Summary
Dikişler genellikle cerrahi işlemler sırasında doku onarımı için gereklidir. Onlar invaziv ve doku zarar verebilir Ancak, bunların uygulama sorunlu olabilir. Bir roman doku yapıştırıcı üretim ve uygulama yöntemleri burada raporlanır. Bu yapışkan film lazer devreye girer ve sütürlerin kullanımı gerektirmez.
Abstract
Fotokimyasal doku bağlama (PTB) iki doku kenarları 1,2 arasında gül bengal (RB) bir çözeltisi uygulanarak elde edilir ve doku onarımı, sütürsüz için bir tekniktir. Bunlar daha sonra seçici RB tarafından emilir bir lazer tarafından ışınlanır. Çıkan fotokimyasal reaksiyonlar sözde minimum ısı üretimi 3 dokuda kollajen liflerin çapraz. Bu raporda, RB lazer aktive olan bir roman doku yapıştırıcısı imal ince kitosan filmlerde dahil edilmiştir. Kitosan ve ~ 0.1 ağırlıkça% RB içeren esas Yapıştırıcı film, bir katı hal lazeri (λ = 532 nm, Fluence ~ 110 J / cm 2, spot büyüklüğü ~ 0.5 cm) tarafından imal ve buzağı bağırsak ve sıçan tibia sinirlere yapıştırılır . Kişisel bir bilgisayar ile ara-yüzeyi kurulan bir tek sütun gerilimölçer, yapışma direnci test etmek için kullanılır. 15 bir güç ± 6 kPa, (n = 30) ile sıkıca bağırsak RB-kitosan yapıştırır. Yapışma gücü 2 & düşerplusmn; 2 kPa (n = 30) lazer yapıştırıcı uygulanan değilken. Tibial sinir anastomoz da dikişler kullanımı olmaksızın yapılabilir. Bir roman kitosan yapışkan olduğu tahvil fotokimyasal doku imal edilmiştir ve dikiş gerektirmez.
Protocol
1. Kitosan Yapıştırıcı Hazırlık
- Çitosan tozu, asetik asit çözelti içinde çözünür olan, asetik asit (% 2 v / v) bir stok çözelti hazırlamak için, 490 ml deiyonize su (di-H2O) için 10 ml glasiyal asetik asit ilave edin.
- Asetik asit içinde Rose Bengal (RB) (% 0.01 w / v) bir stok çözeltisi hazırlanması için, photobleaching önlemek için alüminyum folyo ile sarılmış bir RB şişe içinde 5 mg ağırlığındadır. Asetik asit stok çözeltisi (bölüm 1.1 'de anlatıldığı gibi) ve 49.5 mL daha sonra toz dağıtma DI-H2O 0.5 ml ilave edilir.
- Çitosan solüsyonu (% 1.7 w / v) hazırlanması için, çitosan tozu (orta MW, asetilasyon derecesine% 85) 0.85 g ağırlığında ve RB asetik asit solüsyonundan 50 ml eklenir. RB kontrol olmaksızın asetik asit solüsyonu içinde çitosan çözülmesiyle hazırlanmıştır.
- Çitosan karışım için bir manyetik karıştırıcı, ilave edin ve oda sıcaklığında karıştırın. Bileşenlerin tam bir çözünme sağlamak için, kitosan karıştırmaİki hafta ve 5 gün süre ile asetik asit içinde kitosan (kontrol) asetik asit içinde + RB. Çitosan çözünmüş zaman, çözelti pH ~ ~ 2.6 'dan 3.9' a artar. RB asidik pH içinde zayıf çözünürlüğe sahip olup, burada çözeltinin pH'si ve çözünmesi için uzun bir süre içinde karıştırılmakta olan bir artış gerektirir dikkat ediniz.
- 1 saat süre ile 3270 x g de santrifüjlenir ve çözümler, örneğin, bir steril 10 ml şırınga kullanılarak supernatant toplamak. Safsızlık pelet rahatsız değil emin olun. Bu adım sırasında, çözüm makroskopik kirlilikler ve çözünmeyen madde temizlenir.
- Steril bir şırınga kullanarak düz perpex levha üzerinde (santrifüj) kitosan çözeltisinin enjekte. Kuru film kalınlığı, çözeltinin dağıtılan miktarı ve çözelti yayılmış olan fazla yüzey alanı arasındaki orana bağlıdır. Çözümü hava kabarcıkları serbest ve eşit levha üzerinde yayıldı emin olun. ~ 13 mikron kalınlığında ince filmler elde etmek için, 12 cm 2 yüzey üzerinde ~ 1 ml solüsyon enjektealanı (boyutları ~ 3x4 cm, Şekil 1A).
- Çözeltinin photobleaching önlemek için örneğin alüminyum folyodan yapılmış bir ekranı olan bir Perspex levha, kapak. Yeterli havalandırma ekranın altında çözüm kuru garantili olduğundan emin olun.
- Elde edilen film, suda çözünmez ve makroskopik olarak kabarmaz kadar oda sıcaklığında (25 ° C) ve basıncı (1 atm) kurumaya çözelti bırakın. Bu, tipik olarak 2 hafta içinde elde edilir.
- Dikkatle ince ve düz spatula kullanarak filmler ayırın: bu filmlerin kolayca zarar vermeden perspex levha kapalı soyulmuş olabilir.
- Bir mikrometre kullanılarak film kalınlığı ölçülür.
- Temiz bir keskin makas ile dikdörtgen şeritler yapışkan kesin ve düz şekil korumak için steril cam slaytlar arasına koyun. Işık koruma için alüminyum folyo ile sarın slaytlar ve oda sıcaklığında saklayın. Veya "chitosan ADHES" yapıştırıcı gül "olarak RB olan veya olmayan yapıştırıcılar etiketleyinive "sırasıyla.
- Yapışkan filmler gama radyasyonu (0.1 kGy / 24 saat için saat) 4,5 ile veya (% 90) etanol kullanılarak sterilize edilebilir yükseldi.
2. Yapıştırıcı Optik Zayıflama
- Bir kuvars küvet içinde gül yapışkanlı Fix.
- Bir çift-kiriş spektrofotometre kullanarak 4 800 nm - 400 aralığında olan zayıflatılmış bir spektrum kaydedin.
- Şöyle Beer yasasının geçerliliği varsayarsak, yapıştırıcı zayıflama uzunluğunu hesaplamak: I = I 0 e-Ax nerede 0 olay ışık yoğunluğu, 1 / A zayıflama uzunluğu ve x film kalınlığıdır.
- Kitosan yapıştırıcı için 2.1 ile 2.3 bir kontrol olarak hizmet adımları tekrarlayın.
3 Vitro Uygulama In:. Bağırsak üzerine Lazer Doku Yapıştırma
- Hasat buzağı bağırsak hemen sonra -80 hayvan ötenazi ve mağaza ° C
- Kullanmadan önce, defrost ve hidrat ti10 dakika için DI-H2O içine daldırarak ssue.
- Operasyon mikroskobu (x10) altında # 10 bıçak kullanarak bölümleri (2 x 1 cm) içine doku ikiye bölmek. DI-H 2 O kullanarak bölümleri nemli tutun
- (Uçtan uca) birbirine yakın kesi kütükleri getirin. Pamuk ipuçlarını kullanarak yüzeyden fazla suyu silin.
- Bağırsak (Şekil 2) ile tam temas sağlanması microforceps ile seroza katman üzerinde kesi karşısında bir gül yapışkan bant (10 x 6 mm) yerleştirin.
- Gül yapışkan bir doku yapışma modlu fiber optik (çekirdek çapı 200 um) 4 yoluna bağlı bir diyot pompalı katı hal lazer tarafından aktive edilir.
- 180 mW lazer güç seviyesi ayarlayın ve Tablo 1'de listelenen parametreleri kullanarak ~ 5 mm ışın spot büyüklüğü ile ~ 6 dk için yapıştırıcı ışın. Spot ışık saçmak yapıştırıcı her yerinde bitişik nokta ışın geçmeden önce ~ 5 saniye boyunca ışınlanır sağlanması. TOnun prosedürü lazer ışını yapışkan birkaç kez bütün yüzey alanı tarar garanti eder.
- Doku yapıştırma gücü değerlendirmek için, mekanik kulpları kullanarak kalibre tek sütun tansiyometre (Instron, MA, ABD) için örnek bir kelepçe. 4 ayrı iki doku kütükleri kadar 22 mm / dak kulpları taşıyın.
- Adım 3,5 anlatıldığı gibi doku üzerinde bir gül yapıştırıcı yerleştirin. Örnek ışın ve adım 3.8 'de açıklandığı gibi doku yapıştırma gücünü ölçmek etmeyin. Bu örnek, bir kontrol olarak hizmet vermektedir.
4 Vivo Uygulama In:. Tibial Sinir Anastomoz
- O / izofluran 2 karışım (bundan sonra indüksiyon sırasında% 4,% 2) 5 ile Oturaklı Wistar sıçan. Subkutan intraoperatif analjezik aktivite sağlamak ve olası ağrı veya rahatsızlık hafifletmek için buprenex (0.03 mg / kg) enjekte.
- Aşağıdaki cerrahi prosedür, bir ameliyat mikroskobu (x10) altında gerçekleştirilmelidir. Oblik cilt Yapsağ uyluk dorsolateral kısmında uzun ve gluteal kasları 2 yoluyla bir kas bölme yaklaşımı ile tibial sinir maruz yaklaşık 3 cm kesi.
- Kısmen teşrih ve düz mikro-makas kullanarak tibial sinirin adventisya Döşeme ve steril gazlı bez veya pamuk ipuçları ile fazla su emer.
- Mikro-makas ile tibial sinir kesin.
- Mikro-forseps kullanarak tibial sinir altında steril bir kitosan şerit (boyutları 5 x 4 mm) yerleştirin.
- Yaklaşık sinir uçlarının gül yapışkan şeridi üzerinde mikro-forseps ile uç uca.
- Şeridi tam şerit lazer ışınlama sırasında sinir dönme konusunda yardımcı olabilecek bir yaka, oluşturan sinir yapışır.
- ) Adımları 3.6 açıklandığı gibi lazer ile yapışkan gül etkinleştirin) ve 3.7.
- Çalışan sinir yaka gereksiz yükseldi yapıştırıcı kesin.
- Beş 3-0 dikişler 5 ile kaslar ve cilt kapatın. Gerekirse Standart ameliyat sonrası iyileşme prosedürleri, ayrışma veya irin oluşumu ve analjezik uygulama için günlük muayene dahil takip edilmelidir.
5. Temsilcisi Sonuçlar
Elde edilen filmler parlak, renkli gül ince ve pürüzsüz bir yüzey (Şekil 1) sahiptirler. Onlar da esnek ve neden gözyaşı veya başka görünür hasar (Şekil 1B) olmadan, küçük çaplı tüpler içine yuvarlandı olabilir. Gül yapışkanlı 530 ve 562 nm de iki emme zirvesi vardır; yeşil lazer ~ 12 mikron (Şekil 3) ve böylece güçlü 532 nm de yapıştırıcı ve gelen zayıflama uzunluğu tarafından emilir. Buna karşılık, RB olmadan kitosan film muhtemelen zayıf bir şekilde yayıldığı için lazer (1 / A ~ 162 um) zayıflar. Bu SaB anlamlı agregasyonu filmlerde oluşur spektrumları arsa görünür.
Sıkıca yapıştırır yükseldiLazer ışını üzerine bağırsak (Şekil 2) 0,9 başarısızlığı tipik bir maksimum yük ± 0.4 N (n = 30) elde. Yapışma gücü yapışkan yüzey alanı, yani, 15 ile bölünmüş maksimum yük ± 6 kPa'dan (n = 30) olarak tahmin edilmiştir. Işınlanmamış gül yapışkan doku daha az bağlı (2 ± 2 kPa, n = 30, eşleştirilmemiş t-testi, p <10 6). Tibial sinirin in-vivo anastomoz başarılı bir şekilde yeşil lazer ile bağlantılı olarak gül yapıştırıcı uygulanması ve ardından bağ elde edildi. Bir hafta ameliyat sonrası, ameliyat sinir süreklilik ve onarım gücü 17 ± 9 kPa (n = 10).
Şekil 1. A) RB-kitosan çözeltisinin düz perspex levha (levha kalınlığı ~ 5 mm) dökülmektedir. Grafik kağıt kuru dökme adım kolaylaştırmak için levha altına yerleştirilir. Suda çözünmeyen film iki hafta içinde dökümden sonra elde edilir. B) gül yapışkanlı esnek ve küçük bir silindir içine yuvarlandı olabilir.
Şekil 2. Gül yapışkanlı lazer ışınlama sonrası baldır bağırsak yapıştırılır. Düzgün ışınlama doku yapışma sırasında RB yapışkan uygulanır, ancak seçilen lekeler üzerinde yapışkan lazer foto-ağartma etkisini göstermek için bu resim gösterilir.
Şekil 3,. Gül yapışkanın emilme tayfı (isteğe bağlı olarak birim) 530 ve 562 nm 'de iki adet tepe noktası gösterir. Yeşil lazer (λ = 532 nm) ve böylece güçlü bir lazer pozlama sırasında yapıştırıcı ile emilir. RB olmadan kitosan yapışkan zayıf lazer ışını emer.
| n | Güç (W) | Süre (s) | Fluence (J / cm 2) | I (W / cm 2) | Maksimum Yük / Alan (kPa) | ||
| Yapıştırıcı + Lazer | 30 | 60 ± 10 | 0.18 ± 0.03 | 365 ± 5 | ~ 110 | ~ 0.9 | 15 ± 1 |
| Yapıştırıcı | 30 | 60 ± 10 | NA | NA | NA | NA | 2 ± 2 |
Tablo 1. Efsanesi. n, örneklem sayısı; Alan, gül yapışkanlı (± maksimum ortalama hata) yüzey alanı; Güç, lazer güç (± maksimum ortalama hata); Zaman, ışınlama süresi (± maksimum ortalama hata); Fluence, ortalama laser akısının, ben, tahmini ırradiance; Maksimum Yük / Alan, yapışkan yüzey alanına bölünmesiyle tamir dokusunun yetersizliği maksimum yük, (± SE) idi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Asidik pH RB dağılmasından uzamış kitosan çözeltisi karıştırma gerektirir ama yapıştırıcı imalatı, basit bir kuru-dökme işlemi dayanmaktadır yükseldi. Bu bir suda çözünmeyen filmi haline gelene kadar çözüm kadar kuruması için önemlidir. Ağırlık su içeriği kurutulmuş film 6 içinde ~% 10 olduğu zaman meydana gelir. Çözünmeyen filmler genellikle sıcaklık ve basınç (~ 25 ° C ve ~ 1 atm), standart şartlar az 2 hafta kuru döküm sonra elde edilir. Bunun için lazer sağlayan komşu dokuya yapıştırıcıdan RB yayılır, doku arabirimindeki verimli bir foto-aktive olduğu gözlenmiş olmasına rağmen doku yapıştırma mekanizması henüz açık değildir. Bu singlet oksijen üretme RB yeteneği, ışık ışınlama üzerine, kendi amino grupları 7,8 ile çapraz doku kollajen ve kitosan rol oynayabileceği düşünülmektedir olabilir. Gül yapıştırıcı üzerine yeni bir çalışma maksimum sıcaklık tis sırasında elde olduğunu da gösterdisue-yapıştırma bir fotokimyasal proses 4 hipotezini destekleyen, ~ 32 ° C idi. Doku tamiri için diğer sütürsüz teknikler anda birkaç araştırma grubu tarafından incelenmiştir. Örneğin Lazer doku kaynağı (LTW) başarıyla Pini ve ark tarafından 9 oftalmik cerrahi uygulanmıştır. Doku sıcaklığı lazer ışınlama esnasında 65-75 ° C ulaşabilir gibi genel olsa da, LTW teminat termal hasara neden olabilir. Cyanoacrylate yapıştırıcılar da yerine sütür cilt yaraları kapatmak için klinik uygulanır; yine de genellikle toksisite 10 nedeniyle iç organ tamiri için kullanılmaz. Gül yapışkanlı (~ 15 kPa) fibrin yapıştırıcılar daha yüksek yapıştırma gücü (~ 8 kPa) 11 olmasına karşın siyanoakrilat yapıştırıcılar hala güçlü yapışma (~ 150 kPa) 12 verin. Gül yapıştırıcı kalınlığı imalat sırasında özel bir dikkat gerektirir: kalın bir yapıştırıcı (≥ 20 um), örneğin, lazer önleyecekdoku arayüzü ulaşan ve rose bengal ile lazer aşırı emilimi nedeniyle yapışma gücü zayıflatacak gelen. Ince bir yapıştırıcı (<10 mikron), diğer yandan, yapışkan doku arayüzü lazer ışınım ve akıcılık artacaktır. Bununla birlikte, dikkat lazer ışınlama sırasında derinin aşırı ısınmasını önlemek için, film kalınlığının azaltılması alınmalıdır. Gül yapışkanlı insan fibroblastlar 4 üzerinde önemli sitotoksik etkilere neden olur ve böylece bu tür bağırsak ve periferik sinirleri gibi, vücut içindeki yumuşak doku onarımında umut verici bir kullanımı vardır. Bu yapışkan aynı zamanda doku mühendisliği uygulamalara sahip olabilir: Bu doku onarımı ve dikişler 13 yardımı olmadan bir yara iyileşmesini geliştirmek için hücre dışı matrisler ile bir bandaj olarak, örneğin, entegre edilebilir. Biz bu işlem ile ilişkili iltihaplanma lokalize dahil olmak üzere herhangi bir önemli olumsuz etkiler, gözlenmemiştir olduğu not edilmelidir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Çıkar çatışması ilan etti.
Acknowledgments
Bu çalışma UWS Araştırma Bursu ile desteklenmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Rose Bengal | Sigma-Aldrich | 632-69-9 | |
| Chitosan (medium MW) | Sigma-Aldrich | 10318AJ | |
| Glacial acetic acid | Sigma-Aldrich | 08050051 | 2% v/v in DI water |
| Magnetic stirrer | Heidolph | MR Hei-Mix S | |
| Centrifuge | Beckman Coulter Inc. | Allegra X-12R | |
| Spectrophotometer | Varian Inc., Agilent | Cary 4000 UV-Visible | |
| Laser | CNI Laser | MGL-532 | |
| Micrometer | Mitutoyo | Series 227 | |
| Surgical microscope | Carl Zeiss, Inc. | OPMI |
References
- O'Neill, A. C., Winograd, J. M. Microvascular anastomosis using a photochemical tissue bonding technique. Lasers Surg. Med. 39, 716-722 (2007).
- Yao, M., Yaroslavsky, A. Phototoxicity is not associated with photochemical tissue bonding of skin. Lasers Surg. Med. 42, 123-131 (2010).
- Lauto, A., Mawad, D. Photochemical Tissue Bonding with Chitosan Adhesive Films. Biomedical Engineering OnLine. 9, 47 (2010).
- Chan, B. P., Kochevar, I. E. Enhancement of porcine skin graft adherence using a light-activated process. J. Surg. Res. 108, 77-84 (2002).
- Lauto, A., Faster, L. J. Sutureless nerve repair with laser-activated chitosan adhesive: a pilot in vivo study. Photomed. Laser Surg. 26, 227-234 (2008).
- Lauto, A., Hook, J. Chitosan adhesive for laser tissue repair: in vitro characterization. Lasers Surg. Med. 36, 193-201 (2005).
- Au, V., Madison, S. A. Effects of singlet oxygen on the extracellular matrix protein collagen: oxidation of the collagen crosslink histidinohydroxylysinonorleucine and histidine. Arch. Biochem. Biophys. 384, 133-142 (2000).
- Encinas, M. V., Rufs, A. M. Xanthene dyes/amine as photoinitiators of radical polymerization: A comparative and photochemical study in aqueous medium. Polymer. 13, 2762-2767 (2009).
- Pini, R., Rossi, F. A new technique for the closure of the lens capsule by laser welding. Ophtalmic Surgery Lasers & Imaging. 39, 260-2626 (2008).
- Wieken, K., Angioi-Duprez, K., Lim, A. Nerve anastomosis with glue: comparative histologic study of fibrin and cyanoacrylate glue. J. Reconstr. Microsurg. 19, 17-20 (2003).
- Menovsky, T., Beek, J. F. Laser, fibrin glue, or suture repair of peripheral nerves: a comparative functional, histological, and morphometric study in the rat sciatic nerve. J. Neurosurg. 95, 694-699 (2001).
- García, P., Jorge, H. E. Comparative study of the mechanical behavior of a cyanoacrylate and a bioadhesive. J. Mater. Sci. Mater. Med. 15, 109-115 (2004).
- Lauto, A. Integration of extracellular matrix with chitosan adhesive film for sutureless tissue fixation. Lasers Surg. Med. 41, 366-371 (2009).
