Summary
Den phagokinetic motilitet spåret analysen är en metod som används för att bedöma rörlighet celler. Specifikt mäter analysen kemokines (slumpvis cellmotilitet) över tid i ett kvantitativt sätt. Analysen utnyttjar förmågan hos celler att skapa en mätbar spår av deras rörelse på kolloidala guld-belagda täckglas.
Abstract
Cellulär motilitet är en viktig biologisk process för både encelliga och flercelliga organismer. Det är viktigt för förflyttning av encelliga organismer till en källa av näringsämnen eller bort från olämpliga förhållanden samt i flercelliga organismer för mjukpapper utveckling, immunförsvaret övervakning och sårläkning, bara för att nämna några roller 1,2,3. Avregleringen av denna process kan leda till allvarliga neurologiska, kardiovaskulära och immunologiska sjukdomar samt förvärras tumörbildning och sprida 4,5. Molekylärt har aktinpolymerisering och receptor återvinning visats spela viktiga roller i att skapa cellulära förlängningar (lamellipodia), som driver den framåtgående rörelsen av cellen 6,7,8. Men många biologiska frågor om cellmigration förblir obesvarade.
Den centrala roll cellulär motilitet i människors hälsa och sjukdomar understryker vikten av att förstå den specifika MEChanisms involverade i denna process och gör noggranna metoder för att utvärdera cellmotiliteten särskilt viktig. Mikroskop används vanligen för att visualisera rörelse av celler. Men cellerna rör sig ganska långsamt, vilket gör kvantitativ mätning av cellmigration en resurskrävande process som kräver dyra kameror och programvara för att skapa kvantitativa tid löpt filmer av rörliga celler. Därför är förmågan att utföra en kvantitativ mätning av cellmigration som är kostnadseffektiv, icke-mödosamma, och som använder gemensam laboratorieutrustning ett stort behov av många forskare.
Den phagokinetic spåret motilitet analys utnyttjar förmågan hos en rörlig cell att rensa guldpartiklar från sin bana för att skapa en mätbar spår på en kolloidalt guld-belagt täckglas 9,10. Med användning av allmänt tillgänglig mjukvara, kan flera spår utvärderas för varje behandling för att åstadkomma statistikkraven. Analysen kan användas för att bedömamotilitet av många celltyper, såsom cancerceller 11,12, fibroblaster 9, neutrofiler 13, skelettmuskelceller 14, keratinocyter 15, 16 trofoblaster, endotelceller 17 och monocyter 10,18-22. Protokollet involverar skapandet av objektglas belagda med guld nanopartiklar (Au °) som genereras av en reduktion av klorguldsyra (Au 3 +) av natriumcitrat. Denna metod har utvecklats av Turkevich et al. Under 1951 23 och därefter förbättrats under 1970-talet av Frens et al. 24,25. Som ett resultat av denna kemiska reduktionssteg, guldpartiklar (10-20 nm i diameter) utfällning från reaktionsblandningen och kan tillämpas på täckglas, som är därefter färdig för användning i cellulära analyser migration 9,26,27.
I allmänhet, är det phagokinetic spåret motilitet analys en snabb, kvantitativ och enkel mätning av cellulär motilitet. Dessutom är detkan användas som en enkel hög genomströmning analys, för användning med celltyper som inte är mottagliga för tid-bortfallit avbildning, liksom andra användningar, beroende på behoven av forskaren. Tillsammans, förmågan att kvantitativt mäta cellulär motilitet av flera celltyper utan behov av dyra mikroskop och programvara, tillsammans med användning av gemensamma laboratorieutrustning och kemikalier, gör phagokinetic spår motilitet test en solid val för forskare med intresse för att förstå cellulära motilitet.
Protocol
1. Framställning av gelatin-belagda Täckglas
- Placera syratvättade täckglas (15 mm i diameter) i en steril plast 100 mm skål (ES). Placera 8-9 täckglas per fat och se till att de inte vidrör varandra eller på sidorna av skålen ..
Obs: täckglas, nålar och pincetter måste vara sterila för att eliminera eventuella kontaminerande mikroorganismer, liksom endotoxiner som påverkar cellulära funktioner, inklusive motilitet.
- Väg gelatinpulver och återsuspendera pulvret i avjoniserat vatten för att göra en gelatinlösning med en slutlig koncentration av 0,5 g/300 ml. Därefter måste gelatinlösningen som skall autoklaveras.
- Pipettera 2-3 droppar av gelatin (~ 100-150 ml) på varje täckglas.
Obs: Var noga med att inte låta gelatinet röra skålen annars kommer du inte att kunna ta bort täckglasen från skålen.
- Baka gelatinbelagda täckglas i 100 mm skål i en ugn vid 90 ° C under 10 minuter.
- Ta bort överflödig gelatin genom försiktig pipettering.
- Torka täckglasen i 100 mm skål i ugnen vid 70 ° C under 45 minuter.
- När torr, ta bort täckglasen från 100 mm skål med en steril endotoxinfritt nål och pincett (nålen används för att försiktigt knuffa upp täckglaset att göra den tillgänglig för pincett för att försiktigt ta bort).
- Placera enskilda gelatinbelagda täckglas till separata brunnar i en 24-brunnars skål.
2. Framställning av kolloidalt guld-belagda Täckglas
- Väg en lämplig mängd klorguldsyra (tetraklorguld syra trihydrat, HAuCl 4 · 3H 2 O) och därefter återsuspendera i sterilt avjoniserat vatten för att framställa en slutlig 14,5 mM lösning (giftig). Bered 1,5 ml av lösningen per 8-9 täckglas.
Varning: klorguldsyra är hfång förtäring orsakar allvarliga frätskador på hud och ögon, och kan orsaka en allergisk hudreaktion. Giftigt vid förtäring.
- Väg en lämplig mängd natriumcitrat (trinatriumfosfat diväte 2-hydroxipropan-1 ,2,3-trikarboxylat, Na 3 C 6 H 5 O 7) och sedan återsuspendera pulvret i avjoniserat vatten för att göra en slutlig 0,5% lösning. Bered 1 ml av lösningen per 8-9 täckglas.
Varning: Natriumcitrat kan orsaka ögon-och hudirritation. Det kan också orsaka andnings-och matsmältningsorganen irritation.
- I en steril, endotoxinfri bägare kombinera 1,5 ml av den sterila 14,5 mM HAuCl 4-lösning och 13,5 ml sterilt avjoniserat vatten, resultatet bör ge en svagt gul lösning. De ovan nämnda volymerna kommer att möjliggöra 8-9 kolloidalt guld täckglas ska göras.
- Under kontinuerlig omröring, upphettas lösningen på en varm platta tills den börjar att bolja.
Varning: uppvärmning av lösningen bör utföras i dragskåp, eftersom ångor kan vara skadliga / giftiga. Ångorna är destruktiva till vävnaden i slemhinnor och övre luftvägar.
- Avlägsna bägaren från den varma plattan.
- Under omrörning, tillsätt 0,7 ml av den 0,5% natriumcitratlösning. Den tidigare nämnda volym möjliggör 8-9 kolloidalt guld täckglas ska göras.
- Håll omrörning denna kombinerade lösning för cirka 2 minuter (OBS: Färgen på lösningen kommer successivt förändras från svagt gul, för att rensa, till grå, till lila till Deep Purple, innan den slutligen når ett rött vin, eller företrädesvis, rost färg) . Denna produkt är din kolloidalt guld-lösning.
- Kyl det kolloidala guldet lösningen i en 10 ml pipett under 1-2 minuter (för att hålla gelatinskiktet på skyddsremsan från smältning när det kolloidala guldet tillsättes) och tillsätt sedan 1,0-2,0 ml colloidaL guld lösning på varje gelatinbelagda täckglas tidigare placerats i en 24-väl skålen (ES) (mängden kolloidalt guld lösning som du lägger till i gelatinbelagda täckglas beror på hur väl guldpartiklarna fälls i lösningen - se kommentarer nedan).
Obs: Eftersom det kan finnas variationer i effektiviteten av guld partikelutfällning, är det tillrådligt att först lägga 0,5-1 ml av den kolloidala guldet lösning på gelatinbelagda täckglas och sedan placera 24-väl skålen i inkubatorn under 0,5 timmar . Efter denna inkubationstid, bör täckglasen kontrolleras under ljusmikroskop för lämplig densitet av guldpartiklarna på täckglasen. Se figur 1 för 20x mikroskopi bilder av exempel på för låg och för hög koncentration av guldpartiklar. Se Figur 2 för 40x mikroskopi bilder av en idealisk koncentration av guldpartiklar (åtminstone för användning med monocyter). Optimal densitet guld nanopartiklar i bilden bör bestämmas experimentellt för varje använd celltyp, eftersom egenskaper hos de olika cellerna kommer att diktera sin styrka rörlighet på täckglasen. Om koncentrationen av guldpartiklar är otillräcklig, tillför ytterligare 0,5-1 ml av den kolloidala guldet lösningen på gelatinbelagda täckglas.
Beroende på cellstorleken, kan den lämpliga koncentrationen av guldpartiklar variera och därmed i slutändan kommer att bero på storleken av cellen undersöktes för motilitet. Till exempel med humana monocyter är små celler (~ 10-20 um 28) har en högre koncentration av guldpartiklar krävs i våra analyser. En lämplig fördelning av guld nanopartiklar ger forskaren med möjlighet att enkelt och effektivt skilja kanter cellulära spår. En koncentration av guldpartiklar som är alltför hög hämmar förmågan hos cellerna att röra sig och därmed att exakt mätaderas motilitet, medan en koncentration av guldpartiklar som är alltför låga gränser ens förmåga att avgränsa en exakt spår motilitet.
Viktigt: Om syntesen av guld nanopartiklar är problematisk, syntetiserade guld nanopartiklar är kommersiellt tillgängliga i storlekar från 5 nm till 400 nm. Dessutom har fluorescerande mikrosfärer också använts i studier av cellmotilitet 29. Emellertid kräver användningen av dessa mikrosfärer ett fluorescensmikroskop för analys av cellmigration.
- Placera 24-väl skålen med kolloidalt guld-täckta täckglas i en inkubator vid 37 ° C och inkubera från 1 timme till över natten.
- Efter inkubering, skölj / avlägsna obundet guld genom att doppa täckglasen (3x) i steril fosfatbuffrad saltlösning (PBS, pH 7,4).
- Placera dessa kolloidala guld-belagda täckglas i en ren 12-väl skålen (er) som innehåller PBS.
- Förvara dessa täckglas vid 4 ° C tills den skaanvända (parafilm plattan innan den placeras i kylskåp).
Viktigt: Håll alltid kolloidalt guld-belagda täckglas i någon typ av vätska / media som guldpartiklarna kan flagna från täckglasen om de tillåts torka. De kolloidala guld täckglas bör användas inom 2-3 månader från det datum då de gjordes.
Kvalitetskontroll: I ett enda spår phagokinetic motilitet analys, är det viktigt att använda täckglasen som kännetecknas av en liknande koncentration av guldpartiklar. Denna enkla punkt gör det möjligt för de kvantitativa skillnaderna i cellulär motilitet mellan prover vara enbart beroende på typ av behandling och inte de fysiska egenskaperna hos kolloidala guld-belagda täckglas. Vi föredrar användning av enbart täckglas gjordes vid samma tidpunkt i enskilda experiment, även om vi har visat att så länge som densiteten av guld nanopartiklar är lika, användning av täckglasfrån olika beredningar är lämpligt.
3. Analys av cellulär motilitet
- Placera kolloidala guld-belagda täckglas i en lämplig cellulär media för cellerna av intresse.
- Överför lämpligt behandlade celler på de kolloidala guld-belagda täckglas placerade i en 24-brunnars skål (er)
Obs: Antalet celler som överförs till den enda väl måste fastställas för varje celltyp studeras. Helst celler måste fördelas jämnt på den kolloidalt guld-belagda täckglas, vilket i sin tur gör det möjligt för den statistiska analysen av endast spår som skapats av en enda cell. Om celler plattades vid en alltför hög koncentration, blir det mycket troligt att överlappande spår av flera celler kommer att synas. Överlappande spår kan inte exakt kvantifieras och därmed kan de inte beaktas i den slutliga analyserna av rörelsen av de testade cellerna. Överlappande spår som ett resultat avmedverkan av flera celler är oftast lätt observeras, som samman eller korsade spår (inom analys) där två eller flera celler kan observeras i samma rensas sammanhängande område.
- Inkubera vid 37 ° C / 5% CO 2 i 24 h (eller under någon lämplig tid, t.ex. vi har analyserat monocyt motilitet mellan 6 h och 24 h efter behandling och endotelceller vid 12 timmar efter behandling). Den optimala tidsramen för att fastställa och mäta cellulär motilitet varierar med celltyp studeras och därför bör bestämmas experimentellt för varje celltyp (en bra utgångspunkt är dock 6 till 12 timmar efter behandling).
Obs: Om experimentella kolloidalt guld-belagda täckglas behöver lagras och / eller analyseras vid ett senare tillfälle, de celler och nanopartiklar guld måste fästas på täckglasen. För att åstadkomma detta fixering steg, efter steg 3,3, täckglasen första tvätten försiktigt 2 gånger med 1xPBS (doppning av täckglas är att föredra, eftersom en borttagning av guld nanopartiklar från täckglas måste undvikas), sedan använda en standardmetod cell fixering, såsom inkubering med rumstemperatur 3% paraformaldehyd. Efter en 15-minuters inkubation, bör 3% paraformaldehyd avlägsnas och täckglasen tvättades försiktigt 3 gånger med 1 x PBS. De fasta Täckglasen kan lagras i ett kylskåp.
- Med hjälp av ett ljusmikroskop, ta bilder av spåren som skapats av en enda rörlig cell (Obs: förstoring som används för att ta bilder av cellulära spår kommer säkerligen att variera beroende på celltyp under utredning). Exempel på cellulära banor som skapats av icke-motila och rörliga celler på kolloidala guld-belagda täckglas visas i figur 2.
Anmärkning: guld nanopartiklar av storlek som används i phagokinetic spåret motilitet analys har visat sig vara helt icke-toxiska för celler 30. Om nödvändigt, Kan livsdugligheten av de undersökta cellerna bedömas genom färgning med trypanblått eller undersökas för andra markörer av cellulär viabilitet. Man måste ta hänsyn till behovet för fixering, fixationstyp etc. Om detta steg måste genomföras.
- Använda fritt tillgänglig programvara, t.ex. ImageJ programvara ( http://rsbweb.nih.gov/ij/ ) eller NIH Image ( http://rsb.info.nih.gov/nih-image/ ), båda utvecklats vid National Institutes of Health, eller ImageTool ( http://ddsdx.uthscsa.edu/dig/itdesc.html ) utvecklats vid University of Texas Health Science Center i San Antonio, den genomsnittliga område (i godtyckliga enheter) av kolloidalt guld godkänts av 10-20 eller fler celler (per prov) bestäms för varje experimentell arm från de tagna bilderna. Statistik kan sedan utföras på than samlade resultat. Till exempel kan resultaten ritas som betyder ± standard fel medel (SEM) med Students utförda t test och ett P-värde på <0,05 användes som mått på statistisk signifikans mellan proverna. Fig. 3 och 4 steg visar i analys av området av kolloidalt guld rensas av cellen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Visas är ett exempel på bilder tagna under ett ljusmikroskop visar ett spårområde raderas genom en enda cell (en monocyt från våra experiment visas i figur 2). Icke-motila celler skapar karakteristiska små, oval eller cirkel-formade skrifter kring sig indikerar en låg basal nivå av rörelse för dessa ostimulerade celler (figurerna 2A och 2B). I motsats, är mycket rörliga celler [i vårt system, humant cytomegalovirus (HCMV)-infekterade celler] kännetecknas av en riktad rörelse som visas i figurerna 2C och 2D som långsträckta spår områden. Efter att ha fått flera bilder av spår områden med ett inverterat mikroskop med en 40x objektiv, var den totala spår områdena markerade med ImageJ programvara (figur 3), liknande resultat kan erhållas med andra program. Vi gynnar ImageJ programvara eftersom det är gratis och lätt att använda. Rörliga celler skapar inte standard, geometriska formade spår during deras rörelse, och därför är ett bekvämt sätt att markera det område som ska analyseras för att välja frihand verktyg i ImageJ programvara för att markera formen på spåret som skapats av den rörliga cellen (Figur 3). Efter att ha avgränsat spårområdet som ska analyseras, kvantitativ mätning av data utförs genom att klicka på "Analys" i ImageJ menyraden och välja "Mät" från rullgardinsmenyn. Ett prov av våra resultat i godtyckliga enheter erhållna genom analys av de cellulära spår som insamlats från de data som presenteras i figur 3 visas i figur 4A. De resultat som samlats in från ImageJ programvara kan sedan analyseras i ett kalkylblad med val för att möjliggöra beräkning av den genomsnittliga spårområdet raderas per cell såsom visas i figur 4B.
I vår erfarenhet är den mest problematiska steget i protokollet produktionen av kolloidalt guld-belagda täckglas, frågan om oro är g.eneration av täckglas med jämn täckning av guld nanopartiklar (frågor som rör denna oro diskuteras i 2,8 ovan). Den lämpliga, jämn täckning av guld nanopartiklar på ett coveslip presenteras i figur 2. Täckning som är alltför täta (fig. 1A och 1B) eller alltför gles (figurerna 1C och 1D) förhindrar cellmigration eller förändra reproducerbar analys av storleken och formen på spårområdet. Den andra huvudpunkt som diskuteras i 3,2 ovan, är densiteten hos de pläterade cellerna och behovet av att förhindra överlappande eller samman spår från flera celler.
Figur 1. Potentiella problem med tätheten av kolloidalt guld på täckglas. Visas i denna figur är exempel på kolloidalt guld-belagda täckglas med antingen en för hög (Paneler
Figur 2. Exempel på spår som skapats av icke-motila (Paneler A och B) och rörliga (panelerna C och D) celler på kolloidala guld-belagda täckglas. Virus-fria medier (skeninfekterade) eller media innehållande viruspartiklar (HCMV-infekterade) var sattes till isolerade peripheral blodmonocyter 10,18-22. Monocyter inkuberades vid 37 ° C / 5% CO 2 i 1 h och plattströks sedan på kolloidala guld-belagda täckglas för 24 timmar vid 37 ° C / 5% CO 2. Bilderna togs med hjälp av en 40x mål. Vita pilar markerar monocyter i sin slutliga placering. Som vi har visat tidigare 10,18-22, är oinfekterade monocyter kännetecknas av en låg basal nivå av motilitet, medan HCMV-infekterade celler visar egenskaper av hög motilitet. Storlek bar motsvarar 25 um i längd.
Figur 3. Märkning området med de cellulära spår med ImageJ programvara. Visade Exempel är ögonblicksbilder av spår, där bilden J mjukvaran användes vid analysen av spåren som skapats av icke-rörliga (panelerna A och B) och rörliga (panelerna C ochD) celler på kolloidalt guld-belagda täckglas (Obs: Spår är inringade av en vit linje med ImageJ frihand verktyget). Provet bilderna, samma som de som visas i figur 2, användes i denna figur för att mäta spår områden clearas av en enda cell. Dessa är representativa bilder av mock-och HCMV-infekterade monocyter dock vanligtvis 10-20 bilder analyseras per prov. Storlek bar motsvarar 25 um i längd.
Figur 4. Den kvantitativa utvärderingen för cellmotilitet Använda ImageJ programvara och kalkylblad. A) Uppmätta spår områden clearas av celler, såsom visas i prov bilder (figur 2 och 3), med hjälp av ImageJ programvaran. De beräknade resultaten # 1, # 2, # 3 och # 4 motsvarar Paneler A B, C och D i fig 2 och 3, respektive B) En grafisk representation av de genomsnittliga områden (medel,. i godtyckliga enheter) clearas av celler och analyserades med ImageJ mjukvaran. I detta exempel är standardfel av medelvärdet inte visas, eftersom i exemplet ett otillräckligt antal replikat analyseras. Obs! ImageJ programvara ger den uppmätta området spår i godtyckliga enheter, och därför är det viktigt att jämföra bilder av spår tagna under samma förstoring. Den enklaste metoden för att jämföra resultat från separata experiment är att jämföra faldiga förändringar mellan undersökta proverna.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den phagokinetic spår motilitet test presenteras i denna artikel är en enkel och mycket effektiv metod för kvantitativ analys av cellmigration. Eftersom flera celltyper kan analyseras 9-17, har denna metod den potentiella breda användningen över flera discipliner. Användningen av kolloidala guld-belagda täckglas medger mätning av ett spårområde raderas genom en rörlig cell. Analysen kan mäta effekten av olika stimuli (dvs. tillväxtfaktorer, renade ECM ligander, virus, bakterier) på cell motilitet. Dessutom tillåter en brist på kravet på cellens fixering för övervakning av cellmigration vid olika experimentella tidpunkter. Dessutom kräver analysen endast en standard ljusmikroskop, en vanlig kamera med en CCD (charge coupled device) bildsensor och fritt tillgänglig programvara. Därför är sofistikerade mikroskop och kameror behövs inte heller finns särskilda program sviter. Även om rövenay är enkel i design, är det ett kraftfullt verktyg för att statistiskt undersöka rörligheten hos flera celltyper i en mängd experimentella betingelser. Till exempel, i denna fråga, kan analysen användas för att effektivt studera ett litet antal experimentella proverna, liksom att effektivt fungera som en hög genomströmning screeningsanalys. Eftersom täckglasen kan undersökas ofixerade, kan analysen medger även för analys av rörliga celler över tiden utan behov av ett mikroskop med en sluten fuktad, uppvärmd CO 2 inkubator. Dessutom är phagokinetic spår motilitet test hjälp att studera en motilitet av celler inte mottagliga för en time-lapse avbildning, som fotoblekning av fluorofor-färgade celler är mindre problematiska i kolloidalt guld-baserade motilitet analys. Den kvantitativa utvärderingen av spår områden clearas av en enda cell uppnås genom att använda den fritt tillgängliga ImageJ programvara, även om andra program kan användas. Dessutom, den totala Graphical och statistiska analyser erhållits endast kräver grundläggande kunskaper i beräkningar, kalkylblad och statistik.
Det bör noteras att den ursprungliga metod som beskrivs användningen av bovint serumalbumin (BSA) för att täcka täckglas 9. Dock användningen av BSA befunnits otillförlitliga som ett medel för att möjliggöra en enhetlig guld kolloid monolager 27. Ersättning av gelatin för BSA, som täckglas har beläggningen ökat vidhäftning av guld nanopartiklar till täckglaset. Ytterligare ändringar som införts av Scott et al. 27 i protokollet förbättrats avsevärt kvaliteten av guld nanopartiklar beläggning. Ändå fann vi, baserat på Turkevich et al. 23, att användningen av natriumcitrat som reduktionsmedel skapat den mest enhetliga monoskikt av guld nanopartiklar. Därför gynnar vi denna metod och som sådan, är det beskrivs i vår protokoll.
För att möjliggöra ahIGH grad av reproducerbarhet för analysen, är det viktigt att strikt följa de volymer och temperaturer som anges i protokollet, eftersom avvikelser kan starkt påverka slutresultatet. Såsom diskuterats ovan, involverar en av de tekniska hinder i användningen av phagokinetic spåret motilitet analysera produktionen av guld nanopartiklar i lösningen och sedan att få en lämplig likformig koncentration av guld nanopartiklar på täckglaset. Även om guldet nanopartiklar utfällningssteget är reproducerbar, lägger vi fokus på att bedöma färgen på den slutliga lösningen av utfällda guld nanopartiklar. Dessutom är detta vår logik för endast lägga hälften av den normala volymen av den slutliga lösningen på varje täckglas och sedan efter 0,5 timme, utvärdera densiteten och enhetlighet guldpartiklarna på täckglas (med möjlighet att lägga till ytterligare lösning, om behövs senare). Dessa försiktighetsåtgärder vidtas för att undvika att skapa ett tillstånd där than täckglas visar antingen för högt (fig. 1A och 1B) eller för låg (figur 1C och 1D) en koncentration av guld nanopartiklar på glas.
Totalt sett är phagokinetic spår motilitet test en enkel metod för att analysera celler rörelse. Det ger en ögonblicksbild av avståndet (via den slutliga spårområdet) att en cell flyttas över en definierad tidsperiod. Vidare är analysen mycket mottagliga för flera stimuli, som undersökte cellerna kan testas under en mängd olika behandlingsalternativ. Till exempel i våra experiment monocyt, har vi testat motiliteten av viralt infekterade, cytokin-behandlade, tillväxt-faktor-behandlade, mitogen-behandlade och LPS-behandlade monocyter. Vidare har vi testat dessa aktiverade monocyter under olika inhibitorer / hämmande villkor att funktionellt undersöka rollen olika biokemiska / molekylära vägar spelar i monocyt motilitet. Till skillnad från en sårläkande 31 analys, measuringa kumulativa effekten av celltillväxt och migration eller en Boyden kammare (trans-väl) migration analys 32, så en bulk analys av celler kemotaktisk motilitet utvärderar phagokinetic spår motilitet test migration av en enda cell. Men om det finns ett behov av en bulk kemotaktisk effekt som skall mätas, en tredimensionell migrering / invasion bedömas, en mer detaljerad analys av en cellulär rörelse, eller analys av cellrörelse under in vivo förhållanden, detta protokoll skulle inte räcker och användning av extra metoder, såsom trans-väl migration analysen, en Matrigel invasion analys 33, levande tid löpt mikroskopi / fotografi 34,35, etc. skulle behöva övervägas.
Den phagokinetic spår motilitet analys är en enkel, kvantitativ utvärdering / jämförelse av förmågan hos celler att migrera utan behov av att använda dyra mikroskop och programvara i analyserna. Den riktar sig till Resebågskyttar i behov av ett snabbt och enkelt, men pålitligt, metod för att kvantifiera cellmotilitet, som erbjuder en möjlighet till en enkel hög genomströmning analys.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Inga intressekonflikter deklareras.
Acknowledgments
Detta arbete har finansierats med bidrag från National Institutes of Health (AI050677, HD-051.998, och GM103433), en Malcolm Feist kardiovaskulär forskning gemenskap och en American Heart Association predoctoral gemenskap (10PRE4200007).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Glass Coverslips (15mm) | Fisher Scientific | 12-545-83 | |
| Gelatin 300 Bloom | Sigma-Aldrich | G-1890 | |
| Tetrachloroauric Acid Trihydrate | Fisher Chemical | G54-1 | 14.5 mM (a final working solution) |
| Sodium Citrate | Fisher Scientific | BP327-500 | 0.5% (a final working solution) |
| Paraformaldehyde | Fisher Scientific | O4042 | 3% (a final working solution) |
| 100 mm Tissue Culture Dish | Sarstedt | 83.1802 | |
| 12-Well Plates | Fisher Scientific | 08-772-29 | |
| 24-Well Plates | Fisher Scientific | 07-200-84 | |
| Techne Oven Hybridiser HB-1D | LabPlanet | 2040500 | The standard laboratory oven will suffice |
| 10 ml Serological Pipettes | Sarstedt | 86.1254.001 | |
| Pipet-Aid Filler/Dispenser | Drummond | 13-681-15 | |
| P200 Single-Channel Manual Pipette | Rainin | PR-200 | |
| 200 ml Barrier Tips | CLP | BT200 | |
| ImageJ software | http://rsb.info.nih.gov/ij/ | License: Public Domain | |
| Nikon Eclipse TE300 with a photometrics CoolSNAPfx monochrome 12-bit CCD camera | Nikon | Discontinued; The most comparable specification has Nikon Eclipse Ti, but a lower end Nikon 80i will be suitable as well. Other brands also provide comparable microscopes. | |
| Note: The reagents and equipment listed below have been utilized by us in our various studies. Other supplies, suppliers, reagents, and equipment can be used, as long as they have similar specifications. | |||
References
- Armstrong, P. B. The control of cell motility during embryogenesis. Cancer Metastasis Rev. 4, 59-79 (1985).
- Dustin, M. L. Stop and go traffic to tune T cell responses. Immunity. 21, 305-314 (2004).
- Mutsaers, S. E., Bishop, J. E., McGrouther, G., Laurent, G. J. Mechanisms of tissue repair: from wound healing to fibrosis. Int. J. Biochem. Cell Biol. 29, 5-17 (1997).
- Etienne-Manneville, S. Polarity proteins in migration and invasion. Oncogene. 27, 6970-6980 (2008).
- Parsons, J. T., Horwitz, A. R., Schwartz, M. A. Cell adhesion: integrating cytoskeletal dynamics and cellular tension. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 11, 633-643 (2010).
- Mitchison, T. J., Cramer, L. P. Actin-based cell motility and cell locomotion. Cell. 84, 371-379 (1996).
- Pollard, T. D., Borisy, G. G. Cellular motility driven by assembly and disassembly of actin filaments. Cell. 112, 453-465 (2003).
- Bretscher, M. S. Getting membrane flow and the cytoskeleton to cooperate in moving cells. Cell. 87, 601-606 (1996).
- Albrecht-Buehler, G. The phagokinetic tracks of 3T3 cells. Cell. 11, 395-404 (1977).
- Smith, M. S., Bentz, G. L., Alexander, J. S., Yurochko, A. D. Human cytomegalovirus induces monocyte differentiation and migration as a strategy for dissemination and persistence. J. Virol. 78, 4444-4453 (2004).
- Palmisano, R., Itoh, Y. Matrix Metalloproteinase Protocols. Methods in Molecular Biology. 622, Humana Press. 379-392 (2010).
- Ohta, H., et al. HOXD3-Overexpression Increases Integrin Alpha V Beta 3 Expression and Deprives E-Cadherin while It Enhances Cell Motility in A549 Cells. Clinical and Experimental Metastasis. 7-8, 381-390 (2006).
- Kawa, S., Kimura, S., Hakomori, S., Igarashi, Y. Inhibition of chemotactic motility and trans-endothelial migration of human neutrophils by sphingosine 1-phosphate. FEBS Lett. 420, 196-200 (1997).
- Kawamura, K., et al. N-WASP and WAVE2 acting downstream of phosphatidylinositol 3-kinase are required for myogenic cell migration induced by hepatocyte growth factor. J. Biol. Chem. 279, 54862-54871 (2004).
- Ando, Y., Jensen, P. J. Epidermal growth factor and insulin-like growth factor I enhance keratinocyte migration. J. Invest. Dermatol. 100, 633-639 (1993).
- Todt, J. C., et al. Effects of tumor necrosis factor-alpha on human trophoblast cell adhesion and motility. Am. J. Reprod. Immunol. 36, 65-71 (1996).
- McAuslan, B. R., Reilly, W. Endothelial cell phagokinesis in response to specific metal ions. Exp. Cell. Res. 130, 147-157 (1980).
- Smith, M. S., Bentz, G. L., Smith, P. M., Bivins, E. R., Yurochko, A. D. HCMV activates PI(3)K in monocytes and promotes monocyte motility and transendothelial migration in a PI(3)K-dependent manner. J. Leukoc. Biol. 76 (3), 65-76 (2004).
- Smith, M. S., et al. Roles of phosphatidylinositol 3-kinase and NF-kappaB in human cytomegalovirus-mediated monocyte diapedesis and adhesion: strategy for viral persistence. J. Virol. 81, 7683-7694 (2007).
- Bentz, G. L., Yurochko, A. D. Human CMV infection of endothelial cells induces an angiogenic response through viral binding to EGF receptor and beta1 and beta3 integrins. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 5531-5536 (2008).
- Chan, G., Nogalski, M. T., Yurochko, A. D. Activation of EGFR on monocytes is required for human cytomegalovirus entry and mediates cellular motility. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106, 22369-22374 (2009).
- Nogalski, M. T., Chan, G., Stevenson, E. V., Gray, S., Yurochko, A. D. HCMV-Regulated Paxillin in Monocytes Links Cellular Pathogenic Motility to the Process of Viral Entry. J. Virol. 85, 1360-1369 (2011).
- Turkevich, J. A study of the nucleation and growth processes in the synthesis of colloidal gold. Discuss. Faraday. Soc. 11, 55-75 (1951).
- Frens, G. Particle size and sol stability in mental colloids. Colloid & Polymer Science. 250, 736-741 (1972).
- Frens, G. Controlled nucleation for the regulation of the particle size in monodisperse gold suspensions. Phys. Sci. 241, 20-22 (1973).
- Zetter, B. R. Assay of capillary endothelial cell migration. Methods Enzymol. 147, 135-144 (1987).
- Scott, W. N., McCool, K., Nelson, J. Improved method for the production of gold colloid monolayers for use in the phagokinetic track assay for cell motility. Anal. Biochem. 287, 343-344 (2000).
- Wang, S. Y., Mak, K. L., Chen, L. Y., Chou, M. P., Ho, C. K. Heterogeneity of human blood monocyte: two subpopulations with different sizes, phenotypes and functions. Immunology. 77, 298-303 (1992).
- Windler-Hart, S. L., Chen, K. Y., Chenn, A. A cell behavior screen: identification, sorting, and enrichment of cells based on motility. BMC Cell Biol. 6, 14 (2005).
- Pan, Y., et al. Size-dependent cytotoxicity of gold nanoparticles. Small. 3, 1941-1949 (2007).
- Rodriguez, L. G., Wu, X., Guan, J. L. Wound-healing assay. Methods Mol. Biol. 294, 23-29 (2005).
- Boyden, S. The chemotactic effect of mixtures of antibody and antigen on polymorphonuclear leucocytes. J. Exp. Med. 115, 453-466 (1962).
- Brooks, D. M., Brooks, S. A. In Vitro Invasion Assay Using Matrigel(R). Methods Mol. Med. 58, 61-70 (2001).
- Kuo, J. C., Wang, W. J., Yao, C. C., Wu, P. R., Chen, R. H. The tumor suppressor DAPK inhibits cell motility by blocking the integrin-mediated polarity pathway. J. Cell Biol. 172, 619-631 (2006).
- Benazeraf, B., et al. A random cell motility gradient downstream of FGF controls elongation of an amniote embryo. Nature. 466, 248-252 (2010).
