Nano ölçekli Lipid Vesiküller Hazırlanması için Sabit Basınç kontrollü Ekstrüzyon Yöntemi
Summary
Bu protokol, homojen bir yüksek derecede mikronaltı boyutlarda lipid kesecikler hazırlanması için bir çekme yöntemi açıklar. Bu yöntem, lipozom preparatı için kontrollü bir nitrojen akışı hızları ile bir basınç kontrol sistemi kullanır. Lipid hazırlanışını<sup> 1,2</sup>, Lipozom ekstrüzyon ve boyutu karakterizasyonu burada sunulacaktır.
Abstract
Lipozomlar, yaygın olarak protein-protein, protein-lipid etkileşimler 3, monitör ilaç teslim 4,5, ve kapsülleme 4 platformun çalışmak için taklit eden bir hücre membranı olarak kullanılan doğal ve sentetik fosfolipidler oluşan yapay olarak hazırlanmış kesecikler vardır. Fosfolipidler doğal bir misel kendisini ayıran, kavisli lipid bilayers oluşturun. 6 Lipozomlar geleneksel bilayers, yani büyük tek lamelli kesecikler (luvs), küçük tek lamelli kesecikler (SUV) ve multilamellar veziküller (MLVs) 7 büyüklüğü ve sayısına göre sınıflandırılır. Özellikle, çeşitli boyutlarda homojen lipozomlar hazırlanması endo-ve ekzositoz olayları, membran füzyon ve protein trafiğini 8, hücre sinyal hayati bir rol oynar membran eğrilik eğitim için önemlidir. 400 – Birçok grup proteinleri membran eğrilik içerir ve bu nedenle çapları lipozomlar hazırlamak süreçleri <100 modüle kullanılır nasıl analizhücre fonksiyonlarını 3 davranışlarını incelemek için Nm. Diğer araçların ilgi 9 uyuşturucu taşımak ve teslim gibi lipozomlar okuyan, lipozom-ilaç kapsülleme odaklanın. Lipozom oluşumu sırasında 9 bildirildiği gibi, Drug kapsülleme elde edilebilir. Bizim ekstrüzyon adım iki nedenden dolayı kapsüllü ilaç etkilememesi gerektiğini, yani (1) ilaç kapsülleme bu adımı önce elde edilmelidir ve (2) lipozomlar güvenli sulu çekirdek ilaç taşıyan, doğal biyofiziksel istikrarı muhafaza etmelidir. Bu araştırma hedeflerini daha istikrarlı mikronaltı lipid veziküller tasarlamak için optimize edilmiş bir yöntem olan ihtiyacı göstermektedir.
Bununla birlikte, mevcut lipozom hazırlama teknolojileri (sonication 10, donma ve çözülme-10, sedimantasyon) biyofiziksel sınırlar yüksek tutarlılık ve verimlilik 10,5 ile oldukça eğimli (yani çapı <100 nm) lipozomlar hazırlanmasına izin vermez Bir emergi çalışmalarımembran eğrilik algılama ng alanı. Bu yazıda, biyolojik ilgili lipozomlar çeşitli için sağlam bir hazırlama yöntemi sunuyoruz.
Gaz sızdırmaz şırıngalar ve polikarbonat membran 10,5 kullanarak Manuel ekstrüzyon yaygın bir uygulamadır ama gözenek boyutları uygulanan manuel basınç değişkenliği nedeniyle nedeniyle <100 nm kullanırken heterojenite sık görülmektedir. Biz, çapları 30 ile 400 nm arasında değişmektedir sentetik lipozomlar hazırlamak için sabit bir basınç kontrollü ekstrüzyon cihazları istihdam. Dinamik ışık saçılması (DLS) 10, 11 ve elektron mikroskopi nanoparçacık izleme analizi (NTA) 12 bizim protokolde tarif edildiği gibi, ticari polistiren (PS), bir kalibrasyon, standart olarak kullanıldı boncuklar ile, lipozom boyutları ölçmek için kullanılmıştır. Bir yakın doğrusal korelasyon bizim basınç kontrollü lipozom hazırlık yüksek sadakat gösteren, meslek gözenek boyutları ve deneysel olarak belirlenmiştir lipozomlar arasında anlamlı karşılandıdeme usulü. Ayrıca, bu yağ vesikül hazırlama yöntemi, çeşitli boyutlarda lipozom bağımsız olarak, genel olarak uygulanabilir olduğunu göstermiştir. Son olarak, biz de en fazla 16 saate kadar Hazırlanan bu lipozomlar stabil olduğu bir zaman ders çalışmada gösterilmiştir. A temsilcisi nano boyutlu lipozom hazırlık protokolü aşağıda gösterilmiştir.
Protocol
Discussion
Avestin Liposofast LF-50 Extruder kullanarak, ne kadar küçük ölçekli, sentetik lipozomlar bir basınç kontrol sistemi ile hazırlanmıştır gösterdi. Bu multilamellar veziküller küçük nanopartiküllerin üretimine yol açabilir lipozom hidrasyon, sonrasında kendiliğinden oluşması dikkat etmek önemlidir. Bu küçük multilamellar veziküller kaçınılmaz olarak büyük bir filtre gözenek tarafından üretilen ünilamellar veziküllerin çözümleri heterojenite neden büyük polikarbonat membran gözen…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma Howard Hughes Tıp Enstitüsü (HHMI) Ortak İnovasyon Ödülü ile desteklenmiştir. LAM Sinyali ve Sağlık eğitim bursu Hücresel Yönetmeliği Ulusal Enstitüsü (T32 GM008759) ve NIH Ruth L. Kirschstein Ön Doktora Sonrası (CA165349-01) tarafından desteklenmiştir. Biz onların değerli yorumları için Prof Michael Stowell (CU Boulder), Prof Douglas Rees ve Prof Rob Phillips (Caltech) teşekkür etmek istiyorum.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
| Chloroform | Sigma-Aldrich | 02432-25ML | 95% stabilizers |
| High Grade Methanol | Sigma-Aldrich | 179337-4L | |
| Liposofast LF-50 Extruder | Avestin, Inc. | ||
| Phospholipids | Avanti Polar Lipids | ||
| Polycarbonate Pores | Avestin, Inc. | 25 mm diameter | |
| Drain discs PE | Avestin, Inc. | 230600 | 25 mm diameter |
References
- Connor, J., Bucana, C., Fidler, I. J., Schroit, A. J. Differentiation-dependent expression of phosphatidylserine in mammalian plasma membranes: quantitative assessment of outer-leaflet lipid by prothrombinase complex formation. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 86, 3184-3188 (1989).
- Smith, S. A., Morrissey, J. H. Rapid and efficient incorporation of tissue factor into liposomes. J. Thromb. Haemost. 2, 1155-1162 (2004).
- Hui, E., Johnson, C. P., Yao, J., Dunning, F. M., Chapman, E. R. Synaptotagmin-mediated bending of the target membrane is a critical step in Ca(2+)-regulated fusion. Cell. 138, 709-721 (2009).
- Loughrey, H. C., Choi, L. S., Cullis, P. R., Bally, M. B. Optimized procedures for the coupling of proteins to liposomes. J. Immunol. Methods. 132, 25-35 (1990).
- Mui, B., Chow, L., Hope, M. J. Extrusion technique to generate liposomes of defined size. Methods Enzymol. 367, 3-14 (2003).
- Gruner, S. M., Cullis, P. R., Hope, M. J., Tilcock, C. P. Lipid polymorphism: the molecular basis of nonbilayer phases. Annu. Rev. Biophys. Biophys. Chem. 14, 211-238 (1985).
- Guven, A., Ortiz, M., Constanti, M., O’Sullivan, C. K. Rapid and efficient method for the size separation of homogeneous fluorescein-encapsulating liposomes. J. Liposome. Res. 19, 148-154 (2009).
- Zimmerberg, J., Kozlov, M. How proteins produce cellular membrane curvature. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 7, 9-19 (2006).
- Chonn, A., Cullis, P. R. Recent advances in liposomal drug-delivery systems. Curr. Opin. Biotechnol. 6, 698-708 (1995).
- Mayer, L. D., Hope, M. J., Cullis, P. R. Vesicles of variable sizes produced by a rapid extrusion procedure. Biochim. Biophys. Acta. 858, 161-168 (1986).
- Matsuoka, K., Schekman, R. The use of liposomes to study COPII- and COPI-coated vesicle formation and membrane protein sorting. Methods. 20, 417-428 (2001).
- Dragovic, R. A., Gardiner, C., Brooks, A. S., Tannetta, D. S., Ferguson, D., Hole, P., Carr, B., Redman, C., Harris, A. L., Dobson, P. J., Harrison, P., Sargent, I. L. Sizing and phenotyping of cellular vesicles using Nanoparticle Tracking Analysis. Nanomedicine. , (2011).
- Hunter, D. G., Frisken, B. J. Effect of extrusion pressure and lipid properties on the size and polydispersity of lipid vesicles. Biophys J. 74, 2996-3002 (1998).
