Summary
缝线在手术过程中，通常需要修复组织。然而，它们的应用可能是有问题的，因为它们是侵入性的，并且可能会损坏组织。新的组织粘合剂的制备及应用方法，在这里报道。该粘合膜的激光激活的，并且不需要使用缝线。
Abstract
光化学组织结合（PTB）是一种无缝合的组织修复的技术，这是实现通过施加一个解决办法，玫瑰红（RB）之间的两个组织的边缘1,2。然后这些被选择性地吸收由RB通过激光照射。据说所得的光化学反应交联，在组织中的胶原纤维与最小的热量生产3。在这份报告中，RB已成立于薄的壳聚糖膜制造一个新的组织粘合剂，是激光激活。基于脱乙酰壳多糖和含有〜0.1％（重量）RB，粘接膜，制造和粘接小牛肠和大鼠胫神经由固态激光器（λ= 532nm的，注量〜110焦耳/厘米2，光斑大小〜0.5厘米） 。一个单一的列的张力计，与个人计算机连接，用于测试的接合强度。 RB-壳聚糖粘合剂粘合牢固，肠强度为15±6千帕（N = 30）。的粘接强度下降到2＆plusmn; 2千帕（= 30）时，激光不施加到粘合剂。胫神经的吻合，也可以不使用的缝合线的情况下完成。一种新型的壳聚糖胶粘剂已债券光化学组织制造的，不需要缝合。
Protocol
1。壳聚糖黏胶剂
- 脱乙酰壳多糖粉末溶解在乙酸溶液中，用于制备乙酸2％（体积/体积）的储备液，添加10毫升冰醋酸的490毫升去离子水（DI-H 2 O）。
- 如果在孟加拉玫瑰红（RB）在乙酸（0.01％重量/体积）的储备液的制备中，称量5毫克的RB的小瓶中，用铝箔包裹，以避免光漂白。 DI-H 2 O中加入0.5 ml溶解的粉末，然后加49.5毫升的醋酸原液（详见第1.1节）。
- 为了制备脱乙酰壳多糖溶液（1.7％w / v的），重0.85克脱乙酰壳多糖粉末（中等分子量，85％的乙酰化度），并加至50毫升的RB乙酸溶液。制备脱乙酰壳多糖溶解在乙酸溶液中没有RB的控制。
- 加入磁力搅拌器的脱乙酰壳多糖的混合物，并在室温下搅拌。为了确保各组成部分的完全溶解，搅拌几丁聚糖乙酸+ RB两星期和壳聚糖在乙酸中5天（对照组）。当壳聚糖溶解，溶液的pH值增加〜2.6〜3.9。请注意，RB是难溶的，在酸性pH值，而且它需要在溶液的pH值的增加和扩展的搅拌时间以溶解。
- 离心机的解决方案，在3270×g离心1小时，并收集上清液，使用，例如，一个无菌的10毫升注射器。确保不打扰杂质颗粒。在此步骤中，将溶液从宏观的杂质和不溶性物质清洗。
- （离心）壳聚糖溶液注入一个的平板perpex板使用无菌注射器。干燥后的膜的厚度取决于所分配的量的溶液，并超过该溶液扩散的表面积之间的比值。确保该解决方案是无气泡，均匀地涂在板。 〜13微米厚度的薄膜，注入1毫升溶液超过12厘米的表面面积（尺寸〜3×4厘米， 图1A）。
- 量，制成铝箔例如，带有屏幕的有机玻璃板坯的解决方案，以避免光漂白。确保足够的空气流通，保证干燥的解决方案，在屏幕上。
- 发布的溶液在室温下（25℃）和压力（1个大气压），直到干燥，将所得的膜是不溶于水和不膨胀宏观。这通常是在2个星期。
- 谨慎使用一个薄和平面抹刀分离的影片，这些影片的有机玻璃板可以很容易地剥离而不损坏它们。
- 测量的膜的厚度，使用测微计。
- 长方形的胶粘剂用干净锋利的剪刀剪下，并把他们之间的无菌载玻片上，以保持其平面形状。包裹在铝箔滑动遮光，并将其储存在室温下。标签的粘合剂，带或不带包“玫瑰胶”或“壳聚糖adhes香港专业教育学院“。
- 上升的粘接膜，可以用乙醇（90％）或伽马辐射（0.1千戈瑞/ h的24小时）4,5消毒。
2。粘合型光学衰减
- 石英比色皿内固定的玫瑰粘合剂。
- 记录其衰减的频谱，在400 - 800nm 的使用双光束分光光度计4的范围内。
- 假设的有效性Beer定律，计算的粘接剂的衰减长度如下：I = I 0 电子Ax的其中 I 0是入射光强度，1 / A是的衰减长度，和x是膜的厚度。
- 重复步骤2.1至2.3的壳聚糖胶粘剂作为对照。
3。 在体外应用程序：激光对生物组织焊接的小肠
- 收获小牛肠后，立即动物安乐死并储存于-80°C。
- 在使用之前，除霜和水合物的TIssue浸渍DI-H 2 O中的10分钟。
- 平分组织成在手术显微镜（×10）下使用＃10叶片的部分（2×1厘米）。使用DI-H 2 O的部分保持湿润
- 带来的切口树桩，并拢（端到端）。擦拭多余的水分从表面采用纯棉提示。
- 与microforceps与肠道内（ 图2）确保充分的接触，将玫瑰跨越切口浆膜层上的粘合带（10×6毫米）。
- 玫瑰粘合剂的组织粘附性的被激活的二极管泵浦的固态激光器，它被耦合到多模光纤（芯直径200微米）4。
- 设置到第180毫瓦的激光的功率电平，并照射的粘接剂〜6分钟〜5毫米的束斑大小，使用在表1中列出的参数。现货照射的粘合剂，确保〜5秒前束移动到相邻的点，每个点的照射。 Ţ他的程序保证，在激光束扫描的整个表面区域的粘接剂数次。
- 为了评估的组织粘结强度，到一个经过校准的单柱张力（英斯特朗，MA，USA）使用机械夹具夹紧试样。将掌握在22毫米/分钟，直到两个组织的树桩单独的4。
- 放置在步骤3.5中所描述的组织上的玫瑰粘接剂。不要照射样品，测量组织的接合强度，如在步骤3.8所述。样本作为对照。
（4） 在体内应用：胫骨神经吻合术
- 稳重的Wistar大鼠异氟醚/ O 2混合物（4％，2％，此后在诱导）5。皮下注入Buprenex（0.03毫克/千克）提供手术镇痛活性，并减轻可能出现的疼痛或不适。
- 应在手术显微镜（×10）下进行以下的外科手术。斜皮肤切开约3厘米长在后背成的右大腿外侧部和暴露胫骨神经与肌肉分离的办法，通过臀肌2。
- 部分解剖和胫神经外膜采用直板微剪刀修剪，用无菌纱布或棉花提示，并吸收多余的水分。
- 微型剪刀切割胫神经。
- 放置一个无菌壳聚糖条（尺寸为5×4毫米）使用微镊子下方的胫骨神经。
- 约神经树桩端至端的微型镊子在玫瑰粘合带。
- 带钢完全附着到神经形成的轴环，它可以协助的带状激光照射期间与旋转的神经。
- 激活玫瑰粘合剂用激光中描述的步骤3.6）和3.7）。
- 修剪多余的玫瑰胶粘剂的衣领手术的神经。
- 关闭的肌肉和皮肤与5 3-0缝合线5。 标准的手术后恢复应遵循的程序，包括日常检查，开裂或脓液形成和镇痛药，如果需要的话。
5。代表性的成果
所得到的薄膜是在色彩明亮的上升，超薄，具有光滑的表面（ 图1）。他们也很灵活，可以卷成小直径管，而不会造成破损或任何其他明显的损伤（ 图1B）。玫瑰粘合剂具有两个吸收峰，在530和562 nm的绿色激光，因此强烈地吸收在532 nm处的粘接剂和相应的衰减长度为〜12微米（ 图3）。相反，壳聚糖，薄膜没有RB衰减弱激光（1 / A〜162微米），可能是由于散射。从光谱图，没有显着的聚集RB出现在电影中。
玫瑰粘合剂粘合牢固激光照射后的肠道达到破坏时的一个典型的最大负载为0.9±0.4 N组（n = 30）（ 图2）。的粘合强度，估计作为除以由粘接剂的表面面积，即，15±6 kPa组（n = 30）的最大负载。非照射玫瑰粘合剂粘合显着少到组织（2±2千帕，n = 30的非配对t检验p <10 6）。成功地实现了连同绿色激光的应用程序和玫瑰粘合剂粘接后的被检体内的胫神经吻合。术后1周，手术神经连续性和维修强度为17±9千帕（N = 10）。
图1：A）RB-壳聚糖溶液浇铸在平坦的有机玻璃板（楼板厚度约5毫米）。绘图纸被置于下面的板坯，以促进干铸工序。水不溶性fILM是两个星期后铸造。 B）玫瑰胶是灵活的，可以卷成小圆筒。
图2。玫瑰粘接剂粘接到激光照射后的小牛肠。上施加均匀的照射组织接合过程中的RB粘合剂，但是选择的点在这张图片中所示，来说明上的粘接剂的激光光漂白效果。
图3。玫瑰粘合剂的吸收光谱（在任意单位中）显示了在530和562 nm处的两个峰。从而强烈地吸收由激光曝光过程中的粘接剂的绿色激光器（λ= 532nm）的。壳聚糖粘合剂没有RB吸收不佳的激光束。
| Ň | 功率（W） | 时间（s） | 能量密度（J /厘米2） | I（瓦/厘米2） | 最大负荷/面积（千帕） | ||
| 胶+激光 | 30 | 60±10 | 0.18±0.03 | 365±5 | 〜110 | 〜0.9 | 15±1 |
| 胶粘剂 | 30 | 60±10 | NA | NA | NA | NA | 2±2 |
表1。传奇。 N，样本数;面积，玫瑰（平均±最大误差）粘合剂的表面面积;功率，激光功率（平均±最大误差）;时间，照射时间（平均±最大误差）;注量，平均激光能量密度，我，预计内部收益率adiance;最大负荷/地区，在故障修复组织的粘合剂表面面积除以最大负载，（平均值±SE）。
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Discussion
玫瑰粘合剂制造是基于干铸在一个简单的过程，但在酸性pH条件下，需要延长的RB的溶解的脱乙酰壳多糖溶液中搅拌。这是重要的，让溶液干涸，直到它成为一个水不溶性膜。这种情况发生时的重量的水的含量为〜10％，在干燥的膜6。不溶性的膜通常是获得干铸造后2个星期，在标准条件下的温度和压力（〜25℃，1个大气压）。组织接合的机理尚未完全清楚，但有人指出，RB扩散从进入相邻组织的粘接剂，使激光至照片激活它有效地在组织界面。可以推测，RB产生单线态氧的能力，光照射时，可能会通过氨基7,8发挥作用，交联组织胶原和壳聚糖。最近的玫瑰胶粘剂的研究也显示，在TIS达到的最高温度起诉的粘接〜32°C，支持这一假设的一个光化学过程4。其他组织修复的无缝合技术的几个研究小组目前正在调查。例如激光组织焊接（LTW）已成功地应用于眼科手术皮尼等[9]。虽然一般，LTW可以使抵押物的热损伤组织激光照射时温度可达到65-75℃。氰基丙烯酸酯胶应用于临床，而不是缝合关闭皮肤伤口，但他们一般不用于内部器官修复由于其毒性10。虽然玫瑰胶（〜15千帕）具有较高的粘接强度高于纤维蛋白胶（约8千帕）11日 ，氰基丙烯酸酯胶仍然提供了强大的附着力（150千帕）12。玫瑰粘合剂的厚度在制造过程中，需要特别注意：（≥20微米）厚的粘接剂，例如，防止激光从达到的组织界面，并会削弱的接合强度因过度吸收的激光由玫瑰红。的薄的粘接剂（<10微米）上，另一方面，将增加的激光辐照度和能量密度，在粘接剂的组织界面。但是，应考虑在减少膜的厚度，在激光照射期间，以防止过度加热的组织。玫瑰粘合剂不会产生明显的细胞毒作用，对人体成纤维细胞4，并有一个有希望的应用，如肠和外周神经在身体内的软组织修复。该粘接剂还可以具有在组织工程中的应用程序：它可以集成，例如，与细胞外基质中的绷带修复组织和促进伤口愈合，而不借助于缝线13。应该注意的是，我们还没有观察到任何显著的不利影响，包括局部炎症，与此程序相关。
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Disclosures
没有利益冲突的声明。
Acknowledgments
支持这项工作是由西悉尼大学研究资助。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Rose Bengal | Sigma-Aldrich | 632-69-9 | |
| Chitosan (medium MW) | Sigma-Aldrich | 10318AJ | |
| Glacial acetic acid | Sigma-Aldrich | 08050051 | 2% v/v in DI water |
| Magnetic stirrer | Heidolph | MR Hei-Mix S | |
| Centrifuge | Beckman Coulter Inc. | Allegra X-12R | |
| Spectrophotometer | Varian Inc., Agilent | Cary 4000 UV-Visible | |
| Laser | CNI Laser | MGL-532 | |
| Micrometer | Mitutoyo | Series 227 | |
| Surgical microscope | Carl Zeiss, Inc. | OPMI |
References
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