Summary
इस प्रोटोकॉल में एकरूपता के एक उच्च डिग्री के साथ उप माइक्रोन आकार के लिपिड vesicles के तैयार करने के लिए बाहर निकालना विधि का वर्णन करता है. इस विधि में liposome तैयारी के लिए नियंत्रित नाइट्रोजन प्रवाह दरों के साथ एक दबाव नियंत्रित प्रणाली का उपयोग करता है. लिपिड तैयारी
Protocol
1. Liposome तैयारी
- Teflon लाइन एक टोपी के साथ एक 20 एमएल कांच की शीशी निकालें.
- और क्लोरोफॉर्म के साथ कांच के बने पदार्थ और सीरिंज से पहले साफ करने के लिए प्रदूषण को रोकने के लिए उपयोग.
- गिलास शीशी 250 μL कांच हवा तंग सिरिंज का उपयोग करने के लिए अभिकर्मक ग्रेड क्लोरोफॉर्म की 100 μL स्थानांतरण.
- एक ही गिलास शीशी 100 μL कांच हवा तंग सिरिंज का उपयोग करने के लिए अभिकर्मक ग्रेड मेथनॉल के 30 μL जोड़ें.
- (पोप) phosphatidylethanolamine: एक 2 मिमी 7:1.5:1.5 (POPC) phosphatidylcholine कोलेस्ट्रॉल लिपिड समाधान तैयार करने के लिए, 10 मिलीग्राम / एमएल POPC है, 42 11 मिलीग्राम / एमएल की 10 मिलीग्राम / एमएल पोप और 20 μL की μL 216 μL हस्तांतरण 20 एमएल कांच की शीशी के लिए 3 CHCl में कोलेस्ट्रॉल समाधान.
- कार्बनिक सॉल्वैंट्स आर्गन lipids की एक पतली फिल्म शीशी के तल पर मनाया जाता है जब तक या नाइट्रोजन गैस धीमी प्रवाह का उपयोग कर लुप्त हो जाना.
- कम से कम 30 मिनट के लिए एक निर्वात desiccator में uncapped गिलास शीशी अवशिष्ट विलायक को दूर रखें.
- Transfer बफर के 2 एमएल, पहले 0.2 माइक्रोन फिल्टर के माध्यम से पारित लिपिड हाइड्रेट के लिए गिलास शीशी.
- में 4 मिश्रण डिग्री सेल्सियस रातोंरात सेते हैं और 48 घंटे के भीतर का उपयोग करें.
2. रुक पिघलना: की 30 Liposome आकार के लिए केवल 100 एनएम
- 15 सेकंड के लिए तरल नाइट्रोजन में liposome निलंबन रुक.
- Liposome 42 पर एक हीटिंग ब्लॉक का उपयोग निलंबन पिघलना ° सेल्सियस तापमान ~ 3 मिनट के लिए.
- 5 चक्रों के कुल के लिए 2.1 और 2.2 चरणों को दोहराएँ.
3. बाहर निकालना
Avestin को सही ढंग से Liposofast वामो-50 extruder के इकट्ठा करने के लिए, अपने गाइड बुक में साधन रूपरेखा का उपयोग निर्देश का पालन करें.
- फिल्टर आधार समर्थन में बड़े छेद का समर्थन स्क्रीन परिपत्र छेद () के साथ प्लेस, परिपत्र sintered पकवान (छेद बिना), एक नाली डिस्क (व्यास में 25 मिमी), और एक polycarbonate झिल्ली (व्यास में 25 मिमी) द्वारा पीछा किया.
- छोटे काले रखेंO-अंगूठी झिल्ली के शीर्ष पर यह फिल्टर आधार का समर्थन करने के लिए सुरक्षित है.
- 4 इसी छेद में 4 शिकंजा कस शीर्ष फिल्टर extruder के संलग्न.
- बड़े extruder के बैरल के नीचे फिल्टर extruder इकाई इकट्ठे. सिलेंडर प्रति बैरल के लिए liposome समाधान जोड़ें. बाहर निकालना बैरल के शीर्ष पर आदेश में निम्नलिखित रखें: बड़े O-अंगूठी परिपत्र, संकीर्ण टोपी, बड़े परिपत्र O-अंगूठी, परिपत्र टोपी.
- Extruder प्रति बैरल से ऊपर है और सभी वाल्व को बंद करने के लिए दबाव राहत वाल्व सहित हवा रिसाव को रोकने के लिए गैस नियामक संलग्न. 20 एमएल गिलास शीशी या extruder के फिल्टर यूनिट के तहत 50 एमएल Erlenmeyer कुप्पी रखें. एक सुरक्षा वाल्व नियामक से जुड़ा है और अगर दबाव 600 साई से अधिक जारी करेंगे. नाइट्रोजन गैस पर बारी और extruder के लिए जुड़ा हुआ गैस वाल्व खुला.
- नाइट्रोजन दबाव के लिए 25 400 एनएम liposomes, 100 एनएम liposomes के लिए 125 साई, और 30 एनएम liposomes के लिए 400-500 साई साई के लिए बढ़ाएँ.
- देखो liposome Susp केension के रूप में यह कंटेनर में ejects जबकि नाइट्रोजन द्वारा धक्का दिया जा रहा है. जब तक आप नहीं रह गिलास शीशी में किसी भी extruder फिल्टर के माध्यम से तरल गुजर निरीक्षण नाइट्रोजन बह रखें.
4. गतिशील लाइट छितराया विश्लेषण (DLS)
- एक 20 माइक्रोन liposome समाधान की 50 μL तैयार.
- शक्ति के स्रोत और दीपक स्रोत पर बारी.
- DynaPro सॉफ्टवेयर खोलें.
- एल्गोरिथ्म / एमएस एक्स मॉडल के लिए सॉफ्टवेयर स्थापित करने के लिए 30 एनएम और 100 एनएम और MS800 एल्गोरिथ्म मॉडल> 100 एनएम liposomes का पता लगाने के liposomes का पता लगाने.
- हार्डवेयर के लिए कनेक्ट.
- Pipet क्वार्ट्ज और सेल धारक में क्युवेट डालने में 14 μL liposome नमूना.
- शुरू प्रेस.
- 30 अधिग्रहण - ~ 20 के बाद रोक दबाएँ.
- औसत liposome व्यास हिस्टोग्राम पर दर्ज चोटियों का विश्लेषण.
5. Nanoparticle ट्रैकिंग विश्लेषण (NTA)
- एक 500 μL, 0.1 माइक्रोन liposome तैयारसमाधान.
- पानी और इथेनॉल के साथ नमूना डिब्बे कुल्ला.
- नमूना डिब्बे एक कागज एक प्रकार का वृक्ष मुक्त तौलिया के साथ सूखी.
- लेजर शक्ति के स्रोत और कंप्यूटर पर बारी.
- 0.1 माइक्रोन नमूना डिब्बे liposome समाधान के 300 μL उद्धार.
- तापमान नियंत्रण और nanoparticle ट्रैकिंग विश्लेषण सॉफ्टवेयर खोलें.
- प्रेस बटन कैप्चर करने के लिए लेजर पर बारी.
- क्षैतिज और ऊर्ध्वाधर समायोजन का उपयोग करने के लिए मंच को स्थानांतरित करने के लिए और खुर्दबीन ध्यान केंद्रित समायोजित.
- वांछित तापमान (20 डिग्री सेल्सियस) और रिकॉर्डिंग समय (कम से कम 30 सेकंड) सेट करें.
- रिकॉर्ड बटन प्रेस करने के लिए समय की एक निर्दिष्ट राशि के लिए liposome कणों के कई तस्वीर फ्रेम ले. हिस्टोग्राम के रूप में प्रत्येक कण की गति पटरियों पर व्यास liposome आकार करने के लिए इसी चोटियों का विश्लेषण.
6. प्रतिनिधि परिणाम
एक बाहर निकालना विधि रूपरेखा योजना पी हैचित्र 1 में विरोध है. इष्टतम परिणाम प्राप्त करने के लिए, 30 एनएम diameters के साथ liposomes की तैयारी ~ 500 साई और 100 एनएम के व्यास का एक उच्च दबाव की आवश्यकता है 125 साई के दबाव के लिए एक तेजी से फिल्टर दर को प्राप्त करने की आवश्यकता है. 400 एनएम के diameters के लिए, ~ 25 साई की एक कम दबाव एक धीमी फिल्टर दर, जो vesicles बढ़ाना और बड़ा, सजातीय liposomes फार्म की अनुमति देता है को प्राप्त करने के लिए सिफारिश की है. हम लगातार उप माइक्रोन पुटिका आकार के उत्पादन के लिए इष्टतम दबाव निर्धारित प्रयोगों की एक श्रृंखला का आयोजन किया. हम के रूप में के रूप में अच्छी तरह से बाहर निकालना polycarbonate के ध्यान में लीन होना आकार 30 के, 100, और 400 एनएम के साथ फिल्टर के माध्यम से गुजरता की संख्या दबाव विविध और प्रत्येक इच्छित आकार के लिए उपयुक्त दबाव की खोज की. 30 एनएम है pores, 500 साई नीचे दबाव प्रवाह दर को कम करने, बढ़ाव और इस प्रकार बड़ा पुटिका आकार के कारण होगा. 100 एनएम है pores के लिए, एक सतत प्रवाह 125 साई पर हासिल की थी. 400 एनएम है pores के लिए, कम दबाव (25 साई) vesicles बड़ा पुटिका है में बढ़ाना करने की अनुमति देता हैizes. एक धीमी निस्पंदन ड्रॉप - वार प्रवाह बड़ा उप माइक्रोन 13 vesicles के बनाने के लिए इष्टतम है.
हम DLS के प्रदर्शन के लिए liposome तीन अलग अलग व्यास आकार, 30 यानी, 100 और 400 एनएम के माध्यम से extruded आकार का निर्धारण. DLS की स्थापना की एक विधि है कि बिखरे हुए प्रकाश एकत्र कण व्यास निर्धारित है. 5 फिल्टर ताकना के माध्यम से गुजरता है और 2 के साथ एक 400 एनएम 25 साई में polycarbonate झिल्ली के साथ 125 साई पर एक 100 एनएम polycarbonate झिल्ली, हम एक polycarbonate 500 साई पर 30 एनएम 5 फिल्टर ताकना के माध्यम से गुजरता के साथ झिल्ली के माध्यम से extruded हाइड्रेटेड 2 मिमी liposomes फिल्टर ताकना के माध्यम से गुजरता है. और 30, 100 और 400 एनएम ध्यान में लीन होना आकार के लिए liposomes DLS के द्वारा मापा diameters 66 थे ± 28, 138 ± 18 और 360 ± 25 एनएम (चित्रा 2). 50 एनएम polystyrene मोतियों की एक निलंबन एक अंशांकन मानक के रूप में इस्तेमाल किया गया था के रूप में चित्रा 2 में, जहां यह 47 के एक व्यास ± 16 एनएम दर्ज दिखाया. प्रतिशत polydispersity से पता चलता है कि वहाँ हैं liposome आकार के भीतर कोई ओवरलैप है. यह 30 एनएम से अधिक व्यास निरीक्षण जब DLS में जाना जाता पूर्वाग्रह इस उपकरण 12 कणों की ओर बड़ा कारण विश्लेषण का उपयोग करने के लिए विशिष्ट है. बड़े और छोटे कणों से प्रकाश बिखराव तीव्रता के साथ एक पहचान पद्धति से एकत्र कर रहे हैं और इस तरह 12 निलंबन में liposomes को हल करने के लिए कठिन है. इस वाद्य सीमा के बावजूद, अंशांकन वक्र एक के पास रेखीय सह संबंध का वर्णन करता है.
NTA एक नई तकनीक है कि एक तरल माध्यम है, कण अपवर्तक सूचकांक या घनत्व के स्वतंत्र में प्रसार का सीधा टिप्पणियों से प्रत्येक कण का आकार उपाय है. यह उच्च संकल्प तकनीक DLS के साथ liposomes की माप के पूरक करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. NTA 95 के diameters के ± 48 और 356 ± 51 एनएम, दो 100 एनएम और 400 एनएम polystyrene समाधान दर्ज अंशांकन के लिए इस्तेमाल किया गया. लिपिड 30 एनएम और 100 एनएम के समाधान के लिए एक और COMP है मनाया गया कृषि योग्य व्यास के रूप में 3 चित्र में दिखाया गया, 29 की औसत आकार ± ± 14, 95, 17 और 359 ± 73 एनएम उत्पादन DLS के लिए सापेक्ष है. 1000 एनएम - NTA के एक अधिक सामान्य लक्षण वर्णन तकनीक सूक्ष्म कणों यों के बाद से इसकी संवेदनशीलता यह 50 के कणों को मापने के लिए अनुमति देता है हो सकता है. अंशांकन वक्र दर्ज NTA व्यास बनाम polycarbonate झिल्ली है pores के बीच एक रैखिक संबंध को दर्शाता है.
| Liposome आकार | डिटेक्शन थ्रेसहोल्ड | की उम्मीद न्यूनतम कण आकार (एनएम) |
| 30 एनएम | 11 | 30 |
| 100 एनएम | 11 | 100 |
| 400 एनएम | 21 | 400 |
1 टेबल NanoSight पैरामीटर.
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चित्रा 1 बाहर निकालना विधि का फ्लो चार्ट, का वर्णन कैसे दबाव और नाइट्रोजन प्रवाह अलग liposome व्यास की एकरूपता नियंत्रण. Liposome जलयोजन के बाद, विभिन्न आकारों की unilamellar vesicles अलग अलग दबाव polycarbonate झिल्ली फिल्टर है pores के माध्यम से निकाला जाता.
चित्रा 2 गतिशील लाइट छितराया (DLS) बाहर निकालना के बाद मात्रात्मक liposome आकार का वर्णन डेटा. (क) बार रेखांकन के लिए तीन liposome नमूने के व्यास का वर्णन करने के लिए दिखाए जाते हैं. 50 एनएम polystyrene मनकों (पी एस) के एक अंशांकन मानक एक संदर्भ के रूप में इस्तेमाल किया गया था. औसत liposome व्यास प्रत्येक नमूना के लिए पट्टी के ऊपर संकेत कर रहे हैं. x-अक्ष जिनमें से समाधान के माध्यम से extruded थे ध्यान में लीन होना आकार का वर्णन करता है. y-अक्ष DLS के द्वारा दर्ज की गई व्यास का वर्णन करता है. हालांकि 30 एनएम और 100 एनएम आकार रिकॉर्डएड अपने ध्यान में लीन होना आकार की तुलना में उच्च मूल्यों, जबकि बड़े 400 एनएम आकार थोड़ा कम आकार दर्ज की गई है, अंशांकन वक्र (ख) के निकट एक रेखीय सह संबंध है, जहां x-अक्ष polycarbonate झिल्ली रोमकूप आकार व्यक्त पता चलता है, और y-अक्ष का वर्णन DLS के द्वारा liposome व्यास दर्ज की गई.
चित्रा 3 nanoparticle ट्रैकिंग विश्लेषण (NTA) बाहर निकालना के बाद liposome आकार का वर्णन डेटा. (क) पट्टी रेखांकन liposome नमूना प्रत्येक व्यास का प्रतिनिधित्व करते हैं. x-अक्ष जिनमें से समाधान के माध्यम से extruded थे ध्यान में लीन होना आकार का वर्णन करता है. y-अक्ष NTA के द्वारा दर्ज की गई आकार व्यास का वर्णन करता है. औसत liposome व्यास प्रत्येक नमूना ऊपर चिह्नित कर रहे हैं. (ख) NTA के अंशांकन वक्र दर्ज व्यास बनाम फिल्टर झिल्ली रोमकूप आकार के बीच DLS अंशांकन वक्र की तुलना में एक अधिक रैखिक संबंध को दर्शाता है. x-अक्ष polycarbonate झिल्ली ध्यान में लीन होना आकार का वर्णन. y-अक्ष NTA द्वारा दर्ज liposome व्यास का वर्णन करता है.
चित्रा 4 नकारात्मक दाग संचरण इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (मंदिर) प्रत्येक liposome आकार (500 माइक्रोन) बाहर निकालना द्वारा पीछा दिखा छवियों. कार्बन Formvar जाल ग्रिड नकारात्मक नमूना धुंधला हो गया पहले छुट्टी दे दी, जहां 1% पानी में Uranyl के एसीटेट पूर्व सुखाने और 34,000 × बढ़ाई इमेजिंग के लिए नमूने दाग इस्तेमाल किया गया था. 30 आकार, 100, और 400 एनएम स्पष्ट रूप से एक दूसरे से अलग हैं. बढ़ाई 25,000 × करने के लिए स्थापित किया गया था. पैमाने पर पट्टी 0.5 माइक्रोन का प्रतिनिधित्व करता है.
5 चित्रा एक समय पाठ्यक्रम प्रयोग तीन liposome आकार के साथ आयोजित किया गया. गतिशील प्रकाश बिखरने (DLS) प्रत्येक liposome समाधान के बाद तुरंत बाहर निकालना के लिए मापा गया था. सभी liposome समाधान 4 में संग्रहीत किया गया °सी रात भर. उनके व्यास एक रात ऊष्मायन के बाद DLS के द्वारा दर्ज किए गए. ऊष्मायन 16 घंटे की अवधि के बाद कोई परिवर्तन नहीं करने के लिए थोड़ा मनाया गया.
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Discussion
Avestin Liposofast Extruder LF-50 का उपयोग करना, हम का प्रदर्शन कैसे छोटे आकार, सिंथेटिक liposomes दबाव नियंत्रित प्रणाली के माध्यम से तैयार हैं. यह नोट करना महत्वपूर्ण है कि multilamellar vesicles है liposome जलयोजन है, जो छोटे नैनोकणों के उत्पादन के लिए नेतृत्व कर सकते हैं के बाद अनायास फार्म. इन छोटे multilamellar vesicles, अनिवार्य रूप से बड़ा polycarbonate झिल्ली रोमकूप आकार के माध्यम से प्रवाह के कारण एक बड़ा फिल्टर ताकना द्वारा उत्पादित unilamellar vesicles के समाधान में विविधता है. इसलिए, यह जब बड़े ध्यान में लीन होना आकार उपयोग किया जाता है (यानी 400 एनएम व्यास pores के रूप में ऊपर वर्णित के लिए 25 साई) के क्रम में lipids फ्यूज और बड़ा vesicles में बढ़ाना करने के लिए पर्याप्त समय देने के नाइट्रोजन प्रवाह दबाव को कम करने की सिफारिश की है, की एकरूपता में वृद्धि समाधान. <100 एनएम, उच्च दबाव (यानी 30 और 100 एनएम के लिए 400-500 साई के रूप में ऊपर वर्णित) के diameters के साथ liposomes के लिए एक तेजी से बाहर निकालना लिपिड फँसाने दक्षता बढ़ाने के लिए लागू किया जाता हैआकार और एकरूपता.
कुछ उल्लेखनीय कदम सटीक, प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य liposome तैयारी सुनिश्चित करने के लिए सिफारिश कर रहे हैं. यह सबसे अच्छा है वर्णित विधि का उपयोग कर बाहर निकालना के लिए नमूना के 3.0 एमएल की न्यूनतम मात्रा के साथ vesicles के तैयार हैं. 2 मिमी ऊपर लिपिड सांद्रता के साथ नमूने उच्च व्यास के लिए> 500 साई की नाइट्रोजन दबाव <100 एनएम, जो विचार है कि इस तरह के दबाव वाद्य ऊपरी सीमा से परे है सावधानी के साथ आयोजित किया जाना चाहिए की आवश्यकता होगी. दोहराव पास के extruder के फिल्टर के माध्यम से (5 ~ 7 reiterations है) सिफारिश पुटिका समाधान एकरूपता में सुधार होगा. नमूना तैयार करने के लिए कांच की शीशियों और सीरिंज का उपयोग polypropylene के ट्यूबों कि liposome नमूना दूषित सकता है से किसी भी leaching को रोकने जाएगा. यह भी परिणामी liposomes फ़िल्टर करने के लिए किसी भी संभव अवशिष्ट धूल कणों को हटाने के लिए महत्वपूर्ण है.
ऊपर वर्णित विधि में, हम दो तरीकों कार्यरत है liposome आकार, नाम विशेषताएँइली DLS और NTA. दोनों तकनीकों वास्तविक मनाया liposome व्यास की तुलना में ध्यान में लीन होना आकार के बीच एक के पास रैखिक संबंध दिखाया. बहरहाल, एक ध्यान में रखना चाहिए कि लिपिड vesicles के एक सांख्यिकीय महत्वपूर्ण है, लेकिन क्षुद्र विजातिता दोनों लक्षण वर्णन तरीकों का उपयोग कर मनाया गया. सारांश में, हम अच्छी तरह से नियंत्रित उच्च स्थिरता और दक्षता के साथ नैनो आकार सिंथेटिक liposomes के उत्पादन के लिए एक विधि का वर्णन किया है.
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Disclosures
ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.
Acknowledgments
इस काम के हॉवर्ड ह्यूजेस मेडिकल (HHMI) सहयोगात्मक अभिनव पुरस्कार संस्थान द्वारा समर्थित किया गया. लैम संकेतन और सेलुलर स्वास्थ्य प्रशिक्षण अनुदान के विनियमन राष्ट्रीय संस्थान (GM008759 T32) और NIH रूथ एल Kirschstein पूर्व डॉक्टरल फैलो (CA165349 01) द्वारा समर्थित किया गया था. हम अपने अमूल्य टिप्पणियों के लिए प्रो माइकल Stowell (घन मीटर बोल्डर), प्रो. डगलस रीस और प्रो रोब फिलिप्स (कैलटेक) को धन्यवाद देना चाहूंगा.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Chloroform | Sigma-Aldrich | 02432-25ML | 95% stabilizers |
| High Grade Methanol | Sigma-Aldrich | 179337-4L | |
| Liposofast LF-50 Extruder | Avestin, Inc. | ||
| Phospholipids | Avanti Polar Lipids | ||
| Polycarbonate Pores | Avestin, Inc. | 25 mm diameter | |
| Drain discs PE | Avestin, Inc. | 230600 | 25 mm diameter |
References
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