Dieses Protokoll beschreibt ein Extrusionsverfahren zur Herstellung Lipidvesikel von Submikrometer-Abmessungen mit einem hohen Grad an Homogenität. Dieses Verfahren verwendet eine Druck-Steuerung mit gesteuerten Stickstoff Flussraten für Liposomenpräparation. Die Lipid-Vorbereitung<sup> 1,2</sup>, Wird Liposomen Extrusion, Größe und Charakterisierung Beispiele vorgestellt werden.
Liposomen sind künstlich hergestellte Vesikel aus natürlichen und synthetischen Phospholipiden, die weithin als eine Zellmembran imitiert Plattform, um Protein-Protein und Protein-Lipid-Wechselwirkungen 3, Drug-Delivery-Monitor 4,5 und 4 studierst Einkapselung verwendet werden. Phospholipide natürlich erstellen gebogene Lipid-Doppelschichten und zeichnet sich aus einer Micelle. 6 Liposomen werden traditionell von Größe und Anzahl der Doppelschichten, dh große unilamellare Vesikel (LUV), kleine einschichtige Vesikel (SUVs) und multilamellare Vesikel (MLV) 7 eingestuft. Insbesondere ist die Herstellung von homogenen Liposomen in verschiedenen Größen für das Studium Membrankrümmung, die eine wichtige Rolle bei der zellulären Signalübertragung, Endo-und Exozytose, Membranfusion und Proteintransport 8 wichtig. Mehrere Gruppen analysieren, wie sich Proteine verwendet werden, zu modulieren Prozesse, die Membrankrümmung einzubeziehen und somit vorbereiten Liposomen mit Durchmessern <100 bis 400nm bis ihr Verhalten auf Zellfunktionen 3 studierst. Andere konzentrieren sich auf Liposom-Arzneistoff-Verkapselung, Studium Liposomen als Vehikel zu transportieren und liefern ein Medikament von Interesse 9. Drug-Kapselung erreicht wie während Liposomenbildung 9 gemeldet werden. Unsere Extrusionsschritt sollte nicht die verkapselten Wirkstoffs aus zwei Gründen, dh sie sollten (1) Wirkstoffverkapselung vor diesem Schritt erreicht werden und (2) Liposomen sollten ihrer natürlichen biophysikalischen und formstabil bleibt, sicher trägt das Arzneimittel im wässrigen Kern. Diese Forschungsergebnisse legen nahe, weitere Ziele die Notwendigkeit für eine optimierte Methode, um eine stabile Sub-Mikrometer-Lipidvesikel zu entwerfen.
Dennoch weisen die aktuellen Liposomenzubereitung Technologien (Beschallung 10, Frost-und Tauwetter-10, Sedimentation) nicht zulassen, Herstellung von Liposomen mit stark gekrümmten Oberfläche (dh Durchmesser <100 nm) mit hoher Konsistenz und Effizienz 10,5, die der physischen Begrenztheit Studien eines Emerging Bereich der Membrankrümmung Fernerkundung. Hier präsentieren wir eine robuste Herstellungsmethode für eine Vielzahl von biologisch relevanten Liposomen.
Manuelle Extrusion unter Verwendung gasdichte Spritzen und Polycarbonatmembranen 10,5 ist eine gängige Praxis, aber Heterogenität wird oft beobachtet, wenn mit Porengrößen <100 nm aufgrund aufgrund der Variabilität der manuellen Druck aufgebracht. Wir verwendeten einen konstanten Druck-gesteuerten Extrusionsvorrichtung, um synthetischen Liposomen, deren Durchmesser im Bereich zwischen 30 und 400 nm herzustellen. Die dynamische Lichtstreuung (DLS) 10, 11 und Elektronenmikroskopie Nanopartikel Tracking-Analyse (NTA) 12 wurden verwendet, um die Liposomen-Größen zu quantifizieren, wie in unserem Protokoll beschrieben, mit kommerziellen Polystyrol (PS) Perlen als Kalibrier-Standard verwendet. Eine nahezu lineare Korrelation zwischen der verwendeten Porengrößen und der experimentell bestimmten Liposomen beobachtet, was eine hohe Wiedergabetreue der druckgesteuerten Liposomenpräparation erfüllthod. Ferner haben wir gezeigt, dass diese Lipidvesikel Herstellungsverfahren allgemein anwendbar, unabhängig von verschiedenen Größen Liposom ist. Schließlich haben wir auch in einem zeitlichen Verlauf Studie zeigte, dass diese vorbereiteten Liposomen stabil waren für bis zu 16 Stunden. Ein Vertreter in Nano-Größe Liposomenzubereitung Protokoll wird unter Beweis gestellt.
Verwenden des Avestin LiposoFast LF-50 Extruder, haben wir gezeigt, wie kleine, synthetischen Liposomen durch ein druckgesteuertes System hergestellt. Es ist wichtig zu beachten, dass multilamellare Vesikel spontan nach Liposom Hydratisierung, die Herstellung von kleineren Nanopartikel führen kann. Diese kleinen multilamellare Vesikel wird unweigerlich durch die größere Polycarbonat-Membran Porengröße fließen, wodurch Heterogenität in Lösungen von einschichtigen Vesikeln durch eine große Filterporengröße prod…
The authors have nothing to disclose.
Diese Arbeit wurde von dem Howard Hughes Medical Institute (HHMI) Collaborative Innovation Award unterstützt. LAM wurde von der Signaling and Cellular Verordnung National Institute of Health Ausbildungsförderung (T32 GM008759) und der NIH Ruth L. Kirschstein Pre-Doctoral Fellow (CA165349-01) unterstützt. Wir möchten Prof. Michael Stowell (CU Boulder), Prof. Douglas Rees und Prof. Rob Phillips (Caltech) für ihre wertvollen Kommentare danken.
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
Chloroform | Sigma-Aldrich | 02432-25ML | 95% stabilizers |
High Grade Methanol | Sigma-Aldrich | 179337-4L | |
Liposofast LF-50 Extruder | Avestin, Inc. | ||
Phospholipids | Avanti Polar Lipids | ||
Polycarbonate Pores | Avestin, Inc. | 25 mm diameter | |
Drain discs PE | Avestin, Inc. | 230600 | 25 mm diameter |