Évaluation ex vivo de la contractilité, fatigabilité et isolées du Alternans muscles squelettiques

Summary

Nous décrivons une méthode pour mesurer directement la force musculaire, la force musculaire, de la cinétique contractile et la fatigabilité des muscles squelettiques isolés dans un<em> In vitro</em> Système en utilisant une stimulation de champ. Des informations précieuses sur Ca^{2 +} Propriétés de manipulation et de la machinerie contractile du muscle peuvent être obtenues en utilisant différents protocoles de stimulation.

Abstract

Décrit ici est une méthode de mesure de la contractilité des muscles squelettiques isolés. Des paramètres tels que la force musculaire, la force musculaire, de la cinétique contractile, la fatigabilité, la fatigue et la récupération après peuvent être obtenues à évaluer des aspects spécifiques du couplage excitation-contraction (ECC) de processus tels que l'excitabilité, contractile machines et Ca ^{2 +} capacité de manutention. Cette méthode supprime l'innervation et de sang et se concentre sur le muscle squelettique isolé lui-même. Nous avons l'habitude d'utiliser cette méthode pour identifier les composantes génétiques qui altèrent la propriété contractile du muscle squelettique si moduler Ca ^{2 +} voies de signalisation. Ici, nous décrivons un phénotype musculaire squelettique nouvellement identifiés, à savoir l'alternance mécanique, comme par exemple des informations diverses et riche qui peut être obtenu en utilisant le test in vitro avec la contractilité du muscle. Combinaison de ce test avec des dosages de cellules simples, des approches génétiques et biochimiquestests strY peut fournir des indications importantes sur les mécanismes de ECC dans le muscle squelettique.

Introduction

Attacher les muscles du squelette à os du squelette et de générer des forces de contraction sous le contrôle du système nerveux central. Couplage excitation-contraction (CEC) se réfère au processus de conversion d'un stimulus électrique à une réponse mécanique. Ca ^{2 +} signalisation est une composante essentielle de la fonction contractile dans le muscle squelettique. Efficace de mobilisation de Ca ^{2 +} du réticulum sarcoplasmique (SR) est une composante importante de la CPE en ^{1, 2} cellules musculaires, et les variations de Ca ^{2 +} intracellulaire de signalisation sous-tendent la dysfonction contractile correspondant à un certain nombre de ^3-5 maladies musculaires. Une évaluation correcte de la contractilité musculaire est essentiel et complémentaire à Ca ^{2 +} imagerie et d'autres analyses afin de mieux comprendre en fonction du muscle squelettique, et pas seulement au niveau contractile, mais aussi au niveau cinétique. La force et la vitesse peuvent également être obtenus à informer la propriété importante d'la force musculaire et l'état du processus des CEC dans différentes conditions physiologiques et physiopathologiques.

Ce champ fécond de la recherche a une histoire très riche et de nombreuses théories de la contraction musculaire est apparu plus de deux millénaires ^6. Recherche sur les muscles moderne commence probablement en 1674-1682 avec l'observation microscopique des stries transversales et des myofibrilles dans les fibres musculaires par Leeuwenhoek ^6. Près d'un siècle plus tard, Luigi Galvani observer que les contrats de muscle de grenouille vigoureusement quand le nerf est touché avec un scalpel lors d'une décharge d'étincelles d'une machine distante électrique ^7-9. Contraction pourrait également être produite en connectant le nerf au muscle jambe par un conducteur métallique. Les détails du mécanisme de signalisation électrique complexe préconisées par Galvani ont finalement été formulée par Hodgkin, Huxley et Katz dans leur fameuse équation ^{10, 11,} qui est devenu le fondement de l'électrophysiologie. Les observations remarquables de Ringer sur les effets de Ca ^{2 +} extracellulaire sur la contractilité du cœur et les muscles squelettiques de grenouille ^12-15 représentent la première étape importante dans la reconnaissance de Ca ^{2 +} comme un régulateur clé de ¹⁶ contractilité du ^{muscle, 17.} A partir des années 1980 à nos jours un afflux de découvertes dans le domaine de la contractilité du muscle a été réalisé grâce à l'introduction de la contractilité musculaire et fatigabilité protocoles dans les muscles squelettiques murines ^18. Jones et Edwards ont été les premiers à suggérer que la fatigue de basse fréquence intermittente (induite par l'exercice de réduction des effectifs) ¹⁹ a été associée à des changements dans la machinerie ECC et non l'appareil contractile. Dans la fin des années 1980 et au début des années 1990, Kolkeck et al ^20, Kolbeck et Nosek ^21, et Reid ²² ont été en utilisant le muscle du diaphragme à partir des modèles de rongeurs pour étudier les effets de la théophylline, cortiosterone, et des radicaux libres sur la contractilité du muscle squelettique, tandis que Brooks et Faulkner ont été les premiers à faire rapport sur ​​les mesures de force répétées et des mesures de puissance en rapide et lente des muscles de souris ^22. En outre, Lannegren, Westerblad, Agneau, et Westerblad ont été les premiers à relier directement la contractilité ex vivo avec Ca ^{2 +} intracellulaire réglementation et a commencé à s'interroger sur le rôle de l'acidose dans ²³ la fatigue ^{musculaire, 24.}

Nos laboratoires ont contribué de manière significative depuis le début des années 2000 vers la compréhension de nouveaux gènes avec modulateur et de la réglementation sur le muscle ECC avec des rôles critiques dans la contractilité des muscles, fatigabilité, et le vieillissement en utilisant une combinaison d'études sur les souris intactes contractilité musculaire, concentration intracellulaire de Ca ^{2 Surveillance +} dans fibres musculaires intactes et sans peau et de génétique moléculaire des manipulations ^{3-5, 25-29.}

Ici, nous avons détaillé le protocole expérimental de mesure de la contractilité du muscle soléaire murins isolés et extenseur commun des orteils (EDL) muscles, qui correspondent à une lente surtout-oxydant (de type I et des fibres musculaires IIa) et surtout un muscle rapide glyocolytic (type IIb et IIx fibres musculaires) ayant des propriétés contractiles. Dans ce protocole, intactes de muscle-tendon complexes ont été isolés et baigné dans un système ADI PowerLab Radnotti chambre alimentée en oxygène pur ou un mélange d'oxygène (95%) et de CO ₂ (5%). Forces contractiles ont été générés par des stimulations électriques provenant d'un stimulateur Grass et détectés à l'aide d'un capteur de force qui a été intégré à un système ADI PowerLab/400, permettant la personnalisation des routines macro pour contrôler l'acquisition, la collecte, la numérisation et le stockage des données. Cette configuration permet de mesurer la force musculaire, la force musculaire, ainsi que la relation force fonction de la fréquence, de la fatigue musculaire, la récupération de la fatigue musculaire, la vitesse et l'ensemble des propriétés cinétiques de la contraction musculaire. En outre, les effets des drogues sur la contraction musculaire peut être contrôlé grâce à ces expériences. </p>

Avantages de cette méthode réside dans l'élimination des composants neuronaux et vasculaires loin du muscle squelettique, ce qui permet une évaluation directe des propriétés intrinsèques de contracter le muscle. En outre, les anciens tests in vivo contractilité permettre la manipulation du milieu extracellulaire qui entoure les muscles isolés, ce qui permet l'utilisation de manipulations pharmacologiques des différents canaux ioniques et des transporteurs de perméation afin de définir leurs rôles physiologiques de la fonction du muscle squelettique.

Ce système ex vivo nous a permis de découvrir récemment un comportement alternane distincte dans certaines préparations de muscle mutant, qui étaient liées aux altérée Ca ^{2 +} intracellulaire propriétés de manipulation ^4. Alternance sont définis comme des épisodes d'éclatement fluctuation de la force contractile durant la phase de déclin du profil fatigant. Lors de ces événements forces contractiles augmenter momentanément au-dessus de son niveau précédent de la force du cours de la stimulation pénible, peut-être parce soit plus de Ca ^{2 +} est relâché ou que la machinerie contractile est devenue plus sensible à Ca ^{2 + 30.} Le traitement de l'acide cyclopiazonique (CPA), un bloqueur réversible de sarcoplasmique de calcium du réticulum endoplasmique-ATPase (SERCA), la caféine, un agoniste de la ryanodine canal (RyR) et répété fatigue stimulations peuvent tous provoquer une alternance mécanique ^4, ce qui suggère que l'alternance sont directement liés à modulation du processus de couplage CE. Démonstration de la méthode pour induire et enregistrer alternance mécaniques dans la contractilité in vitro dans la configuration sert d'exemple pour montrer les paramètres expérimentaux diversifiés qui pourraient être obtenus avec ce système ou d'autres similaires, fondées sur des intérêts individuels de recherche.

Cette méthode peut être intéressante pour les chercheurs qui étudient la physiologie musculaire. Configuration similaire peut également être utilisé pour des complexes isolés muscle-tendon/ligament squelettiques provenant d'autresemplacements anatomiques, ainsi que pour les fibres individuelles et des bandes de muscle.

Protocol

Composition de la solution: 2,5 mM de Ca 2 + Tyrode solution: NaCl 140 mM, KCl 5 mM, HEPES 10 mM, 2,5 mM de CaCl2, MgCl2 2 mM et 10 mM de glucose 0 mM Ca 2 + Tyrode solution: NaCl 140 mM, KCl 5 mM, HEPES 10 mM, MgCl2 2 mM, 0,1 mM d'éthylène glycol tétraacétique (EGTA) et 10 mM de glucose Note: La solution de baignade devrait être saturé avec 100% d'O 2 si vou…

Discussion

Mesure de la force contractile et la fatigabilité est important pour l'évaluation globale de la fonction du muscle squelettique. Le but principal de cet essai est d'identifier les changements dans la force musculaire et la fatigue engendrée par les propriétés sous certaines conditions pathologiques, comme la sarcopénie et la fatigue musculaire, et de tester l'effet de la drogue / réactifs sur la contractilité musculaire. Puisque la force musculaire est étroitement liée avec intracellulaire Ca ^…

Materials

Name of the reagent	Company	Catalogue number	Comments (optional)
2-APB	Tocris	1224	Blocker of a number of Ca2+ entry channels including SOC and TRP etc.
SKF96365	Sigma	SKF-96365	Blocker of a number of Ca2+ entry channels including SOC and receptor-mediated Ca2+ entry etc.
BTP-2	Millipore	203890-5MG	Relatively specific SOC blocker
CPA	Sigma	C1530	Reversible SERCA blocker
caffeine	Sigma	C0750	Fast action RyR agonist
Radnoti Four Unit Tissue Organ Bath System	Radnoti	159920
Combination Tissue Support/Stimulating Electrode	Radnoti	160151	Vertical Zig Zag Type with tissue support
Quad Bridge Amp	ADInstruments	FE224
PowerLab/400	ADInstruments		This product is no longer available. Choose other version of the data acquisition system.
Force Transducers (5 mg – 25 g)	ADInstruments	MLT0201/RAD
Chart v4.02	ADInstruments		LabChart 7.3 is the latest version of Chart software.
S8800 Dual Pulse Digital Stimulator	GRASS TECHNOLOGIES		This product is no longer available. S88X Dual Output Square Pulse Stimulator is a newer stimulator.
RF Transformer Isolation Unit	GRASS TECHNOLOGIES	Model SIU5