Konstant trykk-kontrollert Extrusion Metode for utarbeidelse av nanostørrelse Lipid Blemmer

Summary

Denne protokollen beskriver en ekstrudering metode for å forberede lipid vesikler av sub-mikrondimensjoner med en høy grad av homogenitet. Denne metoden bruker en trykk-kontrollert system med kontrollerte nitrogen strømningsrater for liposome forberedelse. Lipid forberedelse

Abstract

Liposomer er kunstig utarbeidet vesikler som består av naturlige og syntetiske fosfolipider som er mye brukt som en cellemembran hermet plattform for å studere protein-protein og protein-lipid interaksjoner ^3, monitor stoffet levering ^4,5, og innkapsling ^fire. Fosfolipider naturligvis lage buede lipid bilayers, skille seg fra en miceller. ⁶ Liposomer er tradisjonelt klassifisert etter størrelse og antall bilayers, dvs. store unilamellar blemmer (LUVs), små unilamellar blemmer (SUVer) og multilamellar blemmer (MLVs) ^7. Spesielt er utarbeidelse av homogene liposomer i ulike størrelser viktig for å studere membran kurvatur som spiller en viktig rolle i celle signalisering, endo-og eksocytose, membran fusion, og protein trafficking ^8. Flere grupper analysere hvordan proteinene brukes til å modulere prosesser som involverer membran kurvatur og dermed forberede liposomer diametre <100 - 400NM for å studere deres oppførsel på cellefunksjoner ^3. Andre fokuserer på liposome-drug innkapsling, studerer liposomer som kjøretøy for å bære og levere et stoff av interesse ^9. Drug innkapsling kan oppnås som rapporteres under liposome formasjon ^9. Vår ekstrudering trinn skal ikke påvirke den innkapslede stoffet for to grunner, bør altså (1) narkotika innkapsling oppnås før dette trinnet og (2) liposomer bør beholde sin naturlige biofysisk stabilitet, sikkert bærer stoffet i vandig kjernen. Disse forskningsmål videre foreslå behovet for en optimalisert metode for å utforme stabile sub-mikron lipid blemmer.

Likevel gjør gjeldende liposome forberedelse teknologier ⁽¹⁰ sonikator, fryse-og-tine ^10, sedimentasjon) ikke tillate utarbeidelse av liposomer med svært buet overflate (dvs. diameter <100 nm) med høy konsistens og effektivitet ^10,5, noe som begrenser biofysiske studier av en emerging felt av membran kurvatur sensing. Heri presenterer vi en robust forberedelse metode for en rekke av biologisk relevante liposomer.

Manuell ekstrudering bruke gasstett sprøyter og polykarbonat membraner ^10,5 er en vanlig praksis, men heterogeniteten blir ofte observert ved bruk porestørrelser <100 nm på grunn på grunn av variasjon av manuelle trykket. Vi benyttet et konstant press kontrollert ekstrudering apparat for å forberede syntetiske liposomer som diametre varierer mellom 30 og 400 nm. Dynamisk lysspredning (DLS) ^10, elektronmikroskopi ¹¹ og nanopartikkel sporing analyse (NTA) ¹² ble brukt til å kvantifisere liposome størrelsene som beskrevet i protokollen vår, med kommersielle polystyren (PS) perler som brukes som en kalibrering standard. En nær lineær korrelasjon ble observert mellom de næringsdrivende porestørrelser og eksperimentelt bestemte liposomer, indikerer high fidelity av vår trykk-kontrollert liposome forberedelse møttHod. Videre har vi vist at dette lipid vesicle tilberedningsmetode gjelder generelt, uavhengig av ulike liposome størrelser. Til slutt har vi også vist i en tid kurs studie at disse preparerte liposomer var stabile i opptil 16 timer. En representant nanostørrelse liposome forberedelse protokollen er vist nedenfor.

Protocol

1. Liposome Forberedelse

1. Hente en 20 ml hetteglass med en Teflon-lined cap.
2. Rengjør alle glass og sprøyter med kloroform før bruk for å hindre forurensning.
3. Overføring 100 mL av reagens karakter kloroform til hetteglass med en 250 mL lufttett glass sprøyte.
4. Tilsett 30 mL av reagens karakter metanol til samme hetteglass med et 100 mL lufttett glass sprøyte.
5. For å forberede en 2 mm 7:1.5:1.5 phosphatidylcholine (POPC): phosphatidylethanolamine (Pope): kolesterol lipid løsning, overføre 216 mL av 10 mg / ml POPC, 42 mL av 10 mg / ml paven og 20 mL av 11 mg / ml kolesterol løsninger i CHCl ₃ til 20 ml hetteglass.
6. Fordampe organiske løsemidler med slow-flow argon eller nitrogen gass til en tynn film av lipider er observert på bunnen av flasken.
7. Plasser uncapped hetteglass i et vakuum eksikkator i minst 30 minutter for å fjerne rester av løsemidler.
8. Transfer 2 mL buffer, tidligere passert gjennom et 0,2 micron filter, til hetteglass til hydrat lipider.
9. Inkuber blandingen ved 4 ° C over natten og bruk innen 48 timer.

2. Freeze-og-tine: For liposome Størrelser på 30 - 100 nm Only

1. Frys liposome suspensjon i flytende nitrogen i 15 sekunder.
2. Tin liposome suspensjon bruke en oppvarming blokk ved 42 ° C temperatur for ~ 3 minutter.
3. Gjenta trinn 2.1 og 2.2 for totalt 5 sykluser.

3. Extrusion

Følg Avestin instruksjonene for å riktig montere Liposofast LF-50 ekstruder, bruke instrumentet disposisjon i sin guidebok.

1. Plasser den store hullet støtte skjerm (med sirkulære hull) i støtten filteret basen, etterfulgt av sirkulær sintret fatet (uten hull), en drain plate (25 mm i diameter), og en polykarbonat membran (25 mm i diameter).
2. Plasser den lille, svarteO-ring på toppen av membranen for å feste den til støtte filter base.
3. Fest den øverste filteret ekstruder ved å stramme 4 skruer i de 4 tilsvarende hullene.
4. Monter filteret ekstruder enheten til under den store ekstruder fat. Legg til liposome løsningen til sylinderen fat. Plasser følgende på toppen av ekstrudering fat i rekkefølge: stor sirkulær O-ring, smal lue, store sirkulære O-ring, sirkulær cap.
5. Fest gass regulator til ekstruder fat toppen og lukke alle ventiler for å hindre luftlekkasje, inkludert trykkavlastningsventilen. Plasser en 20 ml hetteglass eller 50 ml erlenmeyerkolbe under extruder filterenheten. En sikkerhetsventil er koblet til regulator og vil slippe hvis trykket overstiger 600 psi. Slå på nitrogen gass og åpne gassventilen koblet til ekstruder.
6. Øk nitrogen press til 25 psi for 400 nm liposomer, 125 PSI på 100 nm liposomer og 400-500 PSI på 30 nm liposomer.
7. Se liposome Suspension som den støter inn i beholderen mens skyves av nitrogen. Hold nitrogen strømmer til du ikke lenger observerer noen væske passerer gjennom ekstruder filteret inn i hetteglass.

4. Dynamisk lysspredning (DLS) Analyse

1. Forbered 50 mL av en 20 mM liposome løsning.
2. Slå på strømkilden og lampen kilden.
3. Åpne DynaPro programvaren.
4. Sett programvare til MS / X algoritme modell for å oppdage liposomer av 30 nm og 100 nm og MS800 algoritme modell for å oppdage> 100 nm liposomer.
5. Koble til maskinvaren.
6. Pipetter 14 mL av liposome prøve i kvarts kyvetten og sett inn i cellen holderen.
7. Trykk på start.
8. Trykk stoppe etter ~ 20 - 30 oppkjøp.
9. Analyser gjennomsnittlig liposome diameter topper opp på histogrammet.

5. Nanopartikkel Tracking Analysis (NTA)

1. Forbered en 500 mL, 0,1 mM liposomeløsning.
2. Skyll prøven kupé med vann og etanol.
3. Tørk prøven kupé med en lofri klut.
4. Slå på laser strømkilden og datamaskinen.
5. Lever 300 mL av 0,1 mM liposome løsning prøven kupé.
6. Åpne Temperaturkontroll og nanopartikler Tracking Analysis programvare.
7. Trykk Capture-knappen for å slå på laseren.
8. Bruk de horisontale og vertikale justeringer for å flytte scenen og justere mikroskop fokus.
9. Still inn ønsket temperatur (20 ° C) og opptakstid (minst 30 sekunder).
10. Trykk på opptaksknappen for å ta flere bilderammer av liposome partikler for en spesifisert tidsperiode. Analyser toppene tilsvarer diameter liposome størrelser på histogrammet som det sporer bevegelsene til hver partikkel.

6. Representative Resultater

En ordning som beskriver ekstrudering metoden er pmislikte i Figur 1. For å oppnå optimale resultater, utarbeidelse av liposomer med diameter på 30 nm krever et høyt trykk på ~ 500 psi og diametre på 100 nm krever et trykk på 125 psi for å oppnå en rask filter rate. For diametre på 400 nm, er et lavtrykk på ~ 25 psi anbefales for å oppnå en langsommere filter rente, noe som gjør at vesikler å forlenge og danne større, homogene liposomer. Vi gjennomførte en rekke eksperimenter for å finne det optimale presset for å produsere konsistente sub-mikron vesicle størrelser. Vi varierte trykket samt antall profiler går gjennom polykarbonat filtre med porestørrelser på 30, 100 og 400 nm og oppdaget passende press for hver ønsket størrelse. For 30 nm porer, vil trykket under 500 psi redusere vannmengden, forårsaker tøyelighet og dermed større vesicle størrelser. For 100 nm porer, ble en jevn flyt oppnås på 125 psi. For 400 nm porer, lar lavt trykk (25 psi) vesikler å forlenge inn i større vesicle srer. En langsom drop-messig filtrering flyt er optimalt å lage større sub-mikron blemmer ^13.

Vi utførte DLS å bestemme liposome størrelsene ekstruderte gjennom tre forskjellige diameter størrelser, 30 dvs. 100 og 400 nm. DLS er en etablert metode som samler spredt lys for å bestemme partikkelstørrelse. Vi ekstruderte hydrert liposomer av 2 mm gjennom en polykarbonat 30 nm membranen ved 500 psi med 5 passerer gjennom filteret pore, en 100 nm polykarbonat membranen ved 125 psi med 5 passerer gjennom filteret pore og en 400 nm polykarbonat membran på 25 psi med 2 passerer gjennom filteret pore. De diameter på liposomer og målt av DLS for 30, 100 og 400 nm porestørrelser var 66 ± 28, 138 ± 18 og 360 ± 25 nm (figur 2). En suspensjon av 50 nm isopor perler ble brukt som en kalibrering standard som vist i figur 2, hvor det registreres en diameter på 47 ± 16 nm. Det prosent polydispersity viser at det er ingen overlapping innenfor liposome størrelser. Det er typisk å observere diametre høyere enn 30 nm ved bruk DLS analyse på grunn av den kjente skjevhet dette instrumentet har mot større partikler ^12. Lysspredning intensiteter fra store og små partikler samles samtidig fra en påvisningsmetoden og dermed vanskeligere å løse liposomer i suspensjon ^12. Til tross for dette instrumental begrensning, beskriver kalibreringskurven en nær lineær korrelasjon.

NTA er en ny teknologi som måler størrelsen på hver partikkel fra direkte observasjoner av diffusjon i et flytende medium, uavhengig av partikkel brytningsindeks eller tetthet. Dette høyoppløselig teknikk kan brukes til å supplere måling av liposomer med DLS. Den NTA registrert diameter på 95 ± 48 og 356 ± 51 nm, to 100 nm og 400 nm polystyren løsninger ble brukt til kalibrering. Lipid løsninger av 30 nm og 100 nm ble observert å ha en mer komp dyrkbar diameter i forhold til DLS som vist i Figur 3, produsere gjennomsnittlig størrelse på 29 ± 14, 95 ± 17 og 359 ± 73 nm. Det NTA kan være en mer generell karakterisering teknikk for å kvantifisere mikroskopiske partikler siden sin følsomhet gjør at den kan måle partikler på 50 - 1000 nm. Kalibreringskurven viser en lineær sammenheng mellom polykarbonat membran porene versus den registrerte NTA diameter.

Liposome Størrelser	Deteksjonsgrensen	Forventet Minimum Partikkelstørrelse (nm)
30 nm	11	30
100 nm	11	100
400 nm	21	400

Tabell 1. NanoSight Parametere.

ad/4151/4151fig1.jpg "/>
Figur 1. Flow diagram av ekstrudering metode, som beskriver hvordan trykk og nitrogen flyt kontrollerer homogenitet av ulike liposome diametre. Etter liposome hydrering, unilamellar blemmer av forskjellige størrelser er ekstrudert gjennom ulike polykarbonat membranfilter porene ved forskjellige trykk.

Figur 2. Dynamisk lysspredning (DLS) data som beskriver de kvantitative liposome størrelsene etter ekstrudering. (A) søylediagrammer er vist å beskrive diameter på de tre liposome prøvene. En kalibrering standard på 50 nm polystyren (PS) perler ble brukt som en referanse. De gjennomsnittlige liposome diametre indikeres over baren for hver prøve. X-aksen beskriver porestørrelser hvorav løsninger ble ekstrudert gjennom. Y-aksen beskriver diameter registrert av DLS. Selv om de 30 nm og 100 nm størrelser rekorded verdier høyere enn sine porestørrelser mens den større 400 nm størrelse registrert en noe lavere størrelse, viser kalibreringskurven (b) en nær lineær korrelasjon, hvor x-aksen uttrykker polykarbonat membran porestørrelser, og y-aksen beskriver innspilt liposome diameter med DLS.

Figur 3. Nanopartikler Tracking Analysis (NTA) data som beskriver de liposome størrelsene etter ekstrudering. (A) De søylediagrammer representerer diameter på hver liposome prøve. X-aksen beskriver porestørrelser hvorav løsninger ble ekstrudert gjennom. Y-aksen beskriver størrelsen diameter registrert av NTA. De gjennomsnittlige liposome diametre er merket over hver prøve. (B) NTA kalibreringskurve viser en mer lineær sammenheng enn DLS kalibreringskurven mellom filteret membran porestørrelser versus registrert diameter. X-aksen beskriver polykarbonat membran porestørrelser. Y-aksen beskriver den innspilte liposome diameter av NTA.

Figur 4. Negative flekken transmisjonselektronmikroskopi (TEM) bilder som viser hver liposome størrelse (500 mm) etterfulgt av ekstrudering. Carbon Formvar mesh nett ble negativt ut før prøven flekker, der 1% Uranyl acetat i vann ble brukt for å farge prøvene før tørking og bildebehandling på 34 000 × forstørrelse. Størrelser 30, 100 og 400 nm er klart atskilt fra hverandre. Forstørrelsen ble satt til 25 000 ×. Skalaen linjen representerer 0,5 mikrometer.

Figur 5. En time-kurs Forsøket ble gjennomført med tre liposome størrelser. Dynamisk lysspredning (DLS) ble målt for hver liposome løsning umiddelbart etter ekstrudering. Alle liposome løsninger ble oppbevart i 4 °C over natten. Deres diameter ble registrert av DLS etter en natts inkubasjon. Lite eller ingen endring ble observert etter en 16-timers inkubasjonstid.

Discussion

Bruke Avestin Liposofast LF-50 Extruder, viste vi hvor liten størrelse, er syntetiske liposomer forberedt gjennom en trykk-kontrollert system. Det er viktig å merke seg at multilamellar vesikler danner spontant etter liposome hydrering, som kan føre til produksjon av mindre nanopartikler. Disse små multilamellar vesikler nødvendigvis vil strømme gjennom det større polykarbonat membranen porestørrelse, forårsaker heterogenitet i løsninger av unilamellar vesikler produsert av et stort filter pore. Derfor anbefales det å redusere nitrogen vanntrykk når store porestørrelser brukes (dvs. 25 psi for 400 nm diameter porene som beskrevet ovenfor) for å gi lipider tilstrekkelig tid til å smelte og forlenge til større blemmer, øke homogeniteten løsningen. For liposomer med diameter <100 nm, høyt trykk (dvs. 400-500 psi for 30 og 100 nm som beskrevet ovenfor) er søkt om en rask ekstrudering å øke lipid fangst effektivitetog størrelse homogenitet.

Noen bemerkelsesverdige skritt anbefales for å sikre nøyaktig, reproduserbar liposome forberedelse. Det er best å forberede vesikler med minst volum på 3,0 mL prøve for ekstrudering bruke den beskrevne metoden. Prøver med lipid konsentrasjoner over 2 mm vil kreve høyere nitrogen trykk> 500 psi for diametre <100 nm, som bør utføres med forsiktighet med tanke på at slikt press er hinsides instrumental øvre grense. En anbefaling av gjentagende pasninger (5 ~ 7 gjentagelser) gjennom ekstruder filter vil bedre vesicle løsningen homogenitet. Bruke hetteglass og sprøyter for prøveopparbeidelse vil forhindre utvasking av polypropylen rør som kan forurense liposome prøven. Det er også avgjørende for å filtrere den resulterende liposomer for å fjerne eventuelle rester støvpartikler.

I metoden beskrevet ovenfor, har vi ansatt to metoder for å karakterisere liposome størrelser, Namely DLS og NTA. Begge teknikkene viste en nær lineær sammenheng mellom de porestørrelser versus den faktiske observerte liposome diameter. Likevel bør man huske på at en statistisk signifikant, men uvesentlig heterogenitet av lipid vesikler ble observert med både karakterisering metoder. I sammendraget har vi beskrevet en godt kontrollert metode for å produsere nanostørrelse syntetiske liposomer med høy konsistens og effektivitet.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Chloroform	Sigma-Aldrich	02432-25ML	95% stabilizers
High Grade Methanol	Sigma-Aldrich	179337-4L
Liposofast LF-50 Extruder	Avestin, Inc.
Phospholipids	Avanti Polar Lipids
Polycarbonate Pores	Avestin, Inc.		25 mm diameter
Drain discs PE	Avestin, Inc.	230600	25 mm diameter