Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Количественные оценки миграции клеток в Phagokinetic анализа подвижности трек

Published: December 4, 2012 doi: 10.3791/4165
Automatic Translation
1,2, 3, 1,2, 1,2, 1,2,4
1Department of Microbiology and Immunology, Louisiana State University Health Sciences Center, 2Center for Molecular and Tumor Virology, Louisiana State University Health Sciences Center, 3Department of Microbiology and Immunology, SUNY Upstate Medical University, 4Feist-Weiller Cancer Center, Louisiana State University Health Sciences Center

Summary

Phagokinetic анализа трек подвижности является метод, используемый для оценки движения клеток. В частности, анализ мер хемокинез (случайный подвижность клеток) с течением времени в количественном выражении. Анализ использует способность клеток для создания измеримых отслеживать их движение на коллоидное золото покрытием покровные.

Protocol

1. Подготовка желатин покрытием Покровные

  1. Место кислотно-промытый покровные стекла (15 мм в диаметре) в стерильный пластиковый 100 мм блюдо (а). Поместите 8-9 покровных на блюдо и убедиться, что они не соприкасаются друг с другом или сторон блюдо ..

Примечание: Покровные стекла, иглы и пинцет должны быть стерильными, чтобы устранить возможные загрязнения микроорганизмами, а также эндотоксины, которые будут влиять клеточных функций, в том числе подвижности.

  1. Взвешивание порошка желатина и ресуспендируют порошка в деионизованной воды, чтобы сделать раствор желатина с конечной концентрации 0,5 г/300 мл. Затем раствор желатина должно быть в автоклаве.
  2. Пипетки 2-3 капли желатина (~ 100-150 мл) на каждую покровное.

Примечание: Будьте осторожны, чтобы не допустить желатин прикоснуться к блюду, или вы не сможете удалить покровные от тарелки.

    Выпекать желатин покрытием покровные в 100 мм блюдо в духовке при температуре 90 ° С в течение 10 мин.
  1. Удалите излишки желатина осторожным пипетированием.
  2. Сухие покровные в 100 мм блюдо в духовке при температуре 70 ° C в течение 45 мин.
  3. После высыхания, удалите покровные от 100 мм блюдо, используя стерильный, без эндотоксина иглы и пинцет (иглой, чтобы мягко подтолкнуть вверх покровное, чтобы сделать его доступным для пинцетом аккуратно удалить).
  4. Поместите отдельные желатин покрытием покровные на отдельные лунки 24-луночных блюдо.

2. Подготовка коллоидного золота покрытием Покровные

  1. Взвесьте необходимое количество chloroauric кислоты (tetrachloroauric тригидрат кислоты; HAuCl 4 · 3H 2 O), а затем ресуспендируют в стерильной деионизированной воды подготовить окончательный 14,5 мм раствор (токсичных). Подготовка 1,5 мл раствора на 8-9 покровные.

Внимание: Chloroauric кислота чохапку при проглатывании, вызывает сильные ожоги кожи и повреждения глаз и может вызвать аллергические реакции кожи. Токсичен при проглатывании.

  1. Взвесьте необходимое количество цитрата натрия (тринатрия дигидрофосфат 2-гидроксипропан-1 ,2,3-tricarboxylate; Na 3 C 6 H 5 O 7), а затем ресуспендируют порошка в деионизованной воды, чтобы сделать окончательные 0,5% раствора. Подготовить 1 мл раствора на 8-9 покровные.

Внимание: цитрат натрия может вызвать раздражение глаз и кожи. Это может также вызвать респираторные и желудочно-кишечного тракта раздражение.

  1. В стерильные, без эндотоксина стакан сочетать 1,5 мл стерильного 14,5 мм HAuCl 4 решения и 13,5 мл стерильной деионизированной воды; результат должны дать слабый раствор желтого цвета. Указанные объемы позволят за 8-9 коллоидного золота покровные быть сделано.
  2. В то время как непрерывно помешивая, нагрейте раствор на горячей плите, пока она не начнет бнефти.

Внимание: нагревание раствора должна быть выполнена в вытяжном шкафу, так как пары могут быть вредными / токсичными. Пары оказывают разрушительное воздействие на ткани слизистых оболочек и верхних дыхательных путей.

  1. Снимите стакан с горячей плите.
  2. При перемешивании добавляют 0,7 мл 0,5% раствора цитрата натрия. Указанные объемы позволят за 8-9 коллоидного золота покровные быть сделано.
  3. Продолжайте размешивать это универсальное решение для примерно 2 минуты (Примечание: цвет раствора будет постепенно меняться от бледно-желтого, очистить, до серого, до фиолетового, до темно-фиолетового, перед тем как достичь красного вина или, предпочтительно, ржавчины цвета) . Данный продукт является вашим коллоидный раствор золота.
  4. Охладить коллоидный раствор золота в 10 мл пипетки в течение 1-2 мин (для того, чтобы сохранить желатиновый слой на покровное от таяния, когда коллоидный раствор золота добавляется), а затем добавить 1.0-2.0 мл colloidaл раствора на золото каждый желатин покрытием покровное ранее размещенных в 24-а блюдо (а) (сумма коллоидный раствор золота, которое вы добавляете в желатин покрытием покровные зависит от того, насколько хорошо частицы золота осаждается в растворе - см. комментарии ниже).

Примечание: Потому что там могут быть изменения в эффективности осаждения частиц золота, рекомендуется сначала добавить 0,5-1 мл коллоидного раствора золота в желатин покрытием покровные, а затем поместить 24-а блюдо в инкубаторе в течение 0,5 ч . После этого инкубационного периода, покровные должны быть проверены под световым микроскопом для соответствующей плотности частиц золота на покровные. См. рисунок 1 для 20x микроскопа изображений примеров слишком низко и слишком высокой концентрации частиц золота. См. Рисунок 2 для 40x изображений микроскопии идеальной концентрацией частиц золота (по крайней мере для использования с моноциты). ОПТмальные плотность наночастиц золота на слайде должны быть определены экспериментально для каждого типа клеток используются, как характеристики различных клеток будет диктовать свои силы движения на покровные. Если концентрация частиц золота недостаточно, добавить дополнительные 0,5-1 мл коллоидного раствора золота в желатин покрытием покровные.

В зависимости от размера ячейки, соответствующей концентрации частиц золота может меняться и, таким образом, в конечном счете, зависят от размера ячейки исследуют на подвижность. Например, в человеческих моноцитов быть малогабаритных клеток (~ 10-20 мкм 28), более высокая концентрация частиц золота было необходимо в нашем анализе. Соответствующее распределение наночастиц золота предоставляет исследователю возможность легко и эффективно различать края сотовых треков. Концентрация частиц золота, которое является слишком высокой затрудняет способность клеток перемещаться и, следовательно, для точного измеренияих подвижности, в то время как концентрация частиц золота, которое является слишком низкие пределы способности человека определять точное трек подвижности.

Важное примечание: Если синтеза наночастиц золота является проблематичным, синтезированные наночастицы золота имеются в продаже в размерах от 5 нм до 400 нм. Кроме того, флуоресцентные микросферы были также использованы в исследованиях клеточной подвижности 29. Тем не менее, использование этих микросфер требует флуоресцентный микроскоп для анализа миграции клеток.

  1. Поместите 24-а блюдо с коллоидным золотом покрытые покровные в инкубаторе при температуре 37 ° C и инкубировать от 1 часа до ночи.
  2. После инкубации промыть / удаления несвязанного золота путем погружения покровные (3x) в стерильные фосфатным буферным раствором (PBS, рН 7,4).
  3. Поместите эти коллоидного золота покрытием покровные в чистую 12-а блюдо (ы), содержащий PBS.
  4. Храните эти покровные при 4 ° С до готовностииспользовать (парафильмом пластины перед размещением в холодильнике).

Важное замечание: Всегда держите коллоидного золота покрытием покровные в некоторый тип жидкости / средства массовой информации, как частицы золота могут отслаиваться от покровных если дают высохнуть. Коллоидного золота покровные должны быть использованы в течение 2-3 месяцев с даты, когда они были сделаны.

Контроль качества: в одном phagokinetic анализа подвижности трек, очень важно использовать покровные, которые характеризуются аналогичной концентрации частиц золота. Эта простая точка позволит количественные различия в клеточной подвижности между образцами, чтобы быть исключительно из-за характера лечения, а не физическими свойствами коллоидного золота покрытием покровные. Мы выступаем с использованием только покровные сделаны в то же время в отдельных экспериментах, хотя мы показали, что до тех пор, как плотность наночастиц золота равны, использование покровныхот различных препаратов является целесообразным.

3. Анализ сотового Подвижность

  1. Поместите коллоидного золота покрытием покровные в соответствующей сотовой СМИ для клеток интерес.
  2. Передача надлежащее лечение клеток на коллоидное золото покрытием покровные помещают в 24-луночный блюдо (а)

Примечание: количество клеток передается в одной скважины должна быть определена для каждого типа клеток изучены. В идеале, клетки должны быть равномерно распределены по коллоидного золота покрытием покровное, которые в свою очередь позволят статистический анализ только треки, созданные на одну ячейку. Если Клетки высевали при слишком высокой концентрации, она становится весьма вероятным, что перекрытие следов нескольких ячеек будет видно. Перекрытие треков не может быть точно количественно и, таким образом, они не могут быть приняты во внимание в окончательном анализе движения проверенных клеток. Перекрытие треков в результатеучастие несколько ячеек, как правило, легко заметить, как объединить или пересек треков (в области анализа), в которых два или более клеток можно наблюдать в той же непрерывной очищенной области.

  1. Инкубировать при 37 ° C / 5% CO 2 в течение 24 ч (или на любое удобное время, например, мы проанализировали моноцитов подвижность между 6 ч и 24 ч после лечения и эндотелиальных клеток в 12 часа после лечения). Оптимальный срок для определения и измерения сотовой подвижность будет варьироваться в зависимости от типа клеток изучены и, таким образом, должны быть определены экспериментально для каждого типа клеток (хорошей отправной точкой, однако, 6 - 12 ч после обработки).

Примечание: Если экспериментальные коллоидного золота покрытием покровные должны храниться и / или проанализированы на более позднее время, клеток и наночастиц золота должны быть закреплены на покровные. Для достижения этой фиксации шаг, следующий шаг 3.3, первой стирки тщательно покровные 2 раза 1xPBS (погружение покровные предпочтительнее, так как удаление наночастиц золота из покровных следует избегать), а затем использовать стандартный метод фиксации клеток, таких как инкубации при комнатной температуре 3% параформальдегидом. После 15-минутной инкубации, 3% параформальдегидом должны быть удалены и покровные тщательно промывают 3 раза 1x PBS. Фиксированные покровные можно хранить в холодильнике.

  1. С помощью светового микроскопа, захват изображения треки, созданные одной движущейся клетке (Примечание: увеличение используется для съемки сотовой треков, безусловно, варьироваться в зависимости от типа клеток под следствием). Примеры сотовой треки, созданные на неподвижных и подвижных клеток на коллоидное золото покрытием покровные показано на рисунке 2.

Примечание: наночастицы золота размером используемых в phagokinetic анализа подвижности трек был найден, чтобы быть полностью нетоксичны для клеток 30. В случае необходимости, Жизнеспособность рассматриваемой клетки могут быть оценены путем окрашивания трипановым синим или рассматриваются другие маркеры клеточной жизнеспособности. Можно было бы принять во внимание необходимость для фиксации, тип фиксации, и т.д., если этот шаг необходимо проделать.

  1. Использование свободно доступного программного обеспечения, таких как ImageJ программного обеспечения ( http://rsbweb.nih.gov/ij/ ) или NIH Image ( http://rsb.info.nih.gov/nih-image/ ), оба разработаны в Национальные Институты Здоровья, или ImageTool ( http://ddsdx.uthscsa.edu/dig/itdesc.html ), разработанная в университете штата Техас здоровья Научного центра в Сан-Антонио, средняя площадь (в условных единицах) коллоидного золота очищается 10-20 или более ячеек (по образцу) определяется для каждой экспериментальной группе из захваченных изображений. Статистика может быть выполнена на тОн собрал результаты. Например, результаты могут быть нанесены как среднее ± стандартная ошибка средствами (SEM) с т тесты Студенческая выполняется, а значение P <0,05 использоваться как мера статистической значимости между образцами. Рисунках 3 и 4 показаны шаги в Анализ области коллоидное золото очищается клетки.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Показанный пример фотографии, сделанные под световым микроскопом показывает трек область очищена одна ячейка (моноцитов из наших экспериментах показано на рисунке 2). Non-подвижных клеток создают характерный небольшие, овальной или круг формы участки вокруг себя указывает на низкий базальный уровень движения для этих стимулированных клеток (рис. 2А и 2В). В отличие от очень подвижных клеток [в нашей системе, цитомегаловируса человека (HCMV)-инфицированные клетки] характеризуется направленное движение показано на рис 2С и 2D, как удлиненные области трека. После получения нескольких изображений пути районах с использованием инвертированного микроскопа с 40x цель, общая площадь дорожки были отмечены использованием ImageJ программного обеспечения (рис. 3); аналогичные результаты могут быть получены с помощью других программ. Мы выступаем за программное обеспечение ImageJ, потому что это бесплатный и простой в использовании. Подвижные клетки не создавать стандартные, геометрической формы треков дюзвонят их движения, таким образом, удобный способ выделить участок для анализа заключается в выборе руки инструмент в программе ImageJ для того, чтобы отметить форму трек создан движущейся клетки (рис. 3). После очерчены дорожки области для анализа, количественного измерения данных осуществляется нажав на кнопку "Анализ" в строке меню ImageJ и выбрав пункт "Мера" из выпадающего меню. Образец наши результаты в условных единицах получены на основе анализа клеточных областей трек собраны из данных, представленных на рисунке 3 показан на рисунке 4а. Результаты, полученные с помощью программного обеспечения ImageJ затем могут быть проанализированы в таблице выбора, чтобы для расчета средней площади дорожки очищены на ячейку, как показано на рисунке 4В.

По нашему опыту, наиболее проблемными шаг протокола является производство коллоидного золота покрытием покровные; вопрос, вызывающий обеспокоенность гeneration из покровных с равномерного покрытия наночастиц золота (вопросы, связанные с этой озабоченностью обсуждаются в 2,8 выше). Необходимости равномерного покрытия наночастиц золота на coveslip представлена ​​на рисунке 2. Покрытие, которое является слишком плотным (рис. 1А и 1В) или слишком мало (рис. 1С и 1D) будет препятствовать миграции клеток или изменять воспроизводимый анализ размера и формы трека области. Второй ключевой момент, как описано в 3,2 выше, плотность покрытая клетками, а также необходимость предотвращения дублирования или объединить треки из нескольких ячеек.

Рисунок 1
Рисунок 1. Потенциальные проблемы с плотностью коллоидного золота на Покровные. Показано на этом рисунке приведены примеры коллоидного золота покрытием покровные либо слишком высокое (Панели В) или слишком низкой (Панели C и D) плотность наночастиц золота. Оба этих примера приведет к плохой сбор данных и статистический анализ. Примечание: Несоответствие концентрации chloroauric кислоты или цитрата натрия, а также длительном кипячении реакционного раствора, может вызвать эти нежелательные результаты. Представленные фотографии были сделаны с помощью 20x цели. Примечание: Группа D также изображает нежелательно агрегаты наночастиц золота на стекло покровные. Размер бар соответствует 50 мкм в длину.

Рисунок 2
Рисунок 2. Примеры треки, созданные на неподвижные (панели и B) и подвижные (Панели C и D) клеток на коллоидное золото покрытием покровные. Вирус-свободные средства массовой информации (макет-инфицированных) или средах, содержащих вирусные частицы (HCMV-инфицированных), были добавлен в изолированном периферийныхАль моноцитов крови 10,18-22. Моноциты инкубировали при 37 ° C / 5% CO 2 в течение 1 часа, а затем высевали на коллоидное золото покрытием покровные в течение 24 часов при 37 ° C / 5% CO 2. Представленные фотографии были сделаны с помощью 40x цели. Белые стрелки отмечают моноцитов в их окончательном месте. Как мы показали ранее 10,18-22, неинфицированных моноцитов характеризуются низким базальным уровнем подвижности, в то время как HCMV-инфицированные клетки показывают высокие характеристики подвижности. Размер бар соответствует 25 мкм в длину.

Рисунок 3
Рисунок 3. Маркировка зоне покрытия сотовой треков с помощью ImageJ программного обеспечения. Примеры показанные снимки треки, в которых образ программного обеспечения J был использован при анализе следов создан неподвижные (панели и B) и подвижные (Панели C иD) клеток на коллоидное золото покрытием покровные (Примечание: Треки обведены белой линией с помощью инструмента ImageJ руки). Образец фотографии, такие же, как показано на рисунке 2, были использованы в эту цифру для измерения трек областях очищается одну ячейку. Это представитель изображений макетов и HCMV-инфицированных моноцитов, однако, как правило, 10-20 изображения анализируются на образец. Размер бар соответствует 25 мкм в длину.

Рисунок 4
Рисунок 4. Количественные оценки подвижности клеток ImageJ Использование программного обеспечения и электронных таблиц. A) Измеренная областях трек очищается клетки, как показано на образце фотографии (рисунки 2 и 3), с помощью программного обеспечения ImageJ. Результаты расчета # 1, # 2, # 3 и # 4 соответствуют панелей B, C и D на рисунках 2 и 3, соответственно B) графическое представление среднего области (средства;. в условных единицах) очищается клетки и проанализированы с помощью программного обеспечения ImageJ. В этом примере, стандартная ошибка среднего не показано, потому что в примере недостаточное количество дубликатов анализируется. Примечание: Программа ImageJ предоставляет измерять площадь дорожек в условных единицах, поэтому крайне важно, чтобы сравнить фотографии треков взяты под тем же увеличением. Самый простой способ сравнить результаты отдельных экспериментов состоит в сравнении раза изменениях между исследованных образцов.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Phagokinetic анализа подвижности дорожки представленные в этой статье является простой и очень эффективный метод для количественного анализа миграции клеток. Потому что несколько типов клеток могут быть проанализированы 9-17, этот метод имеет потенциал широкого использования нескольких дисциплинах. Использование коллоидного золота покрытием покровные стекла позволяет для измерения трек площадь очищена от движущейся клетке. Анализ может измерить влияние различных раздражителей (т. е. факторы роста, очищенный ECM лигандами, вирусы, бактерии) на подвижность клеток. Кроме того, отсутствие требования о фиксации клеток позволяет для мониторинга миграции клеток в разных экспериментальных точек времени. Кроме того, анализ требуется только стандартный световой микроскоп, стандартные камеры с помощью ПЗС (прибор с зарядовой связью) датчик изображения и свободно доступного программного обеспечения. Таким образом, сложные микроскопы и камеры не нужны, ни специальные программные комплексы. Даже несмотря на задницеай прост по конструкции, это мощный инструмент для статистического изучения моторики несколькими типами клеток под множеством экспериментальных условиях. Например, в связи с этим, анализ может быть использован для эффективного изучения небольшого числа экспериментальных образцов, а также эффективно служить высоким анализа скрининга. Потому что покровные может быть рассмотрен незаписанных, анализ может также позволить для анализа перемещения клеток в течение долгого времени без необходимости микроскоп с закрытой увлажненный, с подогревом CO 2 инкубаторе. Кроме того, phagokinetic анализа подвижности трек может помочь в изучении подвижности клетки не поддаются покадровой обработки изображений, как фотообесцвечивания флуорофора окрашенных клеток меньше беспокойства в коллоидного золота на основе анализа подвижности. Количественная оценка трека области сбрасывается одной ячейки достигается за счет использования в свободном доступе ImageJ программного обеспечения, хотя другие программы могут быть использованы. Кроме того, общий Graphicaл и статистического анализа получены только требуют базовых знаний расчетов, таблиц и статистики.

Следует отметить, что первоначальный метод, описанный использованием бычьего сывороточного альбумина (БСА) для покрытия стекла покровные 9. Тем не менее, использование BSA оказалась ненадежной в качестве агента для обеспечения равномерного золотых коллоидных монослое 27. Замена желатина для BSA, как покрытие покровное, увеличились присоединение наночастиц золота в покровном. Дополнительные изменения, внесенные Скотт и др. 27. Протокола значительно улучшить качество золотого покрытия наночастиц. Тем не менее, мы обнаружили, основанные на Туркевич и др. 23., Что применение цитрата натрия в качестве восстановителя созданы наиболее равномерного монослоя наночастиц золота. Таким образом, мы отдаем предпочтение этому методу и, как таковая, она описана в нашем протоколе.

Для обеспечения ахIgH степени воспроизводимости результатов анализа, важно строго соблюдать объемы и температуры, указанные в протоколе, а отклонения могут сильно влиять на конечные результаты. Как отмечалось выше, одним из технических барьеров в использовании phagokinetic анализа подвижности маршрут включает в себя производство золотых наночастиц в растворе, а затем в получении соответствующей равномерной концентрации наночастиц золота на покровное. Таким образом, хотя золото стадии осаждения наночастиц является воспроизводимым, мы ставим акцент на оценке цвета окончательное решение осажденных наночастиц золота. Кроме того, это наше обоснование только добавить половину нормального объема окончательное решение на каждый покровные и, затем, после 0,5 часа, оценивая плотность и однородность частиц золота на покровные (с возможностью добавления дополнительного решения, если необходимы позже). Эти меры предосторожности, чтобы избежать создания государства, где тОн покровные показывают либо слишком высокое (рис. 1А и 1В) или слишком низкой (рис. 1С и 1D) концентрация наночастиц золота на стекло покровные.

В целом, phagokinetic анализа подвижности трек является простой метод анализа клеточного движения. Это обеспечивает моментальный снимок расстоянии (через окончательный области трека), что клетка перемещается в течение определенного периода времени. Кроме того, анализ очень поддаются нескольких раздражителей, которые, рассмотрев клеток может быть проверена при различных вариантах лечения. Например, в наших экспериментах моноцитов, мы проверили моторику инфицированных вирусом, цитокин-лечить, фактор роста-лечение, митоген-лечение, и лечение LPS-моноцитов. Кроме того, мы проверили эти активированных моноцитов в различных ингибиторов / ингибирующее условия для функционально изучить роль различных биохимических / молекулярных путей, играть в моноцитов подвижность. В отличие от заживления ран анализа 31, measurinга кумулятивный эффект клеточной пролиферации и миграции, или Boyden камеры (транс-а) миграция анализа 32, позволяющий общий анализ подвижности клеток хемотаксиса, phagokinetic анализа подвижности трек оценивает миграции одну ячейку. Однако, если есть необходимость объемный эффект хемотаксиса, подлежащие измерению, трехмерные миграции / Вторжение быть оценены, более детальный анализ клеточного движения, а также анализ клеточного движения в естественных условиях при условиях, этот протокол будет Не хватает и использование дополнительных методологии, такие как транс-и миграции анализа, анализа матригель вторжения 33, живого времени истек микроскопии / 34,35 фотографии и т.д. должны быть рассмотрены.

Phagokinetic анализа подвижности трек является простым, количественные оценки / сравнения способность клеток к миграции без необходимости использования дорогих микроскопы и программы в анализах. Он предназначен для RESEлучников, нуждающихся в быстрой и простой, но надежный, метод количественного подвижность клеток, предлагая возможность простого высокой пропускной способностью анализа.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Нет конфликта интересов объявлены.

Acknowledgments

Эта работа была поддержана грантами от Национального института здоровья (AI050677, HD-051998, и GM103433), Малкольм Feist сердечно-сосудистых исследований в общении и Американской ассоциации сердца predoctoral стипендий (10PRE4200007).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Glass Coverslips (15mm) Fisher Scientific 12-545-83
Gelatin 300 Bloom Sigma-Aldrich G-1890
Tetrachloroauric Acid Trihydrate Fisher Chemical G54-1 14.5 mM (a final working solution)
Sodium Citrate Fisher Scientific BP327-500 0.5% (a final working solution)
Paraformaldehyde Fisher Scientific O4042 3% (a final working solution)
100 mm Tissue Culture Dish Sarstedt 83.1802
12-Well Plates Fisher Scientific 08-772-29
24-Well Plates Fisher Scientific 07-200-84
Techne Oven Hybridiser HB-1D LabPlanet 2040500 The standard laboratory oven will suffice
10 ml Serological Pipettes Sarstedt 86.1254.001
Pipet-Aid Filler/Dispenser Drummond 13-681-15
P200 Single-Channel Manual Pipette Rainin PR-200
200 ml Barrier Tips CLP BT200
ImageJ software http://rsb.info.nih.gov/ij/ License: Public Domain
Nikon Eclipse TE300 with a photometrics CoolSNAPfx monochrome 12-bit CCD camera Nikon Discontinued; The most comparable specification has Nikon Eclipse Ti, but a lower end Nikon 80i will be suitable as well. Other brands also provide comparable microscopes.
Note: The reagents and equipment listed below have been utilized by us in our various studies. Other supplies, suppliers, reagents, and equipment can be used, as long as they have similar specifications.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Armstrong, P. B. The control of cell motility during embryogenesis. Cancer Metastasis Rev. 4, 59-79 (1985).
  2. Dustin, M. L. Stop and go traffic to tune T cell responses. Immunity. 21, 305-314 (2004).
  3. Mutsaers, S. E., Bishop, J. E., McGrouther, G., Laurent, G. J. Mechanisms of tissue repair: from wound healing to fibrosis. Int. J. Biochem. Cell Biol. 29, 5-17 (1997).
  4. Etienne-Manneville, S. Polarity proteins in migration and invasion. Oncogene. 27, 6970-6980 (2008).
  5. Parsons, J. T., Horwitz, A. R., Schwartz, M. A. Cell adhesion: integrating cytoskeletal dynamics and cellular tension. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 11, 633-643 (2010).
  6. Mitchison, T. J., Cramer, L. P. Actin-based cell motility and cell locomotion. Cell. 84, 371-379 (1996).
  7. Pollard, T. D., Borisy, G. G. Cellular motility driven by assembly and disassembly of actin filaments. Cell. 112, 453-465 (2003).
  8. Bretscher, M. S. Getting membrane flow and the cytoskeleton to cooperate in moving cells. Cell. 87, 601-606 (1996).
  9. Albrecht-Buehler, G. The phagokinetic tracks of 3T3 cells. Cell. 11, 395-404 (1977).
  10. Smith, M. S., Bentz, G. L., Alexander, J. S., Yurochko, A. D. Human cytomegalovirus induces monocyte differentiation and migration as a strategy for dissemination and persistence. J. Virol. 78, 4444-4453 (2004).
  11. Palmisano, R., Itoh, Y. Matrix Metalloproteinase Protocols. Methods in Molecular Biology. 622, Humana Press. 379-392 (2010).
  12. Ohta, H., et al. HOXD3-Overexpression Increases Integrin Alpha V Beta 3 Expression and Deprives E-Cadherin while It Enhances Cell Motility in A549 Cells. Clinical and Experimental Metastasis. 7-8, 381-390 (2006).
  13. Kawa, S., Kimura, S., Hakomori, S., Igarashi, Y. Inhibition of chemotactic motility and trans-endothelial migration of human neutrophils by sphingosine 1-phosphate. FEBS Lett. 420, 196-200 (1997).
  14. Kawamura, K., et al. N-WASP and WAVE2 acting downstream of phosphatidylinositol 3-kinase are required for myogenic cell migration induced by hepatocyte growth factor. J. Biol. Chem. 279, 54862-54871 (2004).
  15. Ando, Y., Jensen, P. J. Epidermal growth factor and insulin-like growth factor I enhance keratinocyte migration. J. Invest. Dermatol. 100, 633-639 (1993).
  16. Todt, J. C., et al. Effects of tumor necrosis factor-alpha on human trophoblast cell adhesion and motility. Am. J. Reprod. Immunol. 36, 65-71 (1996).
  17. McAuslan, B. R., Reilly, W. Endothelial cell phagokinesis in response to specific metal ions. Exp. Cell. Res. 130, 147-157 (1980).
  18. Smith, M. S., Bentz, G. L., Smith, P. M., Bivins, E. R., Yurochko, A. D. HCMV activates PI(3)K in monocytes and promotes monocyte motility and transendothelial migration in a PI(3)K-dependent manner. J. Leukoc. Biol. 76 (3), 65-76 (2004).
  19. Smith, M. S., et al. Roles of phosphatidylinositol 3-kinase and NF-kappaB in human cytomegalovirus-mediated monocyte diapedesis and adhesion: strategy for viral persistence. J. Virol. 81, 7683-7694 (2007).
  20. Bentz, G. L., Yurochko, A. D. Human CMV infection of endothelial cells induces an angiogenic response through viral binding to EGF receptor and beta1 and beta3 integrins. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 5531-5536 (2008).
  21. Chan, G., Nogalski, M. T., Yurochko, A. D. Activation of EGFR on monocytes is required for human cytomegalovirus entry and mediates cellular motility. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106, 22369-22374 (2009).
  22. Nogalski, M. T., Chan, G., Stevenson, E. V., Gray, S., Yurochko, A. D. HCMV-Regulated Paxillin in Monocytes Links Cellular Pathogenic Motility to the Process of Viral Entry. J. Virol. 85, 1360-1369 (2011).
  23. Turkevich, J. A study of the nucleation and growth processes in the synthesis of colloidal gold. Discuss. Faraday. Soc. 11, 55-75 (1951).
  24. Frens, G. Particle size and sol stability in mental colloids. Colloid & Polymer Science. 250, 736-741 (1972).
  25. Frens, G. Controlled nucleation for the regulation of the particle size in monodisperse gold suspensions. Phys. Sci. 241, 20-22 (1973).
  26. Zetter, B. R. Assay of capillary endothelial cell migration. Methods Enzymol. 147, 135-144 (1987).
  27. Scott, W. N., McCool, K., Nelson, J. Improved method for the production of gold colloid monolayers for use in the phagokinetic track assay for cell motility. Anal. Biochem. 287, 343-344 (2000).
  28. Wang, S. Y., Mak, K. L., Chen, L. Y., Chou, M. P., Ho, C. K. Heterogeneity of human blood monocyte: two subpopulations with different sizes, phenotypes and functions. Immunology. 77, 298-303 (1992).
  29. Windler-Hart, S. L., Chen, K. Y., Chenn, A. A cell behavior screen: identification, sorting, and enrichment of cells based on motility. BMC Cell Biol. 6, 14 (2005).
  30. Pan, Y., et al. Size-dependent cytotoxicity of gold nanoparticles. Small. 3, 1941-1949 (2007).
  31. Rodriguez, L. G., Wu, X., Guan, J. L. Wound-healing assay. Methods Mol. Biol. 294, 23-29 (2005).
  32. Boyden, S. The chemotactic effect of mixtures of antibody and antigen on polymorphonuclear leucocytes. J. Exp. Med. 115, 453-466 (1962).
  33. Brooks, D. M., Brooks, S. A. In Vitro Invasion Assay Using Matrigel(R). Methods Mol. Med. 58, 61-70 (2001).
  34. Kuo, J. C., Wang, W. J., Yao, C. C., Wu, P. R., Chen, R. H. The tumor suppressor DAPK inhibits cell motility by blocking the integrin-mediated polarity pathway. J. Cell Biol. 172, 619-631 (2006).
  35. Benazeraf, B., et al. A random cell motility gradient downstream of FGF controls elongation of an amniote embryo. Nature. 466, 248-252 (2010).

Tags

Иммунологии выпуск 70 микробиологии клеточной биологии молекулярной биологии наночастицы золота покровные миграция клеток количественное движение клетки микроскопия подвижность анализ
Количественные оценки миграции клеток в Phagokinetic анализа подвижности трек
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Nogalski, M. T., Chan, G. C. T.,… More

Nogalski, M. T., Chan, G. C. T., Stevenson, E. V., Collins-McMillen, D. K., Yurochko, A. D. A Quantitative Evaluation of Cell Migration by the Phagokinetic Track Motility Assay. J. Vis. Exp. (70), e4165, doi:10.3791/4165 (2012).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter