
| CaCl2 dihydrate | Sigma-Aldrich | C5010 | |
| Glass coverslides | Thermo Scientific | 004710781 | Diameter 24 mm |
| Glass-bottomed cell-culture dishes | World Precision Instruments | FD3510-100 | |
| D-MEM medium | Biochrom AG | F0445 | |
| Fetal calf serum (FCS) | Thermo Scientific | SH30073.02 | |
| L-Glutamine | Biochrom AG | K0283 | |
| HEPES | Sigma | H4034 | |
| KCl | Sigma | P5405 | |
| MgCl2 hexahydrate | AppliChem | A4425 | |
| NaCl | AppliChem | A1149 | |
| Na2HPO4 | Sigma-Aldrich | S9707 | |
| Penicillin/Streptomycin | Biochrom AG | A2213 | |
| Inverted fluorescent microscope | e.g. Nikon | Request at Nikon | |
| CoolLED | CoolLED | pE-100 | 440 nm |
| DualView | Photometrics | DV2-SYS | |
| DualView filter slider | Photometrics | 05-EM | |
| CFP/YFP filter set | Chroma Technology | 49052 | without the emission filter |
| ORCA-03G camera | Hamamatsu Photonics | C8484-03G02 | |
| Arduino I/O board | Sparkfun Electronics | DEV-00666 | |
| Attofluor cell chamber | Invitrogen | A-7816 | |
| Personal computer with WindowsXP or Windows7 system | Any supplier | Include hard-drive with high capacity |
References
- Zaccolo, M. Use of chimeric fluorescent proteins and fluorescence resonance energy transfer to monitor cellular responses. Circ. Res. 94, 866-873 (2004).
- Mehta, S., Zhang, J. Reporting from the field: genetically encoded fluorescent reporters uncover signaling dynamics in living biological systems. Annu. Rev. Biochem. 80, 375-401 (2011).
- Zhang, J., Campbell, R. E., Ting, A. Y., Tsien, R. Y. Creating new fluorescent probes for cell biology. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 3, 906-918 (2002).
- Miyawaki, A. Visualization of the spatial and temporal dynamics of intracellular signaling. Dev. Cell. 4, 295-305 (2003).
- Bunemann, M., Frank, M., Lohse, M. J. Gi protein activation in intact cells involves subunit rearrangement rather than dissociation. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100, 16077-16082 (2003).
- Kotlikoff, M. I. Genetically encoded Ca2+ indicators: using genetics and molecular design to understand complex physiology. J. Physiol. 578, 55-67 (2007).
- Willoughby, D., Cooper, D. M. Live-cell imaging of cAMP dynamics. Nat. Methods. 5, 29-36 (2008).
- Nikolaev, V. O., Lohse, M. J. Monitoring of cAMP synthesis and degradation in living cells. Physiology (Bethesda). 21, 86-92 (2006).
- Tanimura, A. Use of Fluorescence Resonance Energy Transfer-based Biosensors for the Quantitative Analysis of Inositol 1,4,5-Trisphosphate Dynamics in Calcium Oscillations. J. Biol. Chem. 284, 8910-8917 (2009).
- Nikolaev, V. O., Lohse, M. J. Novel techniques for real-time monitoring of cGMP in living cells. Handb. Exp. Pharmacol. , 229-243 (2009).
- Nausch, L. W., Ledoux, J., Bonev, A. D., Nelson, M. T., Dostmann, W. R. Differential patterning of cGMP in vascular smooth muscle cells revealed by single GFP-linked biosensors. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 365-370 (2008).
- Borner, S. FRET measurements of intracellular cAMP concentrations and cAMP analog permeability in intact cells. Nat. Protoc. 6, 427-438 (2011).
- Nikolaev, V. O., Bunemann, M., Hein, L., Hannawacker, A., Lohse, M. J. Novel single chain cAMP sensors for receptor-induced signal propagation. J. Biol. Chem. 279, 37215-37218 (2004).
- Hong, K. P., Spitzer, N. C., Nicol, X. Improved molecular toolkit for cAMP studies in live cells. BMC Res. Notes. 4, 241-24 (2011).
- Niino, Y., Hotta, K., Oka, K. Simultaneous live cell imaging using dual FRET sensors with a single excitation light. PLoS One. 4, e6036 (2009).
- Palmer, A. E., Tsien, R. Y. Measuring calcium signaling using genetically targetable fluorescent indicators. Nat. Protoc. 1, 1057-1065 (2006).
- Brumbaugh, J., Schleifenbaum, A., Stier, G., Sattler, M., Schultz, C. Single- and dual-parameter FRET kinase probes based on pleckstrin. Nat. Protoc. 1, 1044-1055 (2006).
- Aoki, K., Matsuda, M. Visualization of small GTPase activity with fluorescence resonance energy transfer-based biosensors. Nat. Protoc. 4, 1623-1631 (2009).
