Summary
Die Fäden werden in der Regel erforderlich, um Gewebe während chirurgischer Eingriffe zu reparieren. Jedoch kann ihre Anwendung als problematisch, da sie invasiv sind und kann Gewebe beschädigen. Die Herstellung und Anwendung Methoden einer neuartigen Gewebekleber werden hier berichtet. Diese Klebefolie wird lasersensitiven aktiviert und erfordert nicht die Verwendung von Nähten.
Abstract
Photochemischen Gewebe Bonden (PTB) eine Technik zum nahtlosen Gewebereparatur, die durch Aufbringen einer Lösung von Bengalrosa (RB) zwischen zwei Gewebekanten 1,2 erreicht wird. Diese werden dann durch einen Laser, der selektiv von der RB absorbiert bestrahlt. Die daraus resultierenden photochemische Reaktionen vermeintlich vernetzen die Kollagenfasern im Gewebe mit minimalen Wärmeerzeugung 3. In diesem Bericht hat RB in dünnen Chitosanfilme eingebaut worden, um einen Roman Gewebekleber, die Laser-aktiviert ist herzustellen. Klebschichten auf Chitosan und enthaltend ~ 0,1 Gew.% bezogen RB, hergestellt sind und mit diesen verbunden Kälberdarm und Ratte tibialis von einem Festkörperlaser (λ = 532 nm, Fluence ~ 110 J / cm 2, Spotgröße ~ 0,5 cm) . Eine einzelne Spalten Tensiometer, eine Schnittstelle mit einem Personal-Computer verwendet wird, um die Bindungsstärke zu testen. Die RB-Chitosan Klebeverbindungen fest mit dem Darm mit einer Stärke von 15 ± 6 kPa, (n = 30). Die Haftfestigkeit fällt nach 2 ± 2 kPa (n = 30), wenn der Laser nicht auf den Klebstoff aufgetragen. Die Anastomose tibialis kann auch ohne die Verwendung von Nähten abgeschlossen sein. Eine neuartige Chitosan Kleber hergestellt worden ist, dass photochemisch Bindungen an Gewebe und erfordert keine Nähte.
Protocol
Ein. Chitosan Klebstoffzubereitung
- Die Chitosanpulver ist löslich in Essigsäure-Lösung, zur Herstellung einer Stammlösung von Essigsäure (2% v / v), 10 ml Eisessig zu 490 ml deionisiertem Wasser (DI-H 2 O).
- Zur Herstellung einer Stammlösung von Bengalrosa (RB) (0,01% w / v) in Essigsäure, 5 mg wiegen RB in einer Phiole mit Alufolie eingewickelt, um zu vermeiden Photobleichen. 0,5 ml DI-H 2 O, um das Pulver dann auflösen hinzuzufügen 49,5 ml der Essigsäure Stammlösung (beschrieben in Abschnitt 1.1).
- Zur Herstellung von Chitosan-Lösung (1,7% w / v), wiegen 0,85 g Chitosan Pulver (mittlere MW, 85% Acetylierungsgrad) und in den 50 ml RB Essigsäurelösung. Die Kontrolle wurde durch Lösen des Chitosan in Essigsäure-Lösung ohne RB hergestellt.
- Hinzufügen eines Magnetrührers dem Chitosan Mischung zugegeben und bei Raumtemperatur. Um eine vollständige Auflösung der Komponenten zu gewährleisten, rühren das Chitosanin Essigsäure + RB für zwei Wochen und dem Chitosan in Essigsäure für 5 Tage (Kontrolle). Wenn Chitosan gelöst wird, erhöht sich der pH der Lösung von 2,6 bis ~ ~ 3,9. Beachten Sie, dass RB schlecht löslich in sauren pH-Wert ist, und es erfordert eine Erhöhung des pH der Lösung und einer ausgefahrenen Rührzeit sich aufzulösen.
- Zentrifugieren der Lösungen bei 3270 × g für 1 Stunde und den Überstand unter Verwendung von zum Beispiel eine sterile 10-ml-Spritze. Achten Sie darauf, um die Verunreinigung Pellet stören. Während dieses Schrittes wird die Lösung von makroskopischen Verunreinigungen und Unlösliches gereinigt.
- Spritzen Sie die (zentrifugiert) Chitosanlösung auf einer ebenen Acrylglasstreifen Platte mit einer sterilen Spritze. Die Dicke des getrockneten Films hängt von dem Verhältnis zwischen der abgegebenen Menge der Lösung und der Oberfläche, über die die Lösung verteilt. Stellen Sie sicher, dass die Lösung frei von Luftblasen ist und gleichmäßig auf der Platte verteilt. Um dünne Filme mit ~ 13 um Dicke zu erhalten, injizieren ~ 1 ml Lösung über 12 cm 2 Fläche(Maße ~ 3x4 cm, Abb. 1A).
- Decken Sie die Plexiglas Platte mit einem Bildschirm, der Aluminiumfolie zum Beispiel aus, um zu verhindern Ausbleichen der Lösung. Sicherzustellen, dass genügend Luft Belüftung gewährleistet ist, um die Lösung unter dem Bildschirm trocknen.
- Lassen Sie die Lösung bei Raumtemperatur (25 ° C) und Druck (1 atm), bis der resultierende Film ist unlöslich in Wasser und nicht aufquellen makroskopisch trocken. Dies wird typischerweise in 2 Wochen erreicht.
- Trennen der Folien vorsichtig mit einem dünnen und flachen Spatel: diese Folien können leicht vom Perspex Bramme werden ohne sie zu beschädigen abgeschält.
- Die Dicke der Filme mit einem Mikrometer.
- Schneiden Sie den Kleber in rechteckigen Streifen mit einem sauberen scharfen Schere und legen Sie sie zwischen sterilen Glasplättchen ihre flache Form zu bewahren. Wickeln Sie die Folien in Aluminiumfolie für Lichtabschirmung und speichern Sie sie bei Raumtemperatur. Beschriften Sie die Klebstoffe mit oder ohne RB als "stieg Kleber" oder "Chitosan ADHESive "bezeichnet.
- Die erhöhte Klebefilme können sterilisiert unter Verwendung von Ethanol (90%) oder mit Gammastrahlung (0,1 kGy / h für 24 Std.) 4,5 ist.
2. Adhesive optische Dämpfung
- Befestigen Sie die Rose Klebstoff in einer Quarzküvette.
- Aufzeichnen ihrer abgeschwächte Spektrum im Bereich von 400 - 800 nm unter Verwendung eines Zweistrahl-Spektralphotometer 4.
- Unter der Annahme der Gültigkeit der Beerschen Gesetz berechnet die mittlere freie Weglänge des Klebstoffs wie folgt: I = I 0 e-Ax wobei I 0 die Intensität einfallenden Strahls, 1 / A ist die mittlere freie Weglänge, und x ist die Filmdicke.
- Wiederholen Schritte 2.1 bis 2.3 für den Klebstoff auf Chitosan als Kontrolle zu dienen.
3 In-Vitro-Anwendung:. Laser Tissue Bonding am Darm
- Ernte Kälberdarm unmittelbar nach Tier Euthanasie und bei -80 ° C.
- Vor Gebrauch auftauen und Hydrat der tissue durch Eintauchen in DI-H 2 O für 10 min.
- Halbieren des Gewebes in Abschnitte (2 x 1 cm) unter Verwendung eines # 10 Klinge unter einem Operationsmikroskop (x10). Halten Sie die Abschnitte feuchte mit DI-H 2 O.
- Bringen Sie die Inzision Baumstümpfe nahe beieinander (Ende zu Ende). Wischen Sie überschüssiges Wasser von der Oberfläche mit Wattestäbchen.
- Legen Sie eine Rose Klebestreifen (10 x 6 mm) über dem Einschnitt auf der Serosa Schicht mit Mikropinzetten Gewährleistung der vollen Kontakt mit dem Darm (Abbildung 2).
- Die Gewebeklebung der Rose Kleber wird von einem diodengepumpten Festkörperlaser, die zu einer optischen Mehrmodenfaser (Kerndurchmesser 200 um) 4 gekoppelt wird aktiviert.
- Setzen des Leistungspegels des Lasers bis 180 mW und bestrahlen den Klebstoff für ~ 6 min mit einer Strahlpunktgröße ~ 5 mm, über die Parameter in Tabelle 1 aufgelistet. Auftropfen bestrahlen der Kleber sichergestellt wird, dass jeder Punkt für ~ 5 Sekunden vor dem Bewegen des Strahls mit dem benachbarten Fleck bestrahlt. TVerfahren garantiert sein, dass der Laserstrahl die gesamte Oberfläche der Klebstoff mehrere Male scannt.
- Um das Gewebe Bindungsfestigkeit beurteilen, Verriegeln einer Probe auf einem kalibrierten Einzelsäule Tensiometer (Instron, MA, USA) unter Verwendung von mechanischen Griffe. Bewegen Sie die Griffe bei 22 mm / min bis die beiden Gewebe Baumstümpfe separate 4.
- Legen Sie eine Rose Kleber auf das Gewebe, wie in Schritt 3.5 beschrieben. Nicht bestrahlen die Probe und messen Sie das Gewebe Haftfestigkeit wie in Schritt 3.8 beschrieben. Dieses Beispiel dient als Kontrolle.
4 In Vivo Anwendung:. Nervus tibialis Anastomose
- Sedate der Wistar-Ratte mit Isofluran / O 2-Gemisch (4% während der Induktion, 2% danach) 5. Subkutan injizieren Buprenex (0,03 mg / kg), um intra-operative analgetische Wirkung bereitzustellen und zu lindern mögliche Schmerzen oder Unbehagen.
- Das folgende operative Verfahren sollte unter einem Operationsmikroskop (x10) durchgeführt werden. Stellen Sie eine schräge HautSchnitt etwa 3 cm lang in der dorso-lateralen Teil des rechten Oberschenkels und setzen die tibialis mit einem Muskel-Splitting Ansatz durch die Gesäßmuskulatur 2.
- Teilweise sezieren und schneiden Sie die Adventitia des Nervus tibialis mit geraden Mikro-Schere und absorbieren überschüssiges Wasser mit einer sterilen Gaze oder Wattestäbchen.
- Schneiden Sie den Nervus tibialis mit Mikro-Schere.
- Positionieren Sie eine sterile Chitosan Streifen (Abmessungen 5 x 4 mm) unterhalb des Nervus tibialis mit Mikro-Pinzette.
- Angleichung der Nervenstümpfe end-to-end mit Mikro-Pinzette über die Rose Klebestreifen.
- Der Streifen vollständig haftet an dem Nerv Ausbilden einer Manschette, die mit der Drehung des Nervs während der Laserbestrahlung des Bandes unterstützen.
- Aktivieren der Rose Klebstoff mit dem Laser wie in den Schritten 3.6 beschrieben) und 3.7).
- Schneiden Sie die redundante stieg Kleber aus dem Kragen des operierten Nerven.
- Schließen Sie die Muskeln und die Haut mit fünf 3-0 Nähte 5. Post-operative Beitreibungsverfahren sollten einschließlich der täglichen Inspektion für Dehiszenz oder Eiterbildung und analgetische Verwaltung gefolgt werden, falls erforderlich.
5. Repräsentative Ergebnisse
Die Folien, die erhalten sind hell stieg in Farbe, dünn und haben eine glatte Oberfläche (Abbildung 1). Sie sind auch flexibel und kann in Röhren mit geringem Durchmesser ohne daß Risse oder sonstige Beschädigungen scheinbaren (1B) gerollt werden. Die Rosette Klebstoff hat zwei Absorptionsspitzen bei 530 und 562 nm; der grüne Laser ist also stark von dem Klebstoff und dem entsprechenden Dämpfung Länge bei 532 nm absorbiert ist ~ 12 um (Abb. 3). Dagegen dämpft Chitosanfilme ohne RB schwach des Lasers (1 / A ~ 162 Mikrometer), wahrscheinlich aufgrund von Streuung. Es scheint aus den Spektren Grundstück, dass keine signifikante Aggregation von RB in den Filmen auftritt.
Die Rose Klebeverbindungen festin den Darm auf Laserbestrahlung (Abbildung 2) erreicht einen typischen maximalen Last bei Ausfall von 0,9 ± 0,4 N (n = 30). Die Haftfestigkeit wurde als die maximale Last durch die Klebefläche, nämlich ± 6 15 unterteilt kPa (n = 30) geschätzt. Die nicht bestrahlten Rose Klebstoff erheblich weniger an Gewebe gebunden (2 ± 2 kPa, n = 30, ungepaarten t-Test p <10 6). Das in-vivo Anastomose der tibialis wurde erfolgreich nach dem Aufbringen und Verbinden der Rose Klebstoff in Verbindung mit dem grünen Laser erreicht. Eine Woche nach der Operation war die betätigte Nerv in Kontinuität und Festigkeit der Reparatur betrug 17 ± 9 kPa (n = 10).
Abbildung 1. A) Der RB-Chitosan-Lösung wird auf einer flachen Plexiglas Platte (Deckenstärke ~ 5 mm) gegossen. Graph Papier unter der Decke platziert, um die dry-Besetzung Schritt zu erleichtern. Das wasserunlösliche film wird zwei Wochen nach dem Gießen erhalten. B) Die Rose Klebstoff ist flexibel und kann in einem kleinen Zylinder gerollt werden.
Abbildung 2. Die Rose Klebstoff wird auf Kälberdarm nach Laserbestrahlung gebunden. Gleichmäßige Bestrahlung erfolgt auf der RB Klebstoff während gewebespezifischen Bonden aufgebracht, doch ausgewählten Flecken sind in dieser Abbildung gezeigt, um die Photo-Bleichwirkung des Lasers auf dem Klebstoff zeigen.
Abbildung 3. Das Absorptionsspektrum (in willkürlichen Einheiten) der Rose Klebstoff zeigt zwei Peaks bei 530 und 562 nm liegt. Der grüne Laser (λ = 532 nm) ist daher stark durch den Klebstoff während der Laserbelichtung absorbiert. Das Chitosan Klebstoff ohne RB absorbiert schlecht des Laserstrahls.
| n | Leistung (W) | Zeit (s) | Fluenz (J / cm 2) | I (W / cm 2) | Max Load / Area (kPa) | ||
| Adhesive + Laser | 30 | 60 ± 10 | 0,18 ± 0,03 | 365 ± 5 | ~ 110 | ~ 0,9 | 15 ± 1 |
| Klebstoff | 30 | 60 ± 10 | NA | NA | NA | NA | 2 ± 2 |
Tabelle 1. Legend. n, Probennummer; Gebiet, eine Oberfläche von der Rose Klebstoff (Mittelwert ± maximalen Fehler), Power, Laserleistung (Mittelwert ± maximalen Fehler); Zeit, Bestrahlungszeit (Mittelwert ± maximalen Fehler); Fluence, durchschnittlich Laserfluenz; I, geschätzten irradiance; Zuladung / Gebiet, maximaler Last bei Ausfall des reparierten Gewebe durch die Klebefläche unterteilt, (Mittelwert ± SE).
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Discussion
Der Klebstoff stieg Fertigung auf einfache chemische Gießverfahren basiert, wenn die Auflösung der RB in sauren pH erfordert verlängert Rühren der Chitosanlösung. Es ist wichtig, damit die Lösung trocknet, bis es einen wasserunlöslichen Film wird. Dies geschieht, wenn das Gewicht Wassergehalt beträgt ~ 10% im getrockneten Films 6. Unlösliche Filme sind in der Regel 2 Wochen nach Trocken-Casting bei Standardbedingungen von Temperatur und Druck (~ 25 ° C und ca. 1 atm) erhalten. Der Mechanismus von Gewebe Bindung ist noch nicht klar, obwohl beobachtet wurde, dass RB diffundiert aus dem Klebstoff in das benachbarte Gewebe, so dass der Laser auf photo-aktivieren sie effizient bei der Gewebeschnittstelle. Es kann spekuliert, dass die Fähigkeit zur Herstellung von RB Singulettsauerstoff, bei Bestrahlung mit Licht, eine Rolle bei der Vernetzung von Kollagen und Chitosan Gewebe über ihre Aminogruppen 7,8 spielen. Eine kürzlich durchgeführte Studie über die Rose Kleber zeigte auch, dass die maximale Temperatur während des tis erreichtsue-Kleben war ~ 32 ° C, unterstützen die Hypothese einer photochemischen Prozess 4. Andere nahtlosen Techniken für die Reparatur von Gewebe werden derzeit von mehreren Arbeitsgruppen untersucht. Laser Gewebeschweißen (LTW) zum Beispiel ist erfolgreich in der Augenchirurgie nach Pini et al 9 angelegt. Im Allgemeinen jedoch kann LTW verursachen Sicherheiten thermische Schädigung als Gewebeinnentemperatur kann 65-75 ° C während der Laserbestrahlung zu erreichen. Cyanacrylat Klebstoffe sind auch klinisch Hautwunden statt Nähte zu schließen angewendet, dennoch sind sie in der Regel nicht für die interne Organreparatur aufgrund ihrer Toxizität 10 verwendet. Obwohl die Rose Kleber (~ 15 kPa) hat eine höhere Bindungsstärke als Fibrinkleber (~ 8 kPa) 11, Cyanacrylat Klebstoffe immer noch die stärkste Haftung (~ 150 kPa) 12. Die Dicke der Rose Kleber erfordert besondere Aufmerksamkeit bei der Fertigung: ein dicker Kleber (≥ 20 um) würde zum Beispiel verhindern, dass die Laser-vom Erreichen des Gewebe-Grenzfläche und schwächen würde die Bindungsstärke aufgrund übermäßiger Absorption der Laserstrahlung durch die Bengalrosa. Eine dünne Klebstoff (<10 Mikrometer), auf der anderen Seite würde der Laser Bestrahlungsstärke und Fluenz an dem Klebstoff-Gewebe-Grenzfläche zu erhöhen. Allerdings sollte darauf bei der Verringerung der Filmdicke genommen werden, um eine übermäßige Erwärmung des Gewebes während der Laserbestrahlung zu verhindern. Die Rosette Klebstoff induziert keine signifikanten zytotoxischen Wirkungen auf die menschliche Fibroblasten 4 und weist somit eine vielversprechende Verwendung beim Reparieren Weichgewebe innerhalb des Körpers, wie etwa Darm und peripheren Nerven. Dieser Klebstoff kann auch Anwendungen im Tissue Engineering: Es kann integriert, zum Beispiel in ein Pflaster mit extrazellulären Matrices, um Gewebe zu reparieren und die Wundheilung zu verbessern, ohne die Hilfe von Nähten 13 werden. Es wird darauf hingewiesen, dass wir keine signifikanten Nebenwirkungen, einschließlich lokale Entzündung, die mit diesem Verfahren verbunden werden beobachtet werden.
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Disclosures
Keine Interessenskonflikte erklärt.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde von der UWS Research Grant unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Rose Bengal | Sigma-Aldrich | 632-69-9 | |
| Chitosan (medium MW) | Sigma-Aldrich | 10318AJ | |
| Glacial acetic acid | Sigma-Aldrich | 08050051 | 2% v/v in DI water |
| Magnetic stirrer | Heidolph | MR Hei-Mix S | |
| Centrifuge | Beckman Coulter Inc. | Allegra X-12R | |
| Spectrophotometer | Varian Inc., Agilent | Cary 4000 UV-Visible | |
| Laser | CNI Laser | MGL-532 | |
| Micrometer | Mitutoyo | Series 227 | |
| Surgical microscope | Carl Zeiss, Inc. | OPMI |
References
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