Summary
एक
Protocol
1. Coverslips, संस्कृति, मध्यम और पाचन एंजाइमों की तैयारी
- 12 मिमी दौर # 1 गिलास coverslips से neuronal संस्कृति के लिए उपयोग किया जाता है. coverslips साथ 10% एचसीएल रातोंरात आसुत और विआयनीकृत पानी के साथ 3 बार (20 मिनट / समय) के लिए अल्ट्रासोनिक धोने द्वारा पीछा साफ कर रहे हैं. साफ coverslips भविष्य के उपयोग के लिए 70% इथेनॉल में जमा हो जाती है. प्रत्येक प्रयोगों से पहले, coverslips हवा सूखे और संस्कृति की थाली में रखा.
- कोट सूखे coverslips, कोटिंग 100 μg / पाली - डी - Lysine मिलीग्राम और 10 μg / एमएल laminin काम कर समाधान युक्त समाधान के 100 μl प्रत्येक coverslip पर जोड़ा जाता है और संस्कृति की थाली एक 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में स्थानांतरित कर रहा है. 1-2 घंटा के बाद, कोटिंग समाधान निकाल दिया और है coverslips बाँझ 1X पीबीएस के साथ 3 बार धोया जाता है.
- संस्कृति माध्यम, न्यूनतम आवश्यक मध्यम (सदस्य) तैयार 5% भ्रूण गोजातीय (FBS) सीरम, 1X समाधान पेनिसिलिन - स्ट्रेप्टोमाइसिन (पटृटी की 500 इकाइयों के साथ पूरक है.लिन और स्ट्रेप्टोमाइसिन की 500 μg), 1X पूरक GlutaMAX मैं, और समसूत्रणरोधी अभिकर्मकों 20 माइक्रोन से युक्त-5-2-deoxyuridine फ्लोरो और 20 माइक्रोन uridine (/ FDU आर). सीरम मुक्त मध्यम के लिए, FBS B27 पूरक के साथ बदल दिया है.
- Collagenase एक समाधान के Collagenase सदस्य के साथ एक पाउडर भंग करने के लिए 1 मिलीग्राम / एमएल के एक काम एकाग्रता से तैयार है. Trypsin के लिए, 1X TrypLE एक्सप्रेस प्रयोग किया जाता है.
2. और वयस्क माउस DRG न्यूरॉन्स के विच्छेदन हार्वेस्ट
- 6 के बाद euthanizing - 10 सप्ताह पुराने वयस्क माउस, पृष्ठीय त्वचा को हटाने और पूरे स्पाइनल कॉलम में कटौती. 1 एक्स पीबीएस के साथ 2-3 बार धोकर हटा स्पाइनल कॉलम.
- उदर ओर ऊपर, साथ विदारक थाली हटा स्पाइनल कॉलम पिन और ध्यान से मांसपेशियों को हटा एक विदारक खुर्दबीन के नीचे संवेदी तंत्रिकाओं को बेनकाब. लकड़ी के स्तर पर DRGs से जुड़े नसों बड़ी से बड़ी और आसानी से ढूँढ रहे हैं. इसलिए, सबसे प्रयोगों के लिए काठ का केवलDRGs काटा जाता है.
- छोटी कैंची से centerline के साथ प्रत्येक पृष्ठवंश के माध्यम से कटौती और ध्यान से डिस्क को दूर. संदंश का प्रयोग प्रत्येक पृष्ठवंश विभाजित करने के लिए रीढ़ की हड्डी का पर्दाफाश.
- लकड़ी DRGs काटना संदंश के साथ प्रत्येक लकड़ी तंत्रिका के उठा और रीढ़ की हड्डी की ओर का पता लगाने के लिए जुड़े काठ DRGs (L6 L1 से के लिए) का पता लगाने.
- संलग्न परिधीय तंत्रिका, वसंत कैंची के साथ पृष्ठीय और ventral जड़ों से प्रत्येक DRG कटौती, और ट्यूब में microfuge यह सदस्य मध्यम बर्फ पर रखा के साथ संग्रहीत. अलग रीढ़ की हड्डी (जैसे वक्ष DRGs) के स्तर पर और अधिक DRGs एक समान तरीके से जब आवश्यक में बाहर dissected किया जा सकता है.
3. पाचन और वयस्क माउस DRG न्यूरॉन्स की हदबंदी
- सभी विच्छेदित DRGs इकट्ठा करने के बाद, 1 मिलीग्राम Collagenase एक समाधान के साथ सदस्य मध्यम जगह और 37 ° सेल्सियस पर 90 मिनट के लिए microfuge ट्यूब सेते हैं.
- 500 μl 1X TrypLE एक्सप्रेस के साथ Collagenase एक समाधान ताकि बदलेंऔर 37 में lution सेते हैं डिग्री सेल्सियस 15-20 मिनट के लिए.
- TrypLE एक्सप्रेस समाधान निकालें और 1 मिलीग्राम 3 बार के लिए तैयार संस्कृति मध्यम (5% FBS युक्त) के साथ DRGs धोना.
- 600 μl संस्कृति मध्यम जोड़ें और धीरे विंदुक ऊपर और नीचे करने के लिए 20-30 बार एक 1 मिलीलीटर नीला है का उपयोग करने के लिए ऊतकों महीन चुर्ण बनाना, पिपेट टिप स्नातक की उपाधि प्राप्त की.
- विचूर्णन के बाद, गैर - अलग ऊतकों नीचे microfuge के नीचे के लिए व्यवस्थित करने के लिए और एक 10 मिलीलीटर बाँझ ट्यूब सेल निलंबन हस्तांतरण के लिए अनुमति देते हैं. एक और 600 μl संस्कृति के माध्यम जोड़ें और विचूर्णन कदम दोहराएँ जब तक सबसे ऊतकों अलग हैं. प्राप्त सेल निलंबन दोनों न्यूरॉन्स और गैर neuronal कोशिकाओं शामिल हैं. ज्यादातर मामलों में, 6 DRGs (~ 5 x10 4) से कोशिकाओं को एक electroporation प्रतिक्रिया के लिए उपयोग किया जाता है.
4. Electroporation के माध्यम से न्यूरॉन्स की आनुवंशिक हेरफेर
- माउस न्यूरॉन्स लिए डीएनए प्लास्मिड (~ 10 μg के साथ Amaxa nucleofection के समाधान के मिश्रण से तैयार अभिकर्मक समाधान) या siRNA oligos (~ 0.2 nmol) के प्रत्येक अभिकर्मक लिए 100 μl की अंतिम मात्रा बनाने के लिए.
- 7 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर 680 rpm पर अलग कोशिकाओं अपकेंद्रित्र, और सतह पर तैरनेवाला के रूप में बहुत संभव के रूप में त्यागें. तैयार अभिकर्मक समाधान जोड़ें और धीरे विंदुक ऊपर और नीचे 200 μl विंदुक फिर से निलंबित कोशिकाओं के लिए सुझावों के साथ 3-4 बार.
- सेल electroporation क्युवेट अभिकर्मक समाधान के साथ मिश्रित निलंबन हस्तांतरण और कोशिकाओं electroporate Amaxa Nucleofector प्रणाली कार्यक्रम जी-013 का उपयोग कर.
- Electroporation के बाद, तुरंत पूर्व गर्म 500 μl (37 डिग्री सेल्सियस) संस्कृति - क्युवेट और वांछित सेल घनत्व में लेपित संस्कृति थाली में सब समाधान (~ μl 600) हस्तांतरण के लिए FBS युक्त मध्यम. प्रयोग है कि फिर से निलंबन और फिर से चढ़ाना की आवश्यकता के लिए, न्यूरॉन्स सीधे प्लास्टिक संस्कृति पकवान पर उच्च घनत्व (10,000-20,000 कोशिकाओं / अच्छी तरह से) पर संवर्धित कर रहे हैं. प्रयोग है कि सीधे अक्षतंतु विकास की जाँच के लिए, न्यूरॉन्स चढ़ाया ontकम घनत्व (3000-5000 कोशिकाओं / अच्छी तरह से) लेपित गिलास coverslips ओ के. इनक्यूबेटर (37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ 2) में संस्कृति प्लेट रखें.
- चार घंटा चढ़ाना जब न्यूरॉन्स substrates के लिए संलग्न है के बाद, धीरे 500 μl ताजा और गर्म पूर्व मध्यम संस्कृति के साथ संस्कृति मध्यम (है जो Amaxa nucleofection समाधान शामिल हैं) की जगह, और इनक्यूबेटर अतिरिक्त संस्कृति के लिए थाली वापसी (37 डिग्री सेल्सियस 5% CO2). दोनों संस्कृति FBS युक्त मध्यम या मध्यम सीरम मुक्त इस कदम पर इस्तेमाल किया जा सकता है.
5. संवर्धन Axon विकास के विश्लेषण के लिए वयस्क DRG न्यूरॉन्स
- प्लास्मिड डीएनए के साथ ट्रांसफ़ेक्ट न्यूरॉन्स के लिए, जीन की ब्याज की अभिव्यक्ति (जैसे EGFP) के electroporation के बाद कुछ घंटे के रूप में जल्दी के रूप में मनाया जा सकता है. SiRNAs के साथ ट्रांसफ़ेक्ट न्यूरॉन्स के लिए, 3-4 दिनों के लिए हम आम तौर पर प्रतीक्षा करने के लिए अंतर्जात प्रोटीन की पर्याप्त कमी की अनुमति. सभ्य न्यूरॉन्स या तो सीधे कर सकते हैं vario पर अक्षतंतु विकास विश्लेषण के लिए तयहमें समय अंक (electroporation 1-4 दिनों के बाद) या फिर निलंबित कर दिया और अक्षतंतु पुनर्वृद्धि (देखें नीचे) का विश्लेषण करने के लिए फिर से मढ़वाया.
- आरएनएआई मध्यस्थता नुकसान के समारोह के अध्ययन के लिए, सभ्य न्यूरॉन्स फिर से निलंबित कर सकते हैं और axons न्यूरॉन्स, जो लक्षित प्रोटीन पहले ही समाप्त हो रहे हैं से regrow करने के लिए अनुमति देने के लिए फिर से मढ़वाया. ऐसा करने के लिए, 1 मिलीग्राम पूर्व गर्म ताजा मध्यम और विंदुक धीरे से ऊपर और 6-10 के लिए संस्कृति की थाली से संलग्न न्यूरॉन्स फिर से निलंबित बार के लिए नीचे के साथ उच्च घनत्व सभ्य न्यूरॉन्स की पुरानी संस्कृति के माध्यम की जगह. क्योंकि गैर neuronal कोशिकाओं (जैसे श्वान कोशिकाओं) न्यूरॉन्स से संस्कृति पकवान के लिए बहुत तंग देते हैं, फिर से निलंबित कोशिकाओं ज्यादातर न्यूरॉन्स.
- एक microfuge ट्यूब में फिर से निलंबित न्यूरॉन्स स्थानांतरण और धीरे से 10-15 बार महीन चुर्ण बनाना एकल कक्ष निलंबन में सेल clumps को फिर से अलग कर देना.
- पुन प्लेट कम घनत्व (3000-5000 कोशिकाओं / अच्छी तरह से) और संस्कृति रातोंरात पर फिर से अलग नव तैयार coverslips के पर न्यूरॉन्स (16-24 घंटा).
6. फिक्सेशन, इम्यूनो - धुंधला हो जाना, और प्रतिदीप्ति इमेजिंग
- मध्यम महाप्राण (व्यंजन) और कमरे के तापमान पर 15-20 मिनट के लिए कोशिकाओं को ठीक करने के लिए 4% (पीएफए) paraformaldehyde (200 μl /) को जोड़ने के लिए. निश्चित कोशिकाओं तो 3 बार के लिए 1X पीबीएस के साथ धोया जाता है.
- पीबीएस महाप्राण (व्यंजन) और कमरे के तापमान पर 60 मिनट के लिए निश्चित न्यूरॉन्स अवरुद्ध समाधान (1% गोजातीय सीरम albumin, 0.1% एक्स 100 ट्राइटन, और 2.0% 1X पीबीएस में सामान्य बकरी सीरम) जोड़ें.
- लेबल axons करने के लिए, न्यूरॉन्स इम्युनो - विरोधी neurofilaments या विरोधी βIII ट्यूबिलिन एंटीबॉडी के साथ दाग रहे हैं. ऐसा करने के, प्रत्येक coverslip लिए parafilm पर एक प्राथमिक एंटीबॉडी समाधान (1:1200 कमजोर पड़ने-βIII ट्यूबिलिन एंटीबॉडी के लिए) की 30μl बूंद जगह है. Coverslips पलटना और प्राथमिक एंटीबॉडी समाधान पर उन्हें कमरे के तापमान पर 60 मिनट के लिए जगह है.
- मूल संस्कृति थाली coverslips लौटें और है 1X पीबीएस के साथ 3 बार के लिए उन्हें धो लो.
- माध्यमिक एक के लिए एक ही प्रक्रिया दोहराएँ.tibody.
- आसुत जल के साथ coverslips 3 बार के लिए, धो और फिर गिलास स्लाइड पर बढ़ते समाधान (जैसे गोल्ड Antifade लम्बा) के साथ coverslips माउंट.
- दाग न्यूरॉन्स किसी भी प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी प्रणाली एक डिजिटल कैमरा के साथ सुसज्जित के साथ imaged किया जा सकता है. अक्षतंतु लंबाई मापी और इमेजिंग विश्लेषण सॉफ्टवेयर के साथ विश्लेषण कर रहे हैं.
7. प्रतिनिधि परिणाम
किसी भी जोड़ा बाह्य वृद्धि कारक की अनुपस्थिति में, आमतौर पर वयस्क DRG न्यूरॉन्स के axons पहली चढ़ाना के बाद 48 घंटा बढ़ने लगते हैं. axons अक्सर branched morphologies (चित्रा 1) बताते हैं. इसके विपरीत, फिर चढ़ाया न्यूरॉन्स के axons चढ़ाना के बाद केवल कुछ घंटे का विस्तार शुरू, और axons बहुत कम शाखाओं में बंटी (चित्रा 2) के साथ बढ़ाना. इन परिणामों का सुझाव है कि फिर से मढ़वाया न्यूरॉन्स कंडीशनिंग lesioned न्यूरॉन्स की उन लोगों के लिए इसी तरह की संपत्ति का हिस्सा है. इस दृष्टिकोण का उपयोग करके, हम हाल ही में नुकसान प्रदर्शन किया हैके कार्य करने के लिए इन विट्रो में वयस्क DRG न्यूरॉन्स से अक्षतंतु विकास में अक्षतंतु उत्थान से जुड़े प्रतिलेखन कारक ग जून की भूमिका की जांच अध्ययन नतीजे बताते हैं 4 अलग सी जून के विभिन्न क्षेत्रों (ऑन-TARGETplus) को लक्षित siRNAs का एक समूह है कि स्पष्ट रूप से electroporation अभिकर्मक के बाद 3 दिन में वयस्क DRG न्यूरॉन्स ग जून की प्रोटीन का स्तर (चित्रा 3) 9 कम. 9:, जब न्यूरॉन्स फिर से मढ़वाया और सुसंस्कृत थे रात भर, ग जून पछाड़ना न्यूरॉन्स से अक्षतंतु विकास में काफी (262.32 ± १५.६९ माइक्रोन, चित्रा 3 सी - सी - जून 348.37 ± 16.21mm नियंत्रण) कम हो गया था. इन परिणामों से संकेत मिलता है कि सुसंस्कृत वयस्क DRG न्यूरॉन्स एक उपयोगी मॉडल के लिए वयस्क न्यूरॉन्स से अक्षतंतु विकास अध्ययन प्रणाली प्रदान करते हैं.
चित्रा 1. वयस्क माउस DRG न्यूरॉन्स 3 दिनों के लिए कम घनत्व में सभ्य. न्यूरॉन्स विरोधी के साथ दाग रहे थे और नाश्ताएटा तृतीय ट्यूबिलिन प्रतिरक्षी;. ध्यान दें कि सबसे axons branched morphologies बताते हैं. स्केल पट्टी: 125 माइक्रोन.
चित्रा 2. पुन चढ़ाना वयस्क माउस संस्कृति में 3 दिनों के बाद न्यूरॉन्स DRG. (ए) वयस्क DRG न्यूरॉन्स 3 दिनों के लिए उच्च घनत्व में सभ्य. (बी) पुन चढ़ाया वयस्क DRG न्यूरॉन्स रात भर के लिए कम घनत्व में संवर्धन किया गया. नोट सबसे अक्षतंतु थोड़ा अक्षतंतु शाखाओं में बंटी के साथ लम्बी morphologies दिखा. पैमाने पर पट्टी: बी में एक और 125 माइक्रोन 250 माइक्रोन
चित्रा 3 ग जून की इन विट्रो में वयस्क DRG न्यूरॉन्स से अक्षतंतु विकास में भूमिका. वयस्क चूहे में (ए) ग जून के पश्चिमी धब्बा विश्लेषण ग जून siRNAs की electroporation के बाद न्यूरॉन्स DRG. परिणाम ग जून की स्पष्ट रूप से कम स्तर को दर्शाता है. (ख) नियंत्रण EGFP साथ ट्रांसफ़ेक्ट न्यूरॉन्स फिर चढ़ाना और रातोंरात संस्कृति लंबे समय के बाद axons बढ़ी. (सी) सह ट्रांसग जून siRNAs और फिर चढ़ाना और रातोंरात संस्कृति के बाद वयस्क DRG न्यूरॉन्स से EGFP बिगड़ा अक्षतंतु विकास की fection. लाल: Tuj-1 धुंधला, ग्रीन: EGFP. स्केल पट्टी: 125 माइक्रोन. इन परिणामों Saijilafu एट अल में प्रकाशित किया गया है 9.
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Discussion
वयस्क DRG न्यूरॉन्स और vivo में इन विट्रो में परिधीय तंत्रिका चोट के बाद मजबूती के साथ उनके axons पुनर्जन्म, इस प्रकार अक्षतंतु उत्थान के लिए वयस्क पशुओं में अध्ययन के लिए एक उपयोगी प्रणाली प्रदान करते हैं. वयस्क DRG न्यूरॉन्स की इन विट्रो संस्कृति में व्यापक रूप से इस्तेमाल करने के लिए आणविक तंत्र की जांच तरीका बनता जा रहा है जिसके द्वारा अक्षतंतु पुनर्जनन नियंत्रित किया जाता है. संवर्धन वयस्क माउस DRG न्यूरॉन्स की इन विट्रो प्रक्रिया में प्रस्तुत यहाँ पुनर्योजी अक्षतंतु विकास की तेजी से और प्रभावी आनुवंशिक अध्ययन के लिए सक्षम बनाता है. प्रक्रिया फिर से निलंबन और फिर चढ़ाना नुकसान के समारोह के अध्ययन के लिए विशेष रूप से उपयोगी है क्योंकि यह axons न्यूरॉन्स में जो लक्षित प्रोटीन पहले ही समाप्त कर दिया गया है से फिर से बढ़ने की अनुमति देता है. इसके अलावा, फिर से चढ़ाना सुसंस्कृत DRG न्यूरॉन्स vivo कंडीशनिंग घाव प्रभाव में mimics, इस प्रकार एक अधिक शारीरिक प्रासंगिक अक्षतंतु उत्थान के लिए इन विट्रो में अध्ययन दृष्टिकोण प्रदान करते हैं.
वयस्क DRG n अभिकर्मक दक्षतावर्णित electroporation दृष्टिकोण के साथ eurons डीएनए constructs, जो अक्षतंतु वृद्धि की morphological विश्लेषण के लिए पर्याप्त है के आकार पर निर्भर करता है प्लास्मिड के लिए 20-50% के बारे में है. Electroporation के मुकाबले, वायरल की मध्यस्थता जीन स्थानांतरण बहुत उच्च दक्षता है, जो जैव रासायनिक विश्लेषण का उपयोग DRG न्यूरॉन्स के लिए उपयुक्त है. हालांकि, निर्माण और प्रत्येक जीन के हित के लिए वायरस का उत्पादन बहुत अधिक श्रम गहन और समय लेने वाली है. SiRNA oligos के लिए, अभिकर्मक दक्षता लक्षित प्रोटीन (चित्रा 3A देखें) है, जो वयस्क DRG संभव न्यूरॉन्स की जैव रासायनिक विश्लेषण करता है के नीचे दस्तक दक्षता के आधार पर लगभग 90% तक पहुँच सकते हैं. हालांकि, siRNAs के प्रभाव अब siRNA oligos की गिरावट के लिए कारण अवधि के बाद कम कर देता है.
जब न्यूरॉन्स 2 1:1 के अनुपात में मिश्रित प्लास्मिड के साथ सह में ट्रांसफ़ेक्ट, छोटे आकार के साथ प्लाज्मिड आम तौर पर बड़े आकार के साथ प्लाज्मिड से उच्च दक्षता अभिकर्मक है. गिरफ्तारी के रूप मेंesult, दो plasmids के अनुपात को समायोजित सह - अभिकर्मक दक्षता के हिसाब से बदल जाएगा. SiRNA को अभिकर्मक के लिए, हम अक्सर लेबल न्यूरॉन्स को EGFP साथ न्यूरॉन्स सह transfect. क्योंकि siRNA को oligos EGFP की तुलना में बहुत छोटे होते हैं, उनके अभिकर्मक क्षमता बहुत अधिक है. इसलिए, हमारे प्रयोगों में हम आम तौर पर लगता है कि सभी EGFP सकारात्मक न्यूरॉन्स भी siRNAs के लिए सकारात्मक हैं.
कई परिधीय axotomy के बाद वयस्क DRG न्यूरॉन्स की आनुवंशिक रूपरेखा अध्ययन (टुकड़े) उत्थान से जुड़े जीन की एक बड़ी संख्या में 10-12, जो वयस्क DRG न्यूरॉन्स की पुनर्जनन क्षमता आबाद विश्वास कर रहे हैं की पहचान की है. हालांकि, वयस्क DRG न्यूरॉन्स की अक्षतंतु विकास mediating में इन लत्ता के कार्यों को अच्छी तरह से नहीं किया गया विशेषता है. यहाँ हम वयस्क DRG न्यूरॉन्स से आरएनएआई की मध्यस्थता दृष्टिकोण नुकसान के समारोह के माध्यम से अक्षतंतु विकास mediating में एक चीर अच्छी तरह से जाना जाता है, ग जून की भूमिका की जांच की. ऐसी विधि इन विट्रो उपकरण में एक मूल्यवान जांच के लिए प्रदान करता हैते अक्षतंतु उत्थान के नियमन में अन्य टुकड़े की भूमिका.
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Disclosures
ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.
Acknowledgments
इस काम FZ करने के लिए (R01NS064288) NIH और क्रेग एच. Neilsen फाउंडेशन से अनुदान द्वारा समर्थित किया गया.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| MEM | Invitrogen | 11090-081 | |
| Poly-D-Lysine hydrobromide | Sigma -Aldrich | P6407 | |
| Laminin | Invitrogen | 23017-015 | |
| 5-fluoro-2-deoxyuridine | Sigma -Aldrich | F0503 | |
| Uridine | Sigma -Aldrich | U3003 | |
| Collagenase A | Roche | 10103578001 | |
| TrypLE Express | Invitrogen | 12604-013 | |
| Fetal bovine serum | Invitrogen | 10270-098 | |
| Penicillin-streptomycin (100X) | Invitrogen | 15140-122 | |
| GlutaMAX-I (100X) | Invitrogen | 35050-038 | |
| Glass coverslips (#1) | Electron Microscopy sciences | 72196-12 | |
| 24 well cell culture plate | Becton Dickinson | 35-3047 | |
| 1X PBS | Mediatech | 21-040-CV | |
| Sterile, distilled and deionized water | Mediatech | 25-055-CV | |
| Nucleofector and electroporation Kits for Mouse Neurons | Lonza | VPG-1001 | |
| ON-TARGETplus siRNA against c-Jun | Dharmacon | L-043776 | |
| Anti--βIII tubulin antibody (Tuj-1) | Covance | MMS-435P | |
| ProLong Gold Antifade mounting solution | Invitrogen | P36930 |
References
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