Avaliação ex vivo de Fatigabilidade Contratilidade e Alternans em músculos esqueléticos isolados

Summary

Nós descrevemos um método para medir diretamente a força muscular, a força muscular, a cinética contráteis e fatigabilidade de músculos esqueléticos isolados em um<em> In vitro</em> Sistema usando estimulação campo. Informações valiosas sobre Ca^{2 +} As propriedades de manuseamento e maquinaria contrátil do músculo pode ser obtida utilizando-se diferentes protocolos de estimulação.

Abstract

Descrito aqui é um método para medir a contratilidade dos músculos esqueléticos isolados. Parâmetros, tais como a força muscular, a força muscular, a cinética contráteis, fatigabilidade ea recuperação após a fadiga pode ser obtido para avaliar aspectos específicos do acoplamento excitação-contração (ECC) do processo, como a excitabilidade, máquinas contrátil e Ca ^{2 +} capacidade de manipulação. Este método remove o suprimento nervoso e sangue e se concentra sobre o músculo esquelético isolado em si. Rotineiramente usar esse método para identificar os componentes genéticos que alteram a propriedade contrátil do músculo esquelético embora modulação Ca ^{2 +} vias de sinalização. Aqui, nós descrevemos um fenótipo do músculo esquelético recentemente identificado, isto é, a alternância mecânico, como um exemplo de várias informações e rico que pode ser obtida utilizando o ensaio in vitro a contractilidade do músculo. Combinação deste ensaio com ensaios de célula única, as abordagens genéticas e bioquímicasensaios Stry pode fornecer importantes insights sobre os mecanismos de ECC no músculo esquelético.

Introduction

Os músculos esqueléticos anexar a ossos do esqueleto e gerar forças contrácteis sob o controlo do sistema nervoso central. Acoplamento excitação-contração (ECC) refere-se ao processo de conversão de um estímulo eléctrico a uma resposta mecânica. Ca ^{2 +} de sinalização é um componente essencial da função contráctil do músculo esquelético. Eficaz a mobilização de Ca ^{2 +} do retículo sarcoplasmático (RS) é um componente importante para ECC em células musculares ^{1, 2,} e mudanças no Ca ^{2 +} intracelular de sinalização estão subjacentes à disfunção contráctil correspondente numa série de doenças musculares ^3-5. Avaliação adequada da contratilidade muscular é essencial e complementar ao Ca ^{2 +} de imagem e outros ensaios para obter insights sobre a função do músculo esquelético, não apenas no nível de contração, mas também ao nível cinética. Força e velocidade também pode ser obtido a informar a propriedade importante deforça muscular e do estado do processo de ECC em diferentes condições fisiológicas e fisiopatológicas.

Este campo fecundo de pesquisa tem uma história muito rica e muitas teorias de contração muscular apareceu mais de dois milênios ^6. Pesquisa muscular moderna provavelmente começa em 1674-1682 com a observação microscópica de cross-estrias e miofibrilas nas fibras musculares por Leeuwenhoek ^6. Quase um século depois, Luigi Galvani observou que os contratos musculares sapo vigorosamente quando seu nervo é tocado com bisturi durante uma descarga de centelha de uma máquina elétrica distante ^7-9. Contracção pode também ser produzida através da ligação do nervo para o músculo da perna por meio de um condutor metálico. Os detalhes do mecanismo de sinalização elétrica complexa defendidas por Galvani foram eventualmente formulado por Hodgkin, Huxley e Katz em sua famosa equação ^{10, 11,} que se tornou a base de eletrofisiologia. As observações notáveis ​​de Ringer sobre os efeitos do Ca ^{2 +} extracelular sobre a contractilidade do coração e músculos esqueléticos rã ^12-15 representam o primeiro passo importante no reconhecimento de Ca ^{2 +} como um regulador chave da contractilidade do músculo ^{16, 17.} A partir da década de 1980 até os dias atuais uma explosão de descobertas no campo da contratilidade muscular foi realizado devido à introdução de contratilidade muscular e protocolos fatigabilidade em murinos músculos esqueléticos ^18. Jones e Edwards foram os primeiros a sugerir que a fadiga de baixa freqüência intermitente (induzida pelo exercício diminuição da força) ¹⁹ foi associado a alterações no maquinário ECC e não o aparato contrátil. No final dos anos 1980 e início de 1990, Kolkeck et al ^20, Kolbeck e Nosek ^21, e Reid ²² foram usar o músculo diafragma de modelos de roedores para estudar os efeitos da teofilinas, cortiosterone, e radicais livres sobre a contratilidade muscular, enquanto Brooks e Faulkner foram os primeiros a informar sobre as medidas de força repetida e medições de potência em fast-e-lento músculos de ratos ^22. Além disso, Lannegren, Westerblad, Cordeiro e Westerblad foram os primeiros a ligar diretamente contratilidade ex vivo com Ca ^{2 +} intracelular regulação e começou a questionar o papel da acidose em fadiga muscular ^{23, 24.}

Nossos laboratórios têm contribuído significativamente desde o início de 2000 para a compreensão de novos genes com modulador e funções de regulação no músculo ECC com papéis críticos da contratilidade muscular, cansaço e envelhecimento, usando uma combinação de intactas rato estudos de contratilidade muscular, intracelular de Ca ² monitoramento ⁺ em intactas e sem pele fibras musculares e molecular-genéticos manipulações ^{3-5, 25-29.}

Aqui nós mostramos o protocolo experimental para medir a contratilidade de murinos sóleo isolados e longus extensor dos dedos (EDL) dos músculos, o que corresponde a uma maior parte slow-oxidativo (tipo I e IIa fibras musculares) e um músculo principalmente fast-glyocolytic (tipo IIb e fibras musculares IIx) com distintas propriedades contrácteis. Neste protocolo, intactas músculo-tendão complexos foram isolados e banhado numa Radnotti PowerLab ADI sistema de câmara fornecido com ou oxigénio puro ou uma mistura de oxigénio (95%) _e CO2 (5%). Forças contrácteis foram gerados por estímulos eléctricos a partir de um estimulador Grass e detectado utilizando um transdutor de força que foi integrado com um sistema de PowerLab/400 ADI, o que permite a personalização de rotinas de macro para controlar a aquisição, a recolha, a digitalização e armazenamento de dados. Esta configuração pode medir a força muscular, força muscular, assim como a relação força versus frequência, fadiga muscular, a recuperação da fadiga muscular, velocidade e propriedades cinéticas totais de contração muscular. Além disso, os efeitos de drogas sobre a contração do músculo pode ser monitorado através destas experiências. </p>

As vantagens deste método reside na remoção dos componentes neuronais e vasculares de distância a partir do músculo esquelético, o que permite avaliar directamente as propriedades intrínsecas de contrair o músculo. Além disso, os ensaios de contratilidade ex vivo permite que a manipulação do meio extracelular em torno dos músculos isolados, o que permite o uso de manipulações farmacológicas de vários canais de iões e transportadores de permeação, de modo a definir os seus papéis fisiológicos para a função do músculo esquelético.

Este sistema ex vivo nos permitiu descobrir recentemente um comportamento distinto alternano em certas preparações de músculo mutantes, que estavam ligados a alteração do Ca ^{2 +} intracelular manipulação propriedades ^4. Alternans são definidos como episódios de ruptura flutuação de força contrátil durante a fase de declínio do perfil fatigante. Durante esses eventos forças contráteis aumentar momentaneamente acima de seu nível anterior de força durante estimulação cansativo, talvez porque seja mais Ca ^{2 +} está sendo lançado ou a maquinaria contrátil tornou-se mais sensível ao Ca ^{+ 30 2.} Tratamento de ciclopiazônico ácido (CPA), um bloqueador reversível da sarcoplasmático-retículo endoplasmático cálcio ATPase (SERCA), cafeína, um agonista de rianodina canal (RYR) e repetiu fatigante estímulos podem induzir a alternância mecânica ^4, sugerindo que a alternância estão diretamente relacionados à modulação do processo de acoplamento CE. Demonstração do método de induzir e gravar alternância mecânico in vitro configuração contratilidade serve como um exemplo para mostrar os parâmetros diversificados experimentais que poderiam ser obtidos com este sistema ou similares, com base em interesses de pesquisa individuais.

Este método pode ser de interesse para os investigadores que estudam a fisiologia muscular. Configuração similar pode também ser usado para os complexos isolados de outros muscle-tendon/ligament esqueléticoslocalizações anatómicas, assim como para as fibras individuais e as tiras musculares.

Protocol

Composição da solução: 2,5 mM de Ca 2 + solução de Tyrode: NaCl 140 mM, KCl 5 mM, HEPES 10 mM, CaCl2 2,5 mM, MgCl2 2 mM e 10 mM de glicose 0 mM de Ca 2 + solução de Tyrode: 140 mM de NaCl, 5 mM KCl, 10 mM de HEPES, 2 mM de MgCl2, 0,1 mM de ácido etileno-glicol tetraacético (EGTA) e 10 mM de glicose Nota: A solução de banho deve ser saturada com 100% O 2, se uti…

Discussion

Medição da força contráctil e fatigabilidade é importante para a avaliação global da função do músculo esquelético. O principal objetivo deste ensaio é identificar alterações na força muscular e propriedades fatigantes sob certas condições patológicas, como sarcopenia e fadiga muscular, e para testar o efeito de drogas / reagentes sobre a contratilidade muscular. Desde que a força muscular está intimamente relacionada com o Ca ^{2 +} intracelular lançamento, extracelular Ca ^{2 +} e …

Materials

Name of the reagent	Company	Catalogue number	Comments (optional)
2-APB	Tocris	1224	Blocker of a number of Ca2+ entry channels including SOC and TRP etc.
SKF96365	Sigma	SKF-96365	Blocker of a number of Ca2+ entry channels including SOC and receptor-mediated Ca2+ entry etc.
BTP-2	Millipore	203890-5MG	Relatively specific SOC blocker
CPA	Sigma	C1530	Reversible SERCA blocker
caffeine	Sigma	C0750	Fast action RyR agonist
Radnoti Four Unit Tissue Organ Bath System	Radnoti	159920
Combination Tissue Support/Stimulating Electrode	Radnoti	160151	Vertical Zig Zag Type with tissue support
Quad Bridge Amp	ADInstruments	FE224
PowerLab/400	ADInstruments		This product is no longer available. Choose other version of the data acquisition system.
Force Transducers (5 mg – 25 g)	ADInstruments	MLT0201/RAD
Chart v4.02	ADInstruments		LabChart 7.3 is the latest version of Chart software.
S8800 Dual Pulse Digital Stimulator	GRASS TECHNOLOGIES		This product is no longer available. S88X Dual Output Square Pulse Stimulator is a newer stimulator.
RF Transformer Isolation Unit	GRASS TECHNOLOGIES	Model SIU5