Summary

Studio genetico della rigenerazione assonale con colture di neuroni adulti Root dorsali gangliari

Published: August 17, 2012
doi:

Summary

Un<em> In vitro</em> Modello per lo studio genetico della rigenerazione assonale adulte di topo in coltura con neuroni dei gangli della radice dorsale è descritto. Il metodo comprende una fase re-suspension/re-plating per consentire assoni ricrescita di neuroni sottoposti manipolazione genetica. Questo approccio è particolarmente utile per la perdita di funzione studi di rigenerazione degli assoni usando RNAi-based knockdown proteine.

Abstract

È noto che i neuroni maturi nel sistema nervoso centrale (CNS) non può rigenerare loro assoni dopo lesioni per diminuita capacità intrinseca di supportare la crescita assonale e un ambiente ostile in 1,2 maturo CNS. Al contrario, i neuroni maturi nel sistema nervoso periferico (PNS) rigenerare facilmente dopo lesioni 3. Adulti dei gangli della radice dorsale (DRG) i neuroni sono ben noti per rigenerare robusto dopo lesioni dei nervi periferici. Ogni neurone DRG cresce uno assone dal soma cellulare, che si dirama in due rami assonali: un ramo periferico innerva bersagli periferici e un ramo centrale che si estende nel midollo spinale. Lesioni dei DRG risultati assoni periferici nella rigenerazione degli assoni sostanziale, mentre gli assoni centrali nel midollo spinale rigenerare poco dopo la lesione. Tuttavia, se la lesione assonale periferico si verifica prima della lesione del midollo spinale (un processo chiamato la lesione condizionamento), rigenerazione di assoni centrali è greatly migliorata 4. Inoltre, gli assoni dei neuroni centrali DRG condividono lo stesso ambiente ostile come discendente assoni corticospinali nel midollo spinale. Insieme, si ipotizza che i meccanismi molecolari che controllano la rigenerazione degli assoni dei neuroni DRG adulti può essere sfruttata per migliorare la rigenerazione degli assoni del SNC. Come risultato, i neuroni DRG adulti vengono ora ampiamente utilizzato come sistema modello per studiare la crescita assonale rigenerativa 5-7.

Qui si descrive un metodo di coltura adulto DRG neurone che possono essere utilizzati per lo studio della rigenerazione assonale genetica in vitro. In questo modello i neuroni DRG adulti sono geneticamente manipolati tramite elettroporazione trasfezione mediata gene 6,8. Trasfettando neuroni con DNA plasmidico o SI / shRNA, questo approccio permette sia di guadagni e perdite di funzione esperimenti per studiare il ruolo di ogni gene d'interesse in crescita degli assoni dai neuroni DRG adulti. Quando i neuroni sono trasfettate con SI / shRNA, la proteina endogena è miratadi solito dopo 3-4 giorni impoverito nella cultura, durante i quali il tempo robusta crescita degli assoni è già verificato, rendendo la perdita di funzione studi meno efficace. Per risolvere questo problema, il metodo qui descritto comprende una risospensione e ri-placcatura passo dopo trasfezione, che permette di assoni ricrescere dai neuroni in assenza della proteina mirata. Infine, forniamo un esempio di utilizzo di questo modello in vitro per studiare il ruolo di un gene associato rigenerazione degli assoni, c-Jun, a mediare la crescita degli assoni dei neuroni DRG da adulto 9.

Protocol

1. Preparazione di vetrini coprioggetti, terreno di coltura, e enzimi digestivi Il 12-mm tondo # 1 vetrini vengono utilizzati per la coltura neuronale. Le coprioggetti vengono puliti con il 10% HCL notte seguito da lavaggio ad ultrasuoni con acqua distillata deionizzata e per 3 volte (20 minuti / tempo). Le coprioggetti puliti sono memorizzati in etanolo 70% per un uso futuro. Prima di ogni sperimentazione, i coprioggetti sono dotate di aria essiccata e inseriti nella piastra di coltura. Per rivesti…

Discussion

Adulti neuroni DRG rigenerare i loro assoni robusta dopo lesioni dei nervi periferici in vivo e in vitro, fornendo così un sistema utile per studiare la rigenerazione degli assoni negli animali adulti. Coltura in vitro di neuroni DRG adulti sta diventando un metodo ampiamente utilizzato per studiare i meccanismi molecolari attraverso i quali la rigenerazione degli assoni è regolamentata. La procedura in vitro di neuroni adulti, la coltura del mouse DRG qui presentato consente una ra…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Questo lavoro è stato supportato da sovvenzioni a favore di FZ dal NIH (R01NS064288) e Craig H. Neilsen Foundation.

Materials

Name of the reagent Company Catalogue number
MEM Invitrogen 11090-081
Poly-D-Lysine hydrobromide Sigma -Aldrich P6407
Laminin Invitrogen 23017-015
5-fluoro-2-deoxyuridine Sigma -Aldrich F0503
Uridine Sigma -Aldrich U3003
Collagenase A Roche 10103578001
TrypLE Express Invitrogen 12604-013
Fetal bovine serum Invitrogen 10270-098
Penicillin-streptomycin (100X) Invitrogen 15140-122
GlutaMAX-I (100X) Invitrogen 35050-038
Glass coverslips (#1) Electron Microscopy sciences 72196-12
24 well cell culture plate Becton Dickinson 35-3047
1X PBS Mediatech 21-040-CV
Sterile, distilled and deionized water Mediatech 25-055-CV
Nucleofector and electroporation Kits for Mouse Neurons Lonza VPG-1001
ON-TARGETplus siRNA against c-Jun Dharmacon L-043776
Anti–βIII tubulin antibody (Tuj-1) Covance MMS-435P
ProLong Gold Antifade mounting solution Invitrogen P36930

References

  1. Yiu, G., He, Z. Glial inhibition of CNS axon regeneration. Nat. Rev. Neurosci. 7, 617-627 (2006).
  2. Liu, K., Tedeschi, A., Park, K. K., He, Z. Neuronal Intrinsic Mechanisms of Axon Regeneration. Annu. Rev. Neurosci. , (2010).
  3. Zhou, F. Q., Snider, W. D. Intracellular control of developmental and regenerative axon growth. Philos. Trans. R. Soc. Lond. B. Biol. Sci. 361, 1575-1592 (2006).
  4. Neumann, S., Woolf, C. J. Regeneration of dorsal column fibers into and beyond the lesion site following adult spinal cord injury. Neuron. 23, 83-91 (1999).
  5. Liu, R. Y., Snider, W. D. Different signaling pathways mediate regenerative versus developmental sensory axon growth. J. Neurosci. 21, RC164 (2001).
  6. Zhou, F. Q. Neurotrophins support regenerative axon assembly over CSPGs by an ECM-integrin-independent mechanism. J. Cell Sci. 119, 2787-2796 (2006).
  7. Zou, H., Ho, C., Wong, K., Tessier-Lavigne, M. Axotomy-induced Smad1 activation promotes axonal growth in adult sensory neurons. J. Neurosci. 29, 7116-7123 (2009).
  8. Zhou, F. Q., Zhou, J., Dedhar, S., Wu, Y. H., Snider, W. D. NGF-induced axon growth is mediated by localized inactivation of GSK-3beta and functions of the microtubule plus end binding protein APC. Neuron. 42, 897-912 (2004).
  9. Saijilafu, E. M., Hur, F. Q., Zhou, Genetic dissection of axon regeneration via in vivo electroporation of adult mouse sensory neurons. Nat. Commun. 2, 543-54 (2011).
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  11. Xiao, H. S. Identification of gene expression profile of dorsal root ganglion in the rat peripheral axotomy model of neuropathic pain. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99, 8360-8365 (2002).
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Cite This Article
Saijilafu, Zhou, F. Genetic Study of Axon Regeneration with Cultured Adult Dorsal Root Ganglion Neurons. J. Vis. Exp. (66), e4141, doi:10.3791/4141 (2012).

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