Constant Pressure-gecontroleerde Extrusie werkwijze voor de bereiding van Nano-sized lipide bolletjes

Summary

Dit protocol beschrijft een werkwijze voor het bereiden extrusie lipide vesicles van sub-micron afmetingen met een hoge mate van homogeniteit. Deze methode maakt gebruik van een druk-gecontroleerd systeem met gecontroleerde stikstofstroom tarieven voor liposoom voorbereiding. De lipide voorbereiding

Abstract

Liposomen zijn kunstmatig bereid vesicles bestaande uit natuurlijke en synthetische fosfolipiden die algemeen gebruikt worden als membraan nabootsen platform eiwit-en eiwit-interacties lipide ³ beeldscherm drug delivery ^4,5 en inkapseling ⁴ bestuderen. Fosfolipiden van nature te creëren gebogen lipidendubbellagen onderscheiden zich van een micel. ⁶ Liposomen worden traditioneel ingedeeld naar grootte en het aantal dubbellagen, dat wil zeggen grote unilamellaire blaasjes (LUVS), kleine unilamellaire blaasjes (SUV's) en multilamellaire blaasjes (MLV's) ^7. Met name de bereiding van homogene liposomen van verschillende grootte is van belang voor het bestuderen membraan kromming die een belangrijke rol speelt bij celsignalering, endo-en exocytose, membraanfusie en eiwit handel ^8. Verscheidene groepen gaan hoe eiwitten gebruikt voor het moduleren processen membraan kromming omvat en dus bereiden liposomen diameters <100-400nm tot hun gedrag op de mobiele functies ³ te bestuderen. Anderen richten zich op liposoom-drug inkapseling, het bestuderen van liposomen als dragers voor het uitvoeren en leveren een geneesmiddel van belang ^9. Drug inkapseling kan worden bereikt, zoals gerapporteerd tijdens de vorming van liposomen ^9. De extrusie niet de ingekapseld geneesmiddel beïnvloeden om twee redenen, dat wil zeggen dat (1) geneesmiddel inkapseling voorafgaand verwezenlijkt deze stap (2) liposomen moeten hun natuurlijke biofysische stabiliteit behouden, stevig die het geneesmiddel in de waterige kern. Deze onderzoeksdoelstellingen verder wijzen op de noodzaak voor een optimale manier van stabiele sub-micron lipide vesicles ontwerpen.

Toch maar met de huidige liposoombereiding technologieën (sonicatie ^10, vries-en ^dooi-10, sedimentatie) niet toe dat de voorbereiding van liposomen met een sterk gebogen oppervlak (dat wil zeggen een diameter van <100 nm) met een hoge consistentie en efficiëntie ^10,5, die de biofysische grenzen studies van een emerging gebied van membraan kromming sensing. Hierin stellen we een robuuste bereidingswijze voor een verscheidenheid van biologisch relevante liposomen.

Handmatig met behulp van extrusie gasdichte spuiten en polycarbonaat membranen ^10,5 is een veel voorkomende praktijk, maar heterogeniteit wordt vaak waargenomen bij het ​​gebruik van poriegrootte <100 nm als gevolg van de variabiliteit van de toegepaste manuele druk. We gebruikten een constante druk gecontroleerde extrusieinrichting synthetische liposomen die diameters variëren tussen 30 en 400 nm te bereiden. Dynamische lichtverstrooiing (DLS) ^10, elektronenmicroscopie ¹¹ en nanodeeltjes tracking analyse (NTA) ¹² werden gebruikt om de afmetingen liposoom kwantificeren beschreven in onze protocol met commerciële polystyreen (PS) korrels als kalibratiestandaard. Een bijna-lineaire correlatie werd gevonden tussen de werknemers poriegrootte en de experimenteel bepaalde liposomen, met vermelding van high fidelity van onze druk-gecontroleerde liposoombereiding voldaanHod. Voorts hebben we aangetoond dat deze lipidesamenstelling bereidingswijze is algemeen toepasbaar, onafhankelijk van verschillende afmetingen liposoom. Tot slot hebben we ook aangetoond in een tijdsverloop studie dat deze voorbereid liposomen stabiel waren voor maximaal 16 uur. Een representatieve nanoformaat liposoompreparaat protocol wordt hierna aangetoond.

Protocol

1. Liposoompreparaat

1. Haal een 20 ml glazen flacon met een Teflon beklede kap.
2. Maak voor al het glaswerk en spuiten met chloroform te gebruiken om besmetting te voorkomen.
3. Breng 100 pl van pa chloroform om het glazen flesje met een 250 ul luchtdichte glazen injectiespuit.
4. Voeg 30 ul van pa methanol om dezelfde glazen flesje met een 100 ul luchtdichte glazen injectiespuit.
5. Fosfatidylethanolamine (Paus):: Om een ​​2 mm 7:1.5:1.5 fosfatidylcholine (POPC) voor te bereiden cholesterol lipide oplossing in 216 pi van 10 mg / ml POPC, 42 pl van 10 mg / ml PAUS en 20 ul van 11 mg / ml cholesterol oplossingen _in CHCI3 de 20 ml glazen flesje.
6. Damp organische oplosmiddelen met langzame doorstroming argon of stikstofgas tot een dunne film van lipiden waargenomen op de bodem van de flacon.
7. Plaats de afgetopte glazen flesje in een vacuümexsiccator ten minste 30 minuten achtergebleven oplosmiddel te verwijderen.
8. Transfer 2 ml buffer, eerder geleid door een 0,2 micron filter met het glazen flesje te hydrateren lipiden.
9. Incubeer het mengsel bij 4 ° C geroerd en gebruiken binnen 48 uur.

2. Freeze-en-dooi: Voor Liposome Maten van 30 - 100 nm Alleen

1. Freeze liposoom suspensie in vloeibare stikstof gedurende 15 seconden.
2. Ontdooien liposoom suspensie met een opwarmsnelheid blok 42 ° C temperatuur tot 3 minuten.
3. Herhaal stap 2.1 en 2.2 in totaal 5 cycli.

3. Extrusie

Volg de instructies om Avestin juiste montage van de Liposofast LF-50 extruder, met behulp van het instrument geeft in hun gids.

1. Plaats de grote opening steun scherm (met ronde gaten) in de steun filter base, gevolgd door de cirkelvormige gesinterde schaal (zonder gaten), een afvoer schijf (25 mm diameter), en een polycarbonaat (25 mm diameter).
2. Plaats de kleine, zwarteO-ring op het membraan om deze vast aan de steun filterhouder.
3. Bevestig de bovenste filter extruder door het aandraaien van vier schroeven in de vier corresponderende gaten.
4. Monteer het filter extruder toestel aan op de onder de grote extruder vat. Voeg de liposoom oplossing de cilindermantel. Plaats de volgende op de top van de extrusie vat in volgorde: grote ronde O-ring, smalle kap, grote ronde O-ring, ronde dop.
5. Sluit de gasregelaar de extrudercilinder top en sluit alle kleppen om luchtlekkage, waaronder de overdrukklep voorkomen. Plaats een 20 ml glazen flacon of 50 ml erlenmeyer onder de extruder filter. Een veiligheidsklep is verbonden met de regelaar en laat als de druk groter is dan 600 psi. Zet de stikstofgas en opent de gasklep aangesloten op de extruder.
6. Verhoog de stikstof druk om 25 psi voor 400 nm liposomen, 125 psi voor 100 nm liposomen, en 400-500 psi gedurende 30 nm liposomen.
7. Bekijk de liposoom suspension als werpt in de houder tijdens geduwd door stikstof. Houd de doorstromende stikstof totdat je niet meer in acht te nemen vloeistof die door de extruder filter in de glazen flacon.

4. Dynamische Lichtverstrooiing (DLS) Analysis

1. Bereid 50 ul van een 20 pM oplossing liposoom.
2. Zet de stroombron en de lamp bron.
3. Open de Dynapro software.
4. Stel de software om de MS / X-algoritme model om liposomen van 30 nm en 100 nm en MS800 algoritme model om> 100 nm liposomen te sporen op te sporen.
5. Verbinding maken met de hardware.
6. Pipetteer 14 ul van liposoom monster in de kwarts cuvet en steek deze in de cel houder.
7. Druk op start.
8. Druk op Stop na ~ 20 tot 30 acquisities.
9. Analyseer de gemiddelde liposoom diameter pieken opgenomen op het histogram.

5. Nanodeeltje Tracking Analyse (NTA)

1. Bereid een 500 pL, 0,1 uM liposoomoplossing.
2. Spoel het monster compartiment met water en ethanol.
3. Droog het monster compartiment met een niet-pluizende papieren handdoek.
4. Zet de laser voedingsbron en de computer.
5. Lever 300 pi van 0,1 uM liposoom oplossing van het monster compartiment.
6. Open de temperatuurregeling en de Nanodeeltje Tracking Analyse software.
7. Druk op Capture-toets om de laser.
8. Gebruik de horizontale en verticale aanpassingen van de fase over te gaan en de microscoop scherp te stellen.
9. Stel de gewenste temperatuur (20 ° C) en opnametijd (ten minste 30 seconden).
10. Druk op de knop Opnemen om meerdere lijsten van het liposoom deeltjes voor een bepaalde hoeveelheid tijd in beslag nemen. Analyseren pieken overeenkomt met de diameter liposoom maten op de histogram zoals de beweging van elk deeltje volgt.

6. Representatieve resultaten

Een schema waarin de extrusie methode is paanstoot in figuur 1. Om optimale resultaten te verkrijgen, bereiding van liposomen met een diameter van 30 nm is een hoge druk van ~ 500 psi en een diameter van 100 nm heeft een druk van 125 psi tot een snelle filter snelheid bereiken. Voor diameters van 400 nm, wordt een lage druk van ~ 25 psi aanbevolen een lagere filter snelheid, waarmee de vesicles verlengen en tot grotere homogene liposomen bereiken. Wij hebben een reeks experimenten om de optimale druk voor het produceren van consistente sub-micron blaasje maten te bepalen. We gevarieerd de druk en het aantal extrusie passeert polycarbonaat filters met poriën van 30, 100 en 400 nm en ontdekte geschikte druk voor elke gewenste grootte. Voor 30 nm poriën zal de druk lager is dan 500 psi verminder de luchtstroming, waardoor rek en dus groter blaasje maten. Voor 100 nm poriën, is er een constante stroom bereikt bij 125 psi. Voor 400 nm poriën, lage druk (25 psi) kan de blaasjes te rekken in grotere blaasje sizes. Een druppelsgewijs filtratie doorstroming optimaal is om grotere sub-micron blaasjes ¹³ te creëren.

We voerden DLS aan het liposoom maten geëxtrudeerd door drie verschillende diameters, namelijk 30, 100 en 400 nm te bepalen. DLS is een gevestigde methode die verstrooid licht verzamelt het bepalen van de deeltjesdiameter. We geëxtrudeerde gehydrateerd liposomen 2 mM door een polycarbonaat 30 nm membraan 500 psi met 5 doorgangen door de filter poriën, een 100 nm polycarbonaat bij 125 psi met 5 doorgangen door de filter poriën en een 400 nm polycarbonaat bij 25 psi met 2 door het filter porie. De diameters van de liposomen en gemeten DLS 30, 100 en 400 nm poriegrootte was 66 ± 28 138 ± 18 en ± 25 360 nm (figuur 2). Een suspensie van 50 nm polystyreenparels werd gebruikt als kalibratiestandaard zoals getoond in figuur 2, waarin het opgenomen een diameter van 47 ± 16 nm. Het percentage polydispersity toont aan dat er geen overlap in liposoom maten. Het is typisch voor een diameter groter dan 30 nm bij het ​​gebruik van DLS-analyse te wijten aan de bekende vooroordelen dit instrument heeft de richting van grotere deeltjes ^12. Lichtverstrooiing intensiteiten van grote en kleine deeltjes worden gelijktijdig verzameld van een detectiemethode en dus moeilijker te liposomen in suspensie ¹² op te lossen. Ondanks deze instrumentale beperking, de kalibratiecurve beschrijft een bijna lineaire correlatie.

NTA is een nieuwe technologie die de grootte van de deeltjes uit directe waarneming van diffusie in een vloeibaar medium, onafhankelijk van deeltjes brekingsindex of dichtheid gemeten. Deze hoge resolutie techniek kan worden gebruikt voor het meten van liposomen met DLS vullen. De NTA opgenomen diameters van 95 ± 48 en ± 51 356 nm, twee 100 nm en 400 nm polystyreen oplossingen werden gebruikt voor kalibratie. Lipid oplossingen van 30 nm en 100 nm werden waargenomen een Comp bouwland diameter ten opzichte van de DLS zoals getoond in figuur 3, waardoor de gemiddelde grootte van 29 ± 14 95 ± 17 en ± 73 359 nm. 1000 nm - NTA kan een algemene karakteristiek techniek microscopische deeltjes kwantificeren omdat de gevoeligheid kan het meten deeltjes van 50. De kalibratiecurve toont een lineaire correlatie tussen de polycarbonaat poriën versus opgenomen NTA diameter.

Liposome Maten	Detectiegrens	Verwachte minimale deeltjesgrootte (nm)
30 nm	11	30
100 nm	11	100
400 nm	21	400

Tabel 1. NanoSight Parameters.

ad/4151/4151fig1.jpg "/>
Figuur 1. Stroomschema van de extrusie methode beschreven hoe de druk en stikstofstroom regelt de homogeniteit van verschillende diameters liposoom. Na liposoom hydratatie unilamellaire vesicles van verschillende grootte zijn geëxtrudeerd door verschillende polycarbonaat filterporiën bij verschillende drukken.

Figuur 2. Dynamische lichtverstrooiing (DLS) gegevens die de kwantitatieve liposoom afmetingen na extrusie. (A) een staafgrafiek is aangetoond dat de diameters van de drie monsters liposoom beschrijven. Kalibratiestandaard 50 nm polystyreen (PS) korrels werd gebruikt als referentie. De gemiddelde diameter liposoom zijn aangegeven boven de balk voor elk monster. De x-as wordt de poriën waarvan de oplossingen werden geëxtrudeerd door. De y-as geeft de diameter opgenomen door DLS. Hoewel de 30 nm en 100 nm maten opnemened waarden hoger dan de poriegrootte terwijl de grotere 400 nm grootte opgenomen iets kleinere grootte, de ijkgrafiek (b) toont een bijna lineaire relatie, waarbij de x-as geeft het polycarbonaat poriegrootte en de y-as wordt de opgenomen liposoom met een diameter van DLS.

Figuur 3. Nanodeeltje Tracking Analyse (NTA) gegevens die de liposoom maten na extrusie. (A) De grafieken geven de diameter van elke liposoom monster. De x-as wordt de poriën waarvan de oplossingen werden geëxtrudeerd door. De y-as wordt de grootte diameter opgenomen door de NTA. De gemiddelde liposoom diameters zijn voorzien boven elk monster. (B) de NTA ijkgrafiek toont een lineaire correlatie dan DLS ijkcurve van de filtermembraanmodules poriegrootte versus de opgenomen diameter. De x-as wordt de polycarbonaat poriegrootten. De y-as wordt de opgenomen liposoom diameter NTA.

Figuur 4. Negatieve kleuring transmissie elektronen microscopie (TEM) beelden die elk liposomengrootte (500 uM), gevolgd door extrusie. Carbon Formvar mesh rasters zijn negatief voor ontladen monster kleuring, waarbij 1% uranylacetaat in water werd gebruikt om de monsters vlek voor het drogen en beeldvorming in 34.000 x vergroting. Maten 30, 100, en 400 nm duidelijk los van elkaar. De vergroting was ingesteld op 25.000 ×. De schaal balk vertegenwoordigt 0,5 micrometer.

Figuur 5. Een tijdsverloop experiment werd uitgevoerd met drie liposoom maten. Dynamische lichtverstrooiing (DLS) werd gemeten voor elke liposoom oplossing onmiddellijk na extrusie. Alle liposoom oplossingen werden opgeslagen in 4 °C geroerd. De diameters zijn door de DLS na een nacht incubatie. Weinig tot geen verandering werd waargenomen na een 16 uur durende incubatieperiode.

Discussion

Met behulp van de Avestin Liposofast LF-50 Extruder, hebben we laten zien hoe de kleine, synthetische liposomen zijn bereid door middel van een druk-gestuurd systeem. Het is belangrijk op te merken dat multilamellaire blaasjes spontaan te vormen naar aanleiding liposoom hydratatie, wat kan leiden tot productie van kleinere nanodeeltjes. Deze kleine multilamellaire blaasjes zal onvermijdelijk stromen door de grotere polycarbonaat membraan poriën, waardoor de heterogeniteit in oplossingen van unilamellaire blaasjes die door een grote filter porie. Daarom wordt aanbevolen om de druk te verminderen stikstofstroom bij grote poriën worden gebruikt (bijvoorbeeld 25 psi bij 400 nm diameter poriën zoals hierboven beschreven) om geven lipiden voldoende tijd te smelten en in grotere langwerpige vesicles, waardoor de homogeniteit van de oplossing. Voor liposomen met een diameter van <100 nm, hoge druk (bijvoorbeeld 400-500 psi 30 en 100 nm zoals hierboven beschreven) wordt toegepast voor een snelle extrusie tot lipide trapping efficiëntieen grootte homogeniteit.

Een paar opmerkelijke stappen worden aangeraden om een ​​nauwkeurige en reproduceerbare liposoom voorbereidingstijd te garanderen. Het beste is om blaasjes te bereiden met het minimale volume van 3,0 ml van het monster voor extrusie met behulp van de beschreven methode. Monsters met lipide concentraties van meer dan 2 mm zal een hogere stikstof druk van> 500 psi, bij een diameter <100 nm, die moet worden uitgevoerd met de nodige voorzichtigheid gezien het feit dat een dergelijke druk is dan de instrumentale bovengrens. Een aanbeveling van repetitieve passen (5 ~ 7 herhalingen) door de extruder filter verbetert de blaasjes oplossing homogeniteit. Met behulp van glazen flesjes en spuiten voor monstervoorbereiding wordt voorkomen dat uitloging van polypropyleen buizen die het liposoom monster kan verontreinigen. Het is ook van cruciaal belang voor de daaruit voortvloeiende liposomen filteren om eventuele resterende stofdeeltjes te verwijderen.

In de hierboven beschreven werkwijze, hebben wij twee methoden toegepast liposoom afmetingen, nam karakteriserenely DLS en NTA. Beide technieken heeft een bijna lineaire relatie tussen de poriën van de feitelijke waargenomen liposoom diameter. Toch moet men rekening mee houden dat een statistisch significant, maar ijl heterogeniteit van lipide vesicles werd waargenomen met beide analysemethoden. Samenvattend zijn beschreven wij een goed gecontroleerde werkwijze voor het produceren nano-synthetische liposomen met hoge consistentie en efficiëntie.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Chloroform	Sigma-Aldrich	02432-25ML	95% stabilizers
High Grade Methanol	Sigma-Aldrich	179337-4L
Liposofast LF-50 Extruder	Avestin, Inc.
Phospholipids	Avanti Polar Lipids
Polycarbonate Pores	Avestin, Inc.		25 mm diameter
Drain discs PE	Avestin, Inc.	230600	25 mm diameter