Summary
Abstract
이곳은 중추 신경계 (CNS)에서 성숙한 뉴런이 성숙 CNS의 1,2의 축삭의 성장과 적대적인 환경을 지원하는 줄었 본질적인 기능으로 인해 부상 후 자신의 axons을 다시 생성 수 없다고 알려져있다. 반대로, 말초 신경 계통의 성숙한 뉴런 (PNS)는 부상 3 후 즉시 재생. 성인 지느러미 루트 신경절 (DRG) 뉴런이 잘 말초 신경 부상 후 robustly 재생하는 것으로 알려져 있습니다. 주변 목표 및 척수쪽으로 뻗어 있고 중앙 지점 innervating 말초 지점 : 각 DRG 신경 세포는 세포 소마의 어느 지점이 axonal 가지로 하나 축삭을 자랍니다. 실질적인 축삭 재생의 DRG 주변 axons 결과의 부상은 척수 중앙 axons 반면 부상 이후 저조한 재생. 주변 axonal 부상 척수 부상 (프로세스 조절 장애라고도 함), 중앙 axons의 중생 이전에 발생하는 경우에는 greatl입니다y는 4 개선. 또한, DRG 뉴런의 중심 axons은 척수에 corticospinal의 axons 내림차순 같은 적대적인 환경을 공유할 수 있습니다. 함께, 그것은 성인 DRG의 신경 세포의 축삭 재생을 제어하는 분자 메커니즘은 CNS의 축삭 재생을 향상시키기 위해 무력화 할 수있는 가상있다. 그 결과, 성인 DRG의 뉴런은 현재 폭넓게 재생 축삭의 성장은 5-7 공부를 모델 시스템으로 사용됩니다.
여기에서 우리는 체외에서 축삭 재생의 유전 연구에 사용할 수있는 성인 DRG 신경 세포 문화의 방법을 설명합니다. 이 모델의 성인에서는 DRG의 신경 세포는 유전자 electroporation-매개 유전자 transfection 6,8 통해 조작됩니다. DNA를 플라스미드 또는시 / shRNA, 이러한 방식은 성인 DRG의 뉴런의 축삭의 성장에있는 유전자의 이익의 역할을 조사하기 위해 모두 이득과 손실 함수 실험을 수있는 뉴런을 transfecting함으로써. 뉴런은시 / shRNA으로 transfected 때, 타겟 내생 단백질입니다일반적으로 손실 기능 연구가 덜 효과적으로 만드는, 시간 강력한 축삭의 성장 이미 문제가 발생한 기간 동안 문화 3-4일, 후에 고갈. 이 문제를 해결하기 위해서 여기 설명한 방법은 axons가 타겟 단백질의 부재에있는 뉴런에서 다시 성장할 수 있도록 transfection 후 다시 중지하고 다시 도금 단계가 포함되어 있습니다. 마지막으로, 우리는 성인 DRG 뉴런 9 축삭의 성장을 중재로 축삭 재생 - 관련 유전자, C-6월의 역할을 공부 체외 모델에서 이것을 사용하는 예제를 제공합니다.
Protocol
1. Coverslips, 문화 매체, 및 소화 효소의 작성
- 12-mm 라운드 # 1 유리 coverslips이의 연결을 문화를 위해 사용됩니다. 10 % HCL은 하룻밤 사이에 3 회 (20 분 / 시간)에 증류수와 탈이온수와 초음파 세척을 다음과 coverslips가 청소됩니다. 청소 coverslips는 향후 사용을위한 70 %의 에탄올에 저장됩니다. 각 실험 전에 coverslips는 공기가 문화 판으로 건조와 배치됩니다.
- 코트에 마른 coverslips, 100 μg / ML 폴리-D-라이신 및 10 μg / ML Laminin 작업 솔루션을 포함하는 코팅 용액을 100 μl은 각 coverslip 위에 추가되고 문화 판은 37 ° C 배양기로 전송됩니다. 1-2 시간 후에 코팅 용액이 제거되고 coverslips는 무균 1X PBS로 3 회 씻어하고 있습니다.
- 문화 매체, 최소 필수 중간 (MEM)를 준비하는 것은 5퍼센트 태아 소 혈청 (FBS), 페니실린 1X-스트렙토 마이신 솔루션 (penicil 500 단위로 보충된다린 및 스트렙토 마이신 500 μg), 1X GlutaMAX - 나 보충 및 antimitotic의 시약은 20 μm의를 포함하는 5 - 플루오로 -2 - deoxyuridine 및 20 μm의 유리딘 (FDU / R). 혈청이없는 배지의 경우 FBS가 보충 B27로 바뀝니다.
- collagenase이 솔루션은 1 밀리그램 / ML의 작동 농도를 만들기 위해 collagenase에게 MEM과 분말을 해소하여 준비가되어 있습니다. 트립신은 1X TrypLE 익스프레스가 사용됩니다.
2. 성인 마우스 DRG의 신경의 해부와 수확
- 6 euthanizing 후 - 10 주 된 성인 마우스로, 지느러미 피부를 제거하고 전체 척추를 잘라. 1 X PBS ~ 3 배로 제거된 척추 씻으십시오.
- 복부 측면까지와 해부 접시에 제거된 척수 열을 핀과 조심스럽게 해부 현미경으로 감각 신경을 폭로하기 위해 근육을 제거합니다. 목재 수준에서 DRGs에 연결된 신경을 찾아낼 두꺼운하고 쉽습니다. 따라서 대부분의 실험을위한 요추에만DRGs가 수확됩니다.
- 작은 가위로 중심선을 따라 각 척추골로 잘라 조심스럽게 척추 디스크를 제거합니다. 척수를 노출 각 척추골을 분할하기 위해 집게를 사용하여.
- 목재 DRGs를 해부하려면 포셉 각 목재 용기를 들어 관련 허리 DRGs을 (L1에서 L6까지) 찾습니다 척수쪽으로 추적.
- 첨부 말초 신경, 스프링 가위로 지느러미와 복부 뿌리에서 각 DRG를 자르면 얼음에 위치 MEM 매체와 microfuge 튜브에 저장합니다. 다른 척수 수준 (예 : 흉부 DRGs)에서 더 많은 DRGs는 유사한 방법으로 필요한 경우에 해부를 할 수 있습니다.
3. 소화와 성인 마우스 DRG의 신경 세포의 분리
- 모든 해부 DRGs를 수집 후, 1 ML의 collagenase 솔루션 MEM 미디어를 교체하고 90 분 동안 37 ° C에서 microfuge 튜브를 품어.
- 그래서 500 μl 1X TrypLE 익스프레스와 collagenase 용액 교체37 lution하고 품어 ° C에서 15-20 분.
- TrypLE 익스프레스 솔루션을 제거하고 3 회 1 ML 준비한 배지 (5 % FBS를 포함)로 DRGs 씻는다.
- 600 μl 배지를 추가하고 부드럽게 한 ML 파란색을 사용하여 20-30 회 조직을 씹다 아래로까지 피펫 및 피펫 팁은 졸업했습니다.
- 분쇄 후 비 dissociated 조직은 microfuge 하단으로 정착하고 10 ML 멸균 튜브에 세포 현탁액을 전송할 수 있습니다. 또 600 μl 배지를 추가하고 대부분의 조직은 dissociated 때까지 분쇄 단계를 반복하십시오. 얻은 세포 현탁액은 뉴런과 비의 연결 세포가 모두 포함되어 있습니다. 대부분의 경우, 6 DRGs (~ 5 x10 4)에서 세포 하나 electroporation 반응에 사용됩니다.
4. Electroporation을 통한 신경 세포의 유전자 조작
- 의 DNA plasmids (~ 10 μg으로 마우스 뉴런에 대한 Amaxa의 nucleofection 솔루션을 혼합하여 transfection 솔루션을 준비) 나 siRNA를 oligos이 (~ 0.2 nmol) 각 transfection 100 μl의 최종 볼륨을 만들 수 있습니다.
- 상온에서 7 분을위한 680 rpm으로 dissociated 세포를 원심 분리기, 그리고 가능한 한 많이 뜨는 버리고. 준비된 transfection 솔루션을 추가하고 부드럽게 다시 중단 전지 200 μl 피펫 팁으로 3-4 회를 아래로 피펫합니다.
- electroporation의 cuvette에 transfection 솔루션과 혼합 세포 현탁액을 전송하고 Amaxa Nucleofector 시스템 프로그램 G-013을 사용하여 세포를 electroporate.
- electroporation 후 즉시 사전 예열 500 μl를 추가 (37 ℃) cuvette하여 원하는 세포 밀도에 코팅된 배양 접시에 모든 솔루션 (~ 600 μl)를 전송에 FBS를 포함한 배지. 다시 정지하고 다시 도금을 필요로 실험 내용은 뉴런은 고밀도 (10000-20000 세포 /도)에서 플라스틱 배양 접시에 직접 배양해 있습니다. 직접 축삭의 성장을 검사 실험 내용은 뉴런은 도금 ont 있습니다낮은 밀도 (3000-5000 세포 / 음)로 코팅된 유리 coverslips을 O. 배양기 (37 ° C에서 5 % CO 2)에 문화 접시를 놓습니다.
- 뉴런은 기판에 부착했을 때 도금 후 네 시간은 부드럽게 500 μl 신선하고 사전 예열 문화 매체와 문화 매체 (Amaxa의 nucleofection 솔루션을 포함) 교체, 그리고 (37 ° C에서 추가적인 문화를 위해 배양기에 플레이트를 반환 , 5 %) 2 공동. FBS를 포함하는 두 문화 매체 또는 혈청이없는 매체는이 단계에서 사용할 수 있습니다.
5. 축삭의 성장 분석을위한 Culturing 성인 DRG 뉴런
- 의 DNA plasmids으로 transfected 뉴런 들면, 유전자의 - 관심의 표현 (예 EGFP) electroporation 후 몇 시간 일찍 볼 수 있습니다. siRNAs로 transfected 뉴런의 경우, 우리는 일반적으로 내생 단백질의 충분한 파괴를 허용하도록 3~4일 기다립니다. 교양 뉴런은 직접 vario에서 축삭의 성장 분석에 해결할 수 있습니다우리에게 시간은 포인트 (1-4일 electroporation 이후)하거나 다시 중단 및 축삭 regrowth를 (아래) 분석을 다시 도금.
- RNAi - 중재 손실 기능 연구의 경우 교양 뉴런이 다시 정지 수 있으며 axons은 타겟 단백질이 이미 소진되는 뉴런에서 regrow 수 있도록 다시 도금. 이렇게하려면 문화 판에서 연결된 뉴런을 다시 정지를 6-10 번 1 ML 미리 예열 신선한 매체와 피펫 부드럽게 위아래로 고밀도 교양 뉴런의 옛 문화 매체를 교체하십시오. 이외의 연결을 세포 (예 Schwann 세포) 뉴런보다 문화 접시에 많은 어깨를 첨부하기 때문에 다시 중단 전지는 주로 뉴런 있습니다.
- microfuge 튜브로 다시 정지 뉴런을 전송하고 부드럽게 단일 세포 현탁액으로 세포 대단히 짧은 시간을 다시 떼어 놓다하기 10-15 번 씹다.
- 저밀도 (3000-5000 세포 / 음)과 문화를 하루아침에 새롭게 준비 coverslips쪽으로 재 판 다시 dissociated 뉴런 (16-24 시간).
6. 고정, Immuno-염색법과 형광 이미징
- 매체를 대기음하고 실온 15-20 분 세포를 해결하기 위해 4 % paraformaldehyde (PFA) (물론 200 μl /)를 추가합니다. 고정된 세포 그러면 3 회 대한 1X PBS로 씻어 있습니다.
- PBS를 대기음하고 실온에서 60 분 대한 고정 뉴런에 차단 솔루션 (1 % 소 혈청 알부민, 0.1 % 트리톤 X-100, 및 1X PBS에 2.0 % 정상 염소 혈청)을 추가합니다.
- 라벨 axons에게, 뉴런 안티 neurofilaments 또는 방지 βIII tubulin 항체와 immuno-묻은입니다. 이렇게하려면 각 coverslip에 대한 parafilm에 대한 일차 항체 용액 (-βIII의 tubulin 항체에 대한 1:1200 희석)의 30μl 방울을 넣으십시오. coverslips를 반전하고 실온에서 60 분 동안 일차 항체 용액에 넣어.
- 원래 문화 판에 coverslips 반환하고 3 번을 1X PBS로 그들을 씻는다.
- 보조에 대해 동일한 절차를 반복합니다tibody.
- 3 회 동안 증류수로 coverslips 씻어 다음 마운팅 솔루션 (예 : 골드 Antifade을 연장)와 함께 유리 슬라이드에 coverslips를 탑재합니다.
- 스테인드 뉴런은 디지털 카메라가 설치된 모든 형광 현미경 시스템과 몇 군데하실 수 있습니다. 축삭의 길이는 측정 및 이미징 분석 소프트웨어로 분석된다.
7. 대표 결과
모든 부가 세포 성장 인자의 부재에서, 성인 DRG의 뉴런은 보통 첫번째 도금 후 axons 48 시간 재배를 시작합니다. axons은 종종 측쇄 morphologies를 (그림 1)를 보여줍니다. 대조적으로 다시 도금 뉴런은 도금 후 axons에게 단 몇 시간을 연장하기 시작하고 axons는 훨씬 줄어들 분기 (그림 2)와 함께 연장하다. 이러한 결과는 다시 도금 뉴런은 에어컨 lesioned 뉴런의 사람들에게 유사한 속성을 공유하는 것이 좋습니다. 이 접근법을 사용함으로써, 우리는 최근 수행한 손실에게의 기능은 체외 연구에서 성인 DRG 뉴런의 축삭의 성장에서 축삭 재생 관련된 전사 인자 C-6월의 역할을 검토합니다. 결과는 C-6월의 다른 지역 (ON-TARGETplus) 대상으로 4 개의 siRNAs의 그룹의 electroporation은 현저하게 (그림 3) 삼일 transfection 후 성인 DRG의 뉴런에서 9 C-6월의 단백질 수준을 감소했다. 9 :; C-6월의 최저의 뉴런에서 뉴런들이 다시 도금 및 교양 있었다 하룻밤, 축삭의 성장이 크게 (262.32 ± 15.69 μm의, 그림 3시-C-6월 348.37 ± 16.21mm 제어) 감소했다. 이러한 결과는 그 교양 성인 DRG의 뉴런은 성인 뉴런의 축삭의 성장을 공부하는 유용한 모델 시스템을 제공 나타냅니다.
그림 1. 성인 마우스 DRG의 뉴런은 3 일 동안 저밀도에서 배양해. 뉴런은 안티 물들일되었습니다 - 식사와 침대ETA, III의 tubulin 항체. 대부분 axons는 측쇄 morphologies 표시합니다. 스케일 바 : 125 μm의.
그림 2. 문화 3 일 후에 신경을 DRG 다시 도금 성인 마우스. () 성인 DRG의 뉴런은 3 일 동안 고밀도로 배양해. (B) 재 도금 성인 DRG의 뉴런은 하룻밤을위한 저밀도에서 배양해되었다. 대부분의 축삭은 작은 축삭 분기와 길쭉한 morphologies를 표시합니다. 스케일 바 : B에 A와 125 μm의 250 μm의
그림 3. 체외에서 성인 DRG의 신경 세포의 축삭의 성장에 C-6월의 역할. C-6월 siRNAs의 electroporation 후 뉴런을 DRG 성인 마우스에서 C-6월의 () 서양 얼룩 분석. 그 결과 C-6월의 현저하게 감소 수준을 보여줍니다. (B) EGFP로 transfected 제어 뉴런은 다시 도금 및 야간 문화 후에도 긴 axons 자랐습니다. (C) 공동 트랜스C-6월 siRNAs하고 다시 도금 및 야간 문화가 후에 성인이 DRG 뉴런에서 EGFP 장애의 축삭의 성장 fection. 빨간색 : Tuj-1 염색법, 녹색 : EGFP. 스케일 바 : 125 μm의. 이러한 결과는 Saijilafu 외 년에 출판되었습니다. 9.
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Discussion
성인 DRG의 뉴런 이렇게 어른 동물로 축삭 재생을 연구하는 유용한 시스템을 제공 robustly 생체내 및 시험 관내에서 말초 신경 손상 후 자신의 axons을 다시 생성. 성인 DRG의 신경 세포의 체외 배양에서 분자 메커니즘을 조사하기 위해 널리 사용되는 방법이되고있는 작품 축삭 재생이 규제된다. culturing 성인 마우스 DRG 뉴런의 체외 프로 시저에 현재 재생 축삭 성장의 신속하고 효과적인 유전자 연구를 가능하게 표현했습니다. 그것이 axons가 타겟 단백질이 이미 소진되어있는 뉴런에서 다시 성장할 수 있기 때문에 재 정지하고 다시 도금 절차 손실 기능 연구에 특히 유용합니다. 또한, 다시 도금 교양 DRG의 뉴런 따라서 체외에서 축삭 재생을 연구하는 많은 생리적 관련성 접근 방법을 제공 생체내 컨디셔닝 병변 효력을 모방한 것이었 지요.
성인 DRG N의 transfection 효율설명 electroporation 접근과 eurons는 축삭의 성장의 형태학의 분석을 위해 충분 구조의 크기에 따라 DNA의 plasmids에 대해 20-50 % 정도입니다. electroporation으로 비교, 바이러스성-매개 유전자 전달은 DRG 뉴런을 사용하여 생화 학적 분석에 적합 훨씬 높은 효율을 가지고 있습니다. 그러나, 건설 및 각 유전자의 이익을 위해 바이러스를 생산하는 것은 훨씬 더 노동 집약과 시간이 소요됩니다. siRNA의 oligos 경우, transfection 효율이 가능 성인 DRG 뉴런의 생화 학적 분석을하게 타겟 단백질 (그림 3A 참조)의 쓰러뜨린 효율성을 바탕으로 90 %까지 도달할 수 있습니다. 그러나, siRNAs의 효과는 siRNA의 oligos의 저하로 인해 더 이상 기간이 지나면 줄어 듭니다.
뉴런은 1시 1분 비율로 섞어 2 plasmids와 공동으로 transfected 때, 작은 크기와 플라스미드는 일반적으로 더 큰 사이즈와 플라스미드보다 높은 transfection 효율을 가지고 있습니다. AR로esult는 두 plasmids의 비율을 조정하면 이에 따라 공동 transfection 효율을 변경됩니다. siRNA의 transfection을 위해서는 자주 레이블 뉴런에 EGFP와 뉴런을 공동 transfect. siRNA의 oligos은 EGFP보다 훨씬 작은 있기 때문에, 그들의 transfection 효율이 훨씬 높다. 따라서, 우리의 실험에서 우리는 일반적으로 모든 EGFP 긍정적인 뉴런은 또한 siRNAs 양성 반응이라고 생각합니다.
주변 axotomy 후 성인 DRG 뉴런의 대부분은 유전자 프로 파일링 연구는 성인 DRG의 신경 세포의 재생 능력을 기초로 생각하고 중생 - 관련 유전자 대량 (넝마) 10-12를 확인했습니다. 그러나 성인 DRG의 신경 세포의 축삭의 성장을 중재 이러한 넝마의 기능이 잘 특성화되지 않았습니다. 여기 RNAi - 중재 손실 함수 접근법을 통해 성인 DRG의 신경 세포에서 축삭의 성장을 중재에 잘 알려진 걸레, C-6월의 역할을 조사했다. 이러한 방법은 investiga에 체외 도구에 가치를 제공합니다네이트 축삭 재생 규제의 다른 넝마의 역할.
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Disclosures
관심의 어떠한 충돌 선언 없습니다.
Acknowledgments
이 작품은 NIH (R01NS064288)와 크레이그 H. Neilsen 재단 FZ의 보조금에 의해 지원되었다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| MEM | Invitrogen | 11090-081 | |
| Poly-D-Lysine hydrobromide | Sigma -Aldrich | P6407 | |
| Laminin | Invitrogen | 23017-015 | |
| 5-fluoro-2-deoxyuridine | Sigma -Aldrich | F0503 | |
| Uridine | Sigma -Aldrich | U3003 | |
| Collagenase A | Roche | 10103578001 | |
| TrypLE Express | Invitrogen | 12604-013 | |
| Fetal bovine serum | Invitrogen | 10270-098 | |
| Penicillin-streptomycin (100X) | Invitrogen | 15140-122 | |
| GlutaMAX-I (100X) | Invitrogen | 35050-038 | |
| Glass coverslips (#1) | Electron Microscopy sciences | 72196-12 | |
| 24 well cell culture plate | Becton Dickinson | 35-3047 | |
| 1X PBS | Mediatech | 21-040-CV | |
| Sterile, distilled and deionized water | Mediatech | 25-055-CV | |
| Nucleofector and electroporation Kits for Mouse Neurons | Lonza | VPG-1001 | |
| ON-TARGETplus siRNA against c-Jun | Dharmacon | L-043776 | |
| Anti--βIII tubulin antibody (Tuj-1) | Covance | MMS-435P | |
| ProLong Gold Antifade mounting solution | Invitrogen | P36930 |
References
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