Summary
Förster resonans (FRET) mikroskopi är en kraftfull teknik för realtidsövervakning av signalering händelser i levande celler med olika biosensorer som reportrar. Här beskriver vi hur man bygger en anpassad epifluorescens FRET bildsystem från kommersiellt tillgängliga komponenter och hur man använder den för FRET experiment.
Abstract
Förster resonans (FRET) mikroskopi fortsätter att vinna ökat intresse som en teknik för realtidsövervakning av biokemiska och signalering händelser i levande celler och vävnader. Jämfört med klassiska biokemiska metoder är denna nya teknik kännetecknas av hög temporal och spatial upplösning. FRET experiment använder olika genetiskt kodade biosensorer som kan uttryckas och avbildas med tiden in situ eller in vivo 1-2. Typiska biosensorer kan antingen rapportera protein-proteininteraktioner genom att mäta FRET mellan en fluorofor-märkt par av proteiner eller konformationsförändringar i ett enda protein som härbärgerar donator-och acceptormolekyler sammankopplade med en bindande del för en molekyl av intresse 3-4. Bimolekylära biosensorer för protein-proteininteraktioner inkluderar, till exempel, konstruktioner utformats för att övervaka G-protein-aktivering i celler 5, medan de unimolekylära sensorerna MEASuring konformationsförändringar används ofta för att bilden sekundära budbärare såsom kalcium 6, 7-8 cAMP, inositolfosfater 9 och cGMP 10-11. Här beskriver vi hur man bygger en anpassad epifluorescens FRET bildsystem från enstaka kommersiellt tillgängliga komponenter och hur man kan kontrollera hela installationen med hjälp av Micro-Manager freeware. Denna enkla men kraftfulla verktyg är utformat för rutinmässiga eller mer sofistikerade FRET mätningar i levande celler. Förvärvade bilder bearbetas med egen skriftlig plug-ins för att visualisera förändringar i FRET förhållande i realtid under några experiment innan de lagras i ett grafiskt format som är kompatibelt med inbyggd ImageJ gratisprogram som används för efterföljande dataanalys. Detta låg kostnad system kännetecknas av hög flexibilitet och kan med framgång användas för att övervaka olika biokemiska händelser och signalmolekyler genom en uppsjö av tillgängliga FRET biosensorer i levande celler och vävnader. Som ett exempel, visar vi hOW att använda denna avbildning för att utföra realtidsövervakning av cAMP i levande 293A celler vid stimulering med en β-adrenergisk receptoragonist och blockerare.
Protocol
1. Att sätta upp en FRET Imaging mikroskop
I princip kan vilken som helst inverterat fluorescensmikroskop som finns i labbet och har en kamera port anpassas för FRET avbildning. Den slutliga installationen bör innehålla följande viktiga komponenter: ett mikroskop, en ljuskälla med eller utan ytterligare slutare, en stråldelare för emission ljus och en CCD-kamera (se figur 1). Maskinvaruenheter, särskilt ljuskällan, slutaren och kameran är integrerade i och styrs av bildprogram som gör bilden insamling och analys. Nedan beskriver vi ett förfarande för att montera ett enkelt FRET system från kommersiellt tillgängliga komponenter.
- Anslut din ljuskälla till mikroskopet. Använd till exempel en enda våglängd lysdiod (CoolLED P E-100, 440 nm) som selektivt exciterar förbättrad cyan fluorescerande protein (GFP) som används som donator i de flesta FRET biosensorer. Det kan vara direktly och ansluts enkelt till epifluorescens belysning porten på mikroskopet. Det finns också flera våglängder lysdioder som finns och som kan anslutas på liknande sätt. Istället för LED, andra vanliga ljuskällor såsom XBO75 xenonbåglampa (används ofta för Olympus och Zeiss mikroskop) eller HBO kvicksilverlampa (vanligtvis installerad på Nikon mikroskop) kan användas. I fallet med en fluorescerande lampa, bör du också en slutare mellan lampan och belysning hamn för att möjliggöra mjukvara-assisterad styrning av excitationsljus som kommer in på ditt prov. CoolLED kräver ingen ytterligare slutare eftersom den direkt kan kopplas till och från av programvaran. Nackdelen med de enfärgade LED-system är ett begränsat antal excitationsvåglängder, medan ett lysrör med olika filter uppsättningar är ett mer flexibelt alternativ, speciellt när man arbetar med flera och bimolekylära biosensorer. Alternativt kan monokromator ljuskällor (t.ex. Polykrom V TILLPhotonics) varaanvändas, de har oftast en integrerad slutare som kan vara programvara styrs via en trigger signal.
- Placera ett lämpligt filter kub i mikroskop. För rutinmässig FRET mätningar med den gemensamma fiskeripolitiken och förbättrad gul fluorescerande protein (YFP) eller någon av deras varianter som FRET par, använder vi ett enkelt filter kub innehåller en ET436/30M excitationsfilter (som kan utelämnas när LED används, men är nödvändig när man använder en xenon eller kvicksilverlampa snarare än LED) och en DCLP455 dikroisk spegel. Mikroskopet bör också utrustas med ett mål som lämpar sig för en god upplösning fluorescensmikroskopi, till exempel med en plan-fluor, plan-Neofluar eller plan-apochromat 40x, 60x eller 100x oljeimmersionsobjektiv.
- Slå på det fluorescerande ljuset och kontrollera om ljusfläcken är jämnt fördelat över synfältet. Om detta inte är fallet, är ytterligare inriktning av LED eller lampan krävs för att uppnå optimal belysning av provet. Detta kan vara prestandaMed med hjälp av skruvar vilket läge dioden eller lampan i rymden.
- Anslut stråldelaren via en C-fäste till en av mikroskopets utsläpp portar. Till exempel använder DV2 DualView (ljustekniska) som delar det emitterade ljuset i två (donator och acceptor) kanaler som samtidigt kan övervakas på ett enda CCD-kamera chip. Alternativt finns andra jämförbara produkter såsom Optosplit (Cairn Research) eller en stråldelare integrerad i Hamamatsu ORCA-D2 dubbla våglängder kamera. För den gemensamma fiskeripolitiken / YFP FRET par, använder vi oss av 05-EM filteruppsättning innehåller 505dcxr dikroiska spegeln plus ET480/30M och ET535/40M filter utsläpp för den gemensamma fiskeripolitiken och YFP respektive som medföljer DV2. I stället för en stråldelare, två filter kuber för givare (som innehåller ET436/30M excitationsfilter för gemensamma fiskeripolitiken, DCLP455 dikroiska spegeln och den gemensamma fiskeripolitiken utsläpp filter) och acceptor (innehållande den gemensamma fiskeripolitiken excitationsfiltret, DCLP455 och YFP utsläpp filter) kanaler används iMånga FRET system. Alternativt kan ett filter kub utan utsläpp filter och en automatisk utsläpp filterhjul läge innan kameran installeras. I detta fall en motoriserad mikroskop eller filtret växlar hjul mellan de två utsläpp filter positioner inom ~ 200-300 ms utföra kvotmetriska avbildning. Denna mindre fördröjning är acceptabelt när avbildning ganska långsam intracellulära processer, såsom cAMP signaler, där verkligen samtidig förvärv av båda kanalerna är inte kritisk.
- Anslut CCD-kameran (användning exempelvis ORCA-03G eller ORCA-R2 från Hamamatsu Photonics) till stråldelaren. Använd en FireWire-kabel för att ansluta kameran till IEEE1394 datorgränssnitt, som beskrivs i handboken som medföljer kameran. Installera kamerans drivrutiner utan att slå på kameran.
- Slutligen, för att upprätta kommunikation mellan datorn och ljuskällan, anslut Arduino I / O-kort (till exempel använda Arduino Duemilanove eller Arduino Uno) till LED eller to slutaren med hjälp av en BNC-kabel som bör innehålla en normal BNC kontakten på LED sidan och två enda ledare i andra änden är ansluten till stift GND (0) och 8 i styrelsen som visas i figur 2. Den sammansatta styrelsen kan anslutas direkt till en USB-port på datorn.
2. Ställa in Imaging Software
För att styra och synkronisera ljuskällan med bild fånga med kameran, bör bildbehandlingsprogram installeras på datorn. Det finns flera kommersiellt tillgängliga mjukvarupaket inklusive MetaFluor (Molecular Devices), Slidebook (Intelligent Imaging Innovations), VisiView (Visitron Systems). Här visar vi användningen av öppen källkod Micro-Manager gratisprogram som ger en hög grad av flexibilitet för billig avbildning.
- Ladda ner denna programvara på http://valelab.ucsf.edu/ ~ MM / MMwiki / index.php / Micro-Manager_Version_Archive. Vi rekommenderar att du installerar den 1.4.5 versionen som lätt kan konfigureras i våra händer.
- Anslut Arduino kortet till en USB-port på datorn. Ladda ner mjukvaran för att styra Arduino kortet från http://www.arduino.cc/en/Main/software . Följ anvisningarna på denna hemsida och köra programmet bara en gång före start Micro-Manager. Ladda en kod för användning av kortet med Micro-Manager. Koden kan laddas ner på http://valelab.ucsf.edu/ ~ MM / MMwiki / index.php / Arduino .
- Slå på LED och kameran. Starta programmet och konfigurera Micro-Manager kommunikation med kameran och LED (annan ljuskälla och slutartid) genom att välja Verktyg> Maskinvara Konfigurationsguiden (se figur 3). Lägg de nödvändiga komponenter inklusive kameran(Dvs. Hamamatsu_ DCAM) och Arduino styrelse (lägg Arduino-Switch, Arduino-Hub och Arduino-Shutter-enheter). Under nästa steg, använd standardinställningarna som föreslås av guiden. Spara den nya systemkonfigurationen när du uppmanas av guiden.
- Använd huvudmenyn för att öppna Verktyg> Webbläsare Device Property. Bläddra ned till "Arduino Switch stat" och välj "1". Stäng dialogrutan. Se till att "auto-slutare" rutan är ikryssad i den huvudsakliga programvara dialogrutan. Tryck Arkiv> Spara systemtillståndet för att spara programvarukonfigurationen som ska öppnas när som helst efter start av programmet. Detta kommer att upprätta kommunikation mellan styrelsen och den programvara som behövs för att utföra bildtagning.
- Tryck på "Live"-knappen för att övervaka signalen från kameran. Se till att lysrör går på som helst "Live" eller "Snap"-funktionen är vald. Innan du börjar de första mätningarna, följ instruktionerna som medföljer stråldelare till Perbilda den optiska inriktningen av båda kanalerna.
3. Cellodling och transfektioner
- Förbered 6-brunnars plattor med autoklaverade runda 24 coverslides mm glas (1 coverslide per brunn). Alternativt, kan glas-bottnade cell-odlingsskålar användas.
- Plattan 293A celler på fat eller tallrikar i D-MEM-medium (kompletterat med 10% FCS, 1% L-glutamin och 1% penicillin / streptomycin-lösning), så att cellerna når 50-70% konfluens efter en dag.
- 24 timmar efter plätering, transfektera cellerna i ett laminärt flöde bänk med en FRET sensor plasmid med användning av kalcium-fosfat metoden transfektion (se 3,5). cAMP Biosensor plasmider kan erhållas från vår grupp på begäran. Läsaren hänvisas också till de omfattande översyner 7,8 beskriver andra tillgängliga cAMP biosensorer.
- Innan transfektera celler för första gången, förbereda transfektionsreagenser. Gör upp en 2,5 M CaCl 2 och 2xBBS lösningar (den senare innehåller1,5 mM Na 2 HPO 4, 50 mM BES, 280 mM NaCl, justera till pH 6,95 med NaOH) i avjoniserat vatten. Sterila filtratet lösningarna med en vanlig 0,2 pm filter.
- Att transfektera en 6-brunnsplatta eller 6 glas botten rätter, blanda 10 pg av FRET sensorns plasmiden, 50 pl av 2,5 M CaClj-lösning 2 och sterilt vatten upp till 500 pl. Blanda väl.
- Lägg 500 pl 2x BBS. Blanda väl och inkubera blandningen under 10 minuter vid rumstemperatur.
- Pipettera 165 pl av transfektion blandningen droppvis på varje brunn eller skål. Försiktigt rör plattan och lägg tillbaka den i inkubatorn. Celler är oftast redo för FRET mätningar 24 timmar efter transfektion. Kontrollera att cellerna inte har nått konfluens vid denna punkt, eftersom detta kan påverka aktiviteten av flera cellytreceptorer.
4. FRET Mätningar i levande celler
- Före mätning för första gången, förbereda FRET buffert innehållande 144 mM NaCl, 5,4 mM KCl, 1mM MgCl2, 2 mM CaCla 2, 10 mM HEPES i avjoniserat vatten och justera pH till 7,3 med NaOH. Späd de föreningar som skall användas i din avbildande experiment med FRET bufferten.
- Starta bildprogram. Fyll tidigare definierade systemkonfiguration. Välj Arkiv> Statligt Load System för att välja det tidigare konfigurerade systemstatus.
- Montera en coverslide med vidhäftande transfekterade 293A celler i bildbehandling kammare (t.ex. Attofluor cellkammare). Tvätta cellerna en gång med FRET buffert och tillsätt 400 pl FRET buffert. Vid användning glas botten cell-odlingsskålar tvätta de vidhäftande cellerna och tillsätt 2 ml av buffert per skålen. Vi utför alla mätningar vid rumstemperatur i FRET buffert innehållande HEPES, så att ingen CO 2 kontroll är nödvändig.
- Sätt lite immersionsolja på mål och överföra avbildning kammare på mikroskopet. Fokus på cellskiktet med genomlysning ljus.
- Slå på den fluorescerande light genom att trycka på "Live"-knappen och välj en cell för experimentet. Välj en cell med en optimal givare uttryck, vilket innebär att det inte bör vara för ljust och inte för svag. Efter att hitta en lämplig cell, stänga av lysrör omedelbart för att förhindra fotoblekning av FRET sensorn.
- Justera exponeringstiden under "Kamerainställningar" (vanligen 10-50 ms) på ett sätt som leder till en bra signal-brus-förhållande av den förvärvade bilden när du trycker på "Snap"-knappen. Alltför långa excitation gånger kan resultera i fotoblekning, medan för korta resulterar i låg bildkvalitet.
- Tryck på "Multi-D Acq." knappen och ställ in antalet tidpunkter och tidsintervall för bildtagning. För vår cAMP-FRET sensor förvärvar vi en bild var 5 sekunder.
- Starta mätningarna genom att trycka på knappen "Hämta".
- Under varje mätning kan man använda "FRET online" plug-in (finns i Online Supplement, måste alla insticksprogram vara polisIED: i "plugins" mapp på din Micro-Manager innan du startar) för att övervaka FRET utväxlingsändringar nätet. Kör denna plug-in och välj en region av intresse för FRET förhållandet bilden med hjälp av "Freehand val" verktyg. Lägg regionen i ROI manager och tryck på "Hämta genomsnittet" i "Tidsserier analysator" fönstret. FRET Förhållandet spår visas. För att uppdatera spår under mätningen, kör "FRETratioOnline2" plug-in och tryck på "GetAverage"-knappen.
- Så snart FRET förhållandet har nått en stabil baslinje tillämpa den önskade föreningen genom att noggrant pipettera den i skålen / kammaren. Att behandla celler med farmakologiska föreningar, kan ett perfusions-system i stället för enkel pipettering skall användas i detta skede.
- Efter avslutad experimentet, spara tidsförlopp bunt bilder. Ta bort mätkammaren från mikroskopet och rengör målet med en objektiv vävnad.
- Gå tillbaka till steg 4,3 upprepa mätningen med ennytt prov.
5. Offline dataanalys
FRET bilddata kan analyseras offline när som helst efter experimentet med ImageJ programvara. Som ett komplement till detta protokoll, ger vi den "FREToffline" plug-in som används i vårt laboratorium för att dela de förvärvade bilder till donator och acceptor kanaler och mäta fluorescensintensiteter i flera områden av intresse. Dessa intensiteter kan vidare vara kopieringsskyddade klistras in i ett Excel-eller Origin kalkylblad för att beräkna den korrigerade FRET förhållandet. För att visualisera FRET förändringar i unimolekylära biosensorer, är enkel ratiometry används ofta. I detta fall, är endast donatorfluoroforen (GFP) exciteras, och två bilder tas på GFP och YFP emissionstoppar. Den beräknade YFP / GFP förhållandet (ibland även kallad FRET / GFP-förhållande) representerar graden av FRET mellan de båda fluoroforerna. I unimolekylära biosensorer, antalet gemensamma fiskeripolitiken och YFP delarna är lika, så att den enkla ratiometry är tillräckligtligt att representera FRET effektivitet 12.
- Använd ImageJ programvara för att öppna experimentet filen genom att välja Plugins> Micro-Manager> Öppna Micro-Manager fil.
- Kör "FREToffline" plug-in som delar upp time-lapse stack till individuell gemensamma fiskeripolitiken och kanaler YFP.
- Om bakgrundskorrigering krävs kan detta utföras med ImageJ programvara.
- Klicka på YFP stacken av bilder och välja ett eller flera områden av intresse med hjälp av "Freehand val" verktyg och lägga till dem i "MultiMeasure" plug-in fönstret genom att trycka på knappen "Add".
- Välj regionerna intressen i "MultiMeasure" fönstret och tryck på "Multi" för att få ett bord med genomsnittliga grå värden för varje ram och varje region. Kopiera data till Urklipp genom att välja alla använder Ctrl + A och genom att trycka Ctrl + C. Öppna ett Excel eller Origin kalkylblad och klistra in data genom att trycka på Ctrl + V.
De mätningar som utförs av programmet kan konfigureras under Analyze> Set M easurements där du kan definiera de parametrar som skall mätas. Vi väljer oftast bara "Mean gråa värde" i den här dialogrutan. - Klicka på den gemensamma fiskeripolitiken bunten med bilder. Utför samma som beskrivits i 5,5. Klistra den gemensamma fiskeripolitiken intensitet data i samma Excel eller ursprung kalkylblad.
- Använda Excel eller ursprung programvara, beräkna den korrigerade FRET förhållandet. När enkla enkelkedjiga unimolekylära biosensorer avbildas, korrigera vi bara för bleedthrough av givaren fluorescens i acceptor kanalen. I detta fall är den korrigerade acceptorn / givare förhållande:
Ratio = (YFP - B x GFP) / fiskeripolitiken
Där B är korrektionsfaktorn som kan bestämmas genom att transfektera celler med GFP-plasmid och mäta en procentandel av donator fluorescens i YFP-kanalen (B = YFP / GFP). Utan denna korrigering för unimolekylära biosensorer är möjlig, eftersom det endast skulle påverka den totala amplituden för FRET responsen utan någon kvalitativ effekt på formen av kurvan.
Figur 1 visar ett exempel på en helt monterad FRET avbildning inställning består av ett Nikon inverterat mikroskop, CoolLED, Dv2 DualView och Hamamatsu ORCA-03G CCD-kamera. För att upprätta kommunikation mellan hårdvarukomponenter och datorn är I / O-Arduino kortet är ansluten till datorn och till CoolLED som visas i figur 2. För att styra ljuskällan och bild fånga med kameran på ett synkroniserat sätt, har Micro-Manager som ska installeras och rätt konfigurerad (se figur 3). Denna gratisprogram kan enkelt anpassas till individuella experimentella behov genom att lägga nödvändig plug-ins. Figur 4A visar en representativ rå FRET förhållande spår från en mätning med hjälp av cAMP sensorn Epac1-läger 13 uttryckt i 293A celler för att övervaka effekterna av β-adrenerg agonist isoproterenol tillämpas vid tidpunkten 150 sek och & satsaen,-blockerare propranolol tillsattes vid tidpunkten 300 sek (genomfördes såsom beskrivits i 4,3-4,10). Dessa data kan analyseras offline och korrigeras för bleedthrough av GFP i YFP-kanalen som beskrivs i 5,1-5,7 för att erhålla den korrigerade FRET förhållandet spår som visas i figur 4B. Detta representativa experiment visar en långsam minskning i den övervakade FRET förhållandet på isoproterenol behandling som indikerar en ökning av intracellulär cAMP. Propranolol som en β-blockerare reverserar isoproterenol signalen, vilket leder till en minskning av cAMP till basala nivåer. Dessa förändringar i FRET-signal kan övervakas på nätet under några experiment (som beskrivet i 4,9). Sådana experiment kan utföras med en rad olika vanligen använda biosensorer för att övervaka olika andra budbärare eller biokemiska processer.
Figur 1. Layout av FRET avbildning inställning består av en CoolLED ikonverteras Nikon mikroskop, DV2 DualView och ORCA-03G CCD-kamera.
Figur 2. Arduino I / O-kort och dess anslutningar. Styrelsen är placerad i en egen monterad plastlåda. En standard BNC kabel ansluter lysdioden stiften 8 och GND (0) i styrelsen.
Figur 3. Skärmbilder visar integration av systemkomponenter med guiden maskinvarukonfiguration. A) Starta guiden maskinvarukonfiguration. B) Lägg de nödvändiga anordningar som nämns i 2,3. Klicka här för att se större bild .
Figur 4. En representant FRET experiment som mäter cAMP-nivåer i 293A-celler transfekterade med Epac1-läger. Först, cellerna stimulerades med β-adrenerga agonisten isoproterenol (100 nM, vid ram 30 eller vid 150 sek) för att öka cAMP (observeras som en minskning i YFP / GFP FRET förhållande). Cellerna behandlades därefter med propranolol β-blockerare (10 iM, vid ram 60 eller vid 300 sek) vilket leder till en ökning av FRET förhållande, vilket återspeglar en minskning i cAMP. A) Rå nätet FRET förhållande spår från en region av intresse som motsvarar till en enskild cell övervakas under experimentet. B) Korrigerad förhållande spår efter offline dataanalys genomfördes enligt beskrivningen i 5,1-5,7.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
i detta protokoll visar vi hur man bygger en enkel billig men kraftfull FRET avbildning för rutinmässiga tillämpningar med olika tillgängliga biosensorer. Systemet som presenteras här är utformat för GFP och YFP, eller liknande typer av fluorescerande proteiner, som donator-acceptor-par. Samtidigt andra enskilda biosensorer blir tillgängliga som använder till exempel gröna och röda fluorescerande proteiner 14. För att anpassa det beskrivna systemet för andra färger, bör lämpliga ljuskällor och / eller filter uppsättningar väljas. I fallet av LED, en annan enskild LED linje, till exempel 490 nm för att excitera grönt fluorescerande protein kan användas. Single-våglängd LED kan enkelt (inom sekunder) demonteras och bytas. Alternativt finns det LED-matriser tillgängliga som innehåller flera rader för att excitera olika fluorescerande proteiner (t.ex. PE-2 CoolLED). För att möjliggöra mätningar med alternativ FRET par, kan andra fluorescerande filter kuber placeras i Microsc opa, och så småningom för utsläpp stråldelare filter bör bytas ut. Ljustekniska erbjuder ytterligare utsläpp filter reglagen för DV2 DualView. Några nyligen utvecklade program använder två eller fler biosensorer samtidigt övervaka flera processer samtidigt, t.ex. cAMP och cGMP tillsammans i en cell 15. I detta fall kan en QuadView (ljustekniska) innehåller fyra utsläpp kanaler användas, ImageJ plug-in för bilden delning och analys kan sedan anpassas för att användas med fyra kanaler och beräkna två FRET nyckeltal. ImageJ programvara är mycket flexibel när det gäller bildanalys och online representation av resultaten. Enkel text-redigerade plug-ins kan anpassa programvaran algoritmen till behoven hos varje enskild bildsystem och experiment. Detta är ibland mycket hjälpsamma och erbjuder snabba lösningar på de tekniska problem, som kan kräva långa tider när de måste genomföras i någon kommersiell programvara paket.
innehåll "> När du gör FRET experiment är det viktigt att undvika att fotoblekning som visas när excitations tider är för lång eller när bilderna tas alltför ofta. I detta fall kan en foton-inducerad kemisk skada eller kovalenta modifieringar av fluoroforer inträffar och minska FRET effektivitet. För att undvika fotoblekning kan man minska exponeringen tiden och frekvensen av bilden förvärvet. finns också etablerade protokoll 12,16 för att korrigera för detta fenomen. Under dataanalys, är det möjligt att korrigera för överhörning mellan donator och acceptor kanaler (bleedthrough). Vid användning unimolekylära FRET biosensorer (i vilket fall donator-och acceptor alltid uttrycks på samma nivå) för enkla kvotmetriska mätningar kan det vara tillräckligt att korrigera bara för bleedthrough av givaren i acceptorn kanal eller ens utelämna denna rättelse helt eftersom det inte kvalitativt påverkar formen på FRET förhållandet kurvan. den bleedthrough av the acceptor i givaren kanalen är oftast försumbar. När bimolekylära biosensorer som består av två olika proteiner används, kan dessa uttryckas på olika nivåer. I detta fall bleedthrough korrigering och en ytterligare korrigering för direkt YFP excitation vid 440 nm ljus är också tillrådligt. Snälla, se det offentliggjorda protokollet 12 där alla korrigeringar beskrivs mer i detalj. Ytterligare omfattande information om utvecklingen av biosensorer, FRET mikroskopi, eventuella fallgropar tekniken och om dataanalys finns i tidigare publicerade protokoll 17-18. Sammanfattningsvis ger enkel och kraftfull bildsystem beskrivs här en flexibel plattform för att övervaka olika biokemiska händelser och signalmolekyler med hög temporal och spatial upplösning i levande celler.Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Inga intressekonflikter deklareras.
Acknowledgments
Författarna vill tacka Anke Rüttgeroth och Karina Zimmermann för tekniskt stöd. Detta arbete stöddes av Deutsche Forschungsgemeinschaft (bidrag NI 1301/1-1 till VON) och universitetet i Göttingen Medical Center ("Pro Futura" bidrag till VON).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BES Buffer Grade | AppliChem | A1062 | |
| CaCl2 dihydrate | Sigma-Aldrich | C5010 | |
| Glass coverslides | Thermo Scientific | 004710781 | Diameter 24 mm |
| Glass-bottomed cell-culture dishes | World Precision Instruments | FD3510-100 | |
| D-MEM medium | Biochrom AG | F0445 | |
| Fetal calf serum (FCS) | Thermo Scientific | SH30073.02 | |
| L-Glutamine | Biochrom AG | K0283 | |
| HEPES | Sigma | H4034 | |
| KCl | Sigma | P5405 | |
| MgCl2 hexahydrate | AppliChem | A4425 | |
| NaCl | AppliChem | A1149 | |
| Na2HPO4 | Sigma-Aldrich | S9707 | |
| Penicillin/Streptomycin | Biochrom AG | A2213 | |
| Inverted fluorescent microscope | e.g. Nikon | Request at Nikon | |
| CoolLED | CoolLED | pE-100 | 440 nm |
| DualView | Photometrics | DV2-SYS | |
| DualView filter slider | Photometrics | 05-EM | |
| CFP/YFP filter set | Chroma Technology | 49052 | without the emission filter |
| ORCA-03G camera | Hamamatsu Photonics | C8484-03G02 | |
| Arduino I/O board | Sparkfun Electronics | DEV-00666 | |
| Attofluor cell chamber | Invitrogen | A-7816 | |
| Personal computer with WindowsXP or Windows7 system | Any supplier | Include hard-drive with high capacity |
References
- Zaccolo, M. Use of chimeric fluorescent proteins and fluorescence resonance energy transfer to monitor cellular responses. Circ. Res. 94, 866-873 (2004).
- Mehta, S., Zhang, J. Reporting from the field: genetically encoded fluorescent reporters uncover signaling dynamics in living biological systems. Annu. Rev. Biochem. 80, 375-401 (2011).
- Zhang, J., Campbell, R. E., Ting, A. Y., Tsien, R. Y. Creating new fluorescent probes for cell biology. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 3, 906-918 (2002).
- Miyawaki, A. Visualization of the spatial and temporal dynamics of intracellular signaling. Dev. Cell. 4, 295-305 (2003).
- Bunemann, M., Frank, M., Lohse, M. J. Gi protein activation in intact cells involves subunit rearrangement rather than dissociation. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100, 16077-16082 (2003).
- Kotlikoff, M. I. Genetically encoded Ca2+ indicators: using genetics and molecular design to understand complex physiology. J. Physiol. 578, 55-67 (2007).
- Willoughby, D., Cooper, D. M. Live-cell imaging of cAMP dynamics. Nat. Methods. 5, 29-36 (2008).
- Nikolaev, V. O., Lohse, M. J. Monitoring of cAMP synthesis and degradation in living cells. Physiology (Bethesda). 21, 86-92 (2006).
- Tanimura, A. Use of Fluorescence Resonance Energy Transfer-based Biosensors for the Quantitative Analysis of Inositol 1,4,5-Trisphosphate Dynamics in Calcium Oscillations. J. Biol. Chem. 284, 8910-8917 (2009).
- Nikolaev, V. O., Lohse, M. J. Novel techniques for real-time monitoring of cGMP in living cells. Handb. Exp. Pharmacol. , 229-243 (2009).
- Nausch, L. W., Ledoux, J., Bonev, A. D., Nelson, M. T., Dostmann, W. R. Differential patterning of cGMP in vascular smooth muscle cells revealed by single GFP-linked biosensors. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 365-370 (2008).
- Borner, S. FRET measurements of intracellular cAMP concentrations and cAMP analog permeability in intact cells. Nat. Protoc. 6, 427-438 (2011).
- Nikolaev, V. O., Bunemann, M., Hein, L., Hannawacker, A., Lohse, M. J. Novel single chain cAMP sensors for receptor-induced signal propagation. J. Biol. Chem. 279, 37215-37218 (2004).
- Hong, K. P., Spitzer, N. C., Nicol, X. Improved molecular toolkit for cAMP studies in live cells. BMC Res. Notes. 4, 241-24 (2011).
- Niino, Y., Hotta, K., Oka, K. Simultaneous live cell imaging using dual FRET sensors with a single excitation light. PLoS One. 4, e6036 (2009).
- Palmer, A. E., Tsien, R. Y. Measuring calcium signaling using genetically targetable fluorescent indicators. Nat. Protoc. 1, 1057-1065 (2006).
- Brumbaugh, J., Schleifenbaum, A., Stier, G., Sattler, M., Schultz, C. Single- and dual-parameter FRET kinase probes based on pleckstrin. Nat. Protoc. 1, 1044-1055 (2006).
- Aoki, K., Matsuda, M. Visualization of small GTPase activity with fluorescence resonance energy transfer-based biosensors. Nat. Protoc. 4, 1623-1631 (2009).
