Application Notes

抗体アレイを用いた受容体チロシンキナーゼリン酸化におけるプロファイリングの変更 - 広告

Released: September 27, 2012 doi: 10.3791/4199

Greta J. Wegner¹, David J. Finkel¹, Amy E. James¹, Richard A. Krzyzek¹

¹Array Group, Assay Department, R&D Systems, Inc.

Summary

プロテオームプロファイラ抗体アレイは、多数の免疫沈降（IP）西部劇を行うことなく、受容体チロシンキナーゼ（RTK）のリン酸化の変化をスクリーニングするための便利でコスト効率の良い方法です。 ARY001人間のRTKアレイは、化学発光検出を使用して、単一のサンプル中の複数のRTKの定性的な測定が可能になる。

Abstract

受容体チロシンキナーゼ（RTK）の発現とリン酸化の調節不全は、頻繁に癌細胞の開発と転移拡散に関連付けられています^1月3日の重要な努力が特定のRTKを標的とし、病気の状態に関連付けられている異常なシグナル伝達経路を遮断するように開発阻害剤が注目されている本研究の目的は^、4月7日 RTKのリン酸化に対する阻害剤の選択数の効果を測定することであった。本研究では、単一のサンプルで同時に多数のRTKのためのリン酸化の増加または減少を監視するための膜ベースのサンドイッチ免疫測定法である人間のホスホ-RTKの配列を使用していました。このアッセイでは、ライセート試料中に存在する両方のリン酸化および非リン酸化RTKは、ニトロセルロース膜を横切って顕微鏡スライドのサイズを二重に印刷された離散的な抗体によって捕捉されます。洗浄後、アレイは、抗ホスホ - チロシン - 西洋ワサビペルオキシダーゼ（HRP）とともにインキュベートするアレイ上に捕捉したリン酸化RTKのと挟む。第2の洗浄工程の後に、配列は化学発光試薬と共にインキュベートする。各アレイスポットで生成された信号は、各キャプチャ抗体が結合したリン酸化タンパク質の量に比例する。これらの実験では、配列は、MDA-MB-453乳癌またはKATO III胃癌細胞と同様に、ErbB受容に向けた選択的阻害剤で細胞を処理するに関連付けられているリン酸化の減少を特徴づけるためにいずれかのリガンド刺激後のリン酸化の増加を測定するために用いたまたはFGF Rファミリーのメンバー。

Protocol

1。試料調製

人間ホスホ-RTKアレイデータシートに記載されているガイドラインに従って、未処理、リガンドが処理、またはインヒビターおよびリガンド処理した細胞からライセートを収集します。溶解バッファーは、このキット用に最適化されている。他の溶解バッファーの置換は、配列の最後のパフォーマンスに影響を与える可能性があります。タンパク質分解サンプルの劣化を防ぐために、10μg/ mlのアプロチニン、10μg/ mlのロイペプチン、10μg/ mlのペプスタチン各使用のための新鮮な各細胞溶解物の準備に必要な溶解バッファーのボリュームに追加します。
ライセート濃度はビシンコニン酸（BCA）アッセイを用いて測定されるべきである。試料濃度は、経験的に最適な感度と低バックグラウンドのために調整することができる。ライセートの100から300μgの範囲は、最初の出発点として推奨されています。
サンプルの凍結/融解サイクルは避けるべきであり、溶解物の適切なストレージが最適なパフォーマンスを得るために必要とされる。氷の上で凍結溶解物サンプルを解凍します。

使用前に室温にすべてのキット部品を持参してください。手順を実行する際は、汚染を避けるため、手袋を着用してください。
使用する4ウェルマルチディッシュの各ウェルに配列バッファ1のピペット2.0ミリリットル。配列バッファ1にブロックバッファとして機能します。
フラットチップピンセットを使用して、4穴マルチディッシュのウェルに保護シートと場所の間から使用する各膜を除去します。配列番号が上向きされるべきである。
配列バッファ1と接触すると、スポットから青色色素は消えますが、捕捉抗体は、それらの特定の位置に保持されます。
ロッキングプラットフォーム上で1時間インキュベートする。各配列の岩は、その十分の端から端ようオリエントトレイ。アレイの表面は完全に濡らし、ブロックバッファによってカバーされるべきである。
膜が遮断されていますが、アレイバッファー1を1.5 mlの最終体積に細胞溶解物の所望量を希釈します。
ロッキングプラットフォーム上で2〜8℃で一晩インキュベートする。最適な感度が必要ない場合は短いインキュベーション時間を用いてもよい。
慎重1X洗浄バッファー20mlで個々のプラスチックの容器に4ウェルマルチディッシュと場所から各膜を除去します。 4穴マルチディッシュは洗浄ステップを完了するために使用することはできません。脱イオン水または蒸留水で4穴マルチディッシュをすすぎ、完全に乾燥させます。
ロッキングプラットフォームシェーカー上で10分間1X洗浄バッファーで各メンブレンを洗浄します。 3回洗浄し、合計2回繰り返します。
バイアルラベルに希釈係数を使用して2 1X配列バッファーに抗ホスホ - チロシン - 西洋ワサビペルオキシダーゼ（HRP）検出バッファーで希釈します。 4穴マルチディッシュの各ウェルに希釈した溶液をピペットで2.0ミリリットル。
慎重に洗浄コンテナから各膜を除去します。過剰なバッファが膜から排出し、希釈した抗リン酸化チロシン-HRPを含む4穴マルチディッシュに膜を返すことができます。蓋付き井戸をカバーしています。
ロッキングプラットフォーム上で室温で2時間インキュベートする。
前述のように、各アレイを洗浄します。
中断されることなく残りの手順を完了します。慎重に洗浄コンテナから各膜を除去します。過剰なバッファが吸収紙の上下端をブロッティングにより膜から排出させます。上向きに識別番号が付いているプラスチックシートプロテクターに各膜を置きます。
準備ケミコン試薬のピペット1ミリリットルは、各膜上に均一に混ぜる。膜当たりケミコンの試薬ミックス未満の1ミリリットルを使用すると、不完全な膜のカバレッジになることがあります。ケミコン試薬1と2のためのいくつかの高強度の化学発光試薬の置換は、試薬に依存して増加又は減少させた背景信号のいずれかが発生することがあります。
慎重にプラスチックでカバーシートプロテクター。ゆっくり気泡を滑らかにし、ケミコンの試薬ミックスは、各膜の隅々に均等に分散されていることを確認してください。 1分間インキュベートします。
位置は、用紙の上部と膜を含有するプラスチックシートプロテクターの両側にタオルと慎重に過剰ケミコンの試薬ミックスを絞り出す。
上部プラスチックシートプロテクターを取り外し、慎重に吸収ラボが残っているケミコンの試薬ミックスをオフに滲み膜の上に拭いて横たわっていた。
底のプラスチックシートプロテクターに膜を残し、ラップを優しく気泡を滑らかにするために世話をして膜をカバーしています。膜やシートプロテクターが完全に包まれるように、シートプロテクターの背面の周囲に過剰なラップを包みます。
放射性同位元素の検出で使用されていないオートラジオグラフィーフィルムカセットに、上向きに識別番号を持つ膜を置きます。
1から10分間コダックバイオマックスライトフィルムに公開します。多重露光recommアール終了しました。代わりに、画像はこのようなケアストリームヘルスとして化学発光互換イメージャを使用して収集されてもよいイメージステーション4000ミリメートルのPRO。

3。データ解析

現像したフィルムに見られる正の信号がすばやくアレイ画像に透明のオーバーレイを配置し、この目的のためのコーナーで印刷基準スポットのペアで揃えることによって同定することができる。アレイ上のスタンプ識別番号が残っていた側に配置されるべきである。コントロールと捕捉抗体の位置は人間ホスホ-RTKアレイシートの付録に記載されています。
現像したフィルム上のピクセル密度は、エプソンパーフェクV750 Proなどの伝送モードのスキャナを使用して収集することができる。
適切な画像解析ソフトウェアプログラムを使用して、配列の各スポットで画素密度を解析するためのテンプレートを作成します。互換性のあるプログラムは、GE、ウェスタンビジョンSOFからImageQuantまたはArrayVisionソフトウェアが含まれていますプロファイラアレイ、バイオラッド数量ワン、Adobe Photoshopのは、NIH ImageJの、およびタンパク質シンプルAlphaViewをプロテオームに固有のテンプレートを使用しtware。
Microsoft Excelなどのプログラムでの操作のためのスプレッドシートファイルに信号値をエクスポートします。
各RTKを表す重複スポットのペアの平均信号（画素密度）を決定します。
各スポットからの平均バックグラウンド信号を減算します。バックグラウンド値として配列またはネガティブコントロールスポットのクリアなエリアからの信号を使用します。
サンプル間のRTKのリン酸化レベルの相対的な変化を決定するために、異なるアレイ上の対応する信号を比較してください。

4。代表的な結果

このプロトコルは、人間のホスホ-RTKアレイがRTKのリン酸化に対するリガンド刺激や阻害剤の効果をスクリーニングするために使用することができる方法を示しています。図1では、データは100 ngので処理し、処理しなかったMDA-MB-453細胞のために示されて/ mlの5分間rhNRG-β1/HRG-β1（HRG-β1）、または既知のErbBファミリー阻害剤前HRGβ1治療に^8月11日で前処理した。阻害剤の実験のために、細胞を1μMのHDS 029、200nMのPD 153035、または3時間の200 nMのSFM中、PD 158780と共にインキュベートした。各アレイは、ライセートの100μgとインキュベートした。リン酸化の増加は、ErbB2と、ErbB3のために観察され、ErbB4はキャプチャスポットHRG-β1を未処理の細胞を比較し、MDA-MB-453細胞を処理しています。前HRG-β1のインキュベーションにすべての3つのErbBファミリー選択的阻害剤で細胞を処理するには、ErbB2の量の削減、ErbB3の、そしてErbB4はリン酸化を引き起こした。

図2では、データがRTKのFGF R2を過剰発現することが知られて加藤III細胞のために示されている。この一連の実験では、加藤III細胞は前と治療〜100 ng / mlのrhFGF酸性（FGF）および1μg/ mlのヘパリン、またはFGF R選択的阻害剤で前処理した^12月15日で処理し、処理しなかったFGFおよびヘパリン。阻害剤PD173074、PD 161570、およびPD 166285は1μMの濃度で使用し、無血清培地中で3時間加藤III細胞と共にインキュベートした。未処理KATO III細胞のEGFとFGF R R2の両方の構成的リン酸化がありますが、FGF-R2のリン酸化の増加は、FGF治療時に観察された。 PD 173074、PD 161570、またはPD 166285で細胞をインキュベートして、FGF-R2およびEGF Rのリン酸化を減少をもたらした。これらの阻害剤は、FGF-Rファミリーメンバーのリン酸化に影響を知られているが、これらの結果は、阻害剤の特定の濃度は、この場合に例えばEGF Rなどの他のRTK、に与える影響を監視するためのヒューマン·ホスホ-RTKアレイの有用性を実証する。

図1。受容の誘導と阻害乳癌細胞におけるTorのチロシンキナーゼリン酸化プロテオームプロファイラ人間ホスホ-RTKアレイおよび対応するヒストグラムプロファイルからアレイ画像が表示されます。 MDA-MB-453細胞を未処理またはNRG-β1/HRG-β1で処理してRTK阻害剤で処理した。配列は、MDA-MB-453細胞におけるキナーゼリン酸化に対する阻害剤の影響を監視するために使用された。拡大図を表示するにはここをクリック。

図2。胃癌細胞における受容体チロシンキナーゼのリン酸化の誘導と抑制。プロテオームプロファイラ人間ホスホ-RTKアレイと対応するヒストグラムプロファイルからのアレイの画像が表示されます。加藤III細胞がUNTだったreatedまたはFGF酸性およびヘパリンで処理してRTK阻害剤で処理する。拡大図を表示するには、ここをクリックしてください。

参照

Henriksson、ML、エディン、S. Dahlin、AM Oldenborg、PA、オーバーグ、A.ヴァンGuelpen、B. Rutegard、J. Stenling、R.＆Palmqvistは、R.、大腸がん細胞は、結果の隣接する線維芽細胞を活性化するFGF1/FGFR3シグナリングと増加侵略インチアム。 J.病理。178、1387年から1394年（2011年）。
森下、A.、ゴング、J.、野村哲也、吉田宏Izuishi、K.、鈴木洋一、櫛田、Y.、羽場、R. D'Armiento、J.、＆正樹、 T·タンパク質配列の使用は、ヒト大腸癌の治療のためのターゲッティング受容体チロシンキナーゼを同定した。Intです。 J. Oncol 37、829から835（2010）。
Agaram NP、Laquaglia、MP、Ustun、B.、郭、T.ウォン、GC、ソッチ、ND、マキ、RGDeMatteo、RP、Besmer、P.＆Antonescu、小児の消化管間質腫瘍のCR分子特性。CLIN。癌解像度 14、3204から3215（2008）。
ストンメル、JM Kimmelman、交流、英、H. Nabioullin、R. Ponugoti AH、Wiedemeyer、R. Stegh AH、ブラドナー、JEリゴン、KL、ブレナン、C.チン、L.、＆ DePinhoは、受容体チロシンキナーゼのRAの同時活性化は、標的療法に対する腫瘍細胞の応答に影響を及ぼします。科学 。318、287から290（2007）。
Agarwalさん、S. Zerillo、C. Kolmakova、J.クリステンセン、JG、ハリス、LN、RIMM、DL DiGiovanna、MP＆スターンに対する耐性を持つ構成的に活性化肝細胞増殖因子受容体のDF協会（Met）の非小細胞肺癌細胞におけるデュアルEGFR/Her2阻害剤。Brである。 J.がん。100、941から949（2009）。
Dewaele、BM、フロリス、G. Finalet-Ferreiro、J.フレッチャー、CD Coindre、JMギユー、L. Hogendoorn、パソコン、Wozniak氏、A. Vanspauwen、V. Schoffski、P. Marynen、P. Vandenbergh、P. Sciot、R.＆Debiec-Rychter、M.、共同活性化PDGFRAとEGFRは、内膜肉腫の潜在的な治療標的である。がんResは70、7304から7314（2010）。
ユン、YK、キムは、HP、漢、SW、許、HS、ああ、DYイムSA、バン、YJ、＆キム、EGFRおよびMEK1 / 2阻害剤のTYの組み合わせは抑制EGFR/HER3-dependentによる相乗効果を示していますヒト胃癌細胞におけるAKT活性化。モル。がんTHER。8、2526年から2536年（2009年）。
フライ、DW、ネルソン、JM Slintak、V.ケラー、PR Rewcastle、GW、デニー、ワシントン、周、H.、＆ブリッジ、4のAJの生化学的および抗増殖特性 - [AR（アルク） - イルアミノ]ピリド、強力かつ特異的な上皮成長因子受容体チロシンキナーゼ阻害剤の新たな化学クラス。バイオケム。薬理学54、877から887（1997）。
BOS、M.、メンデルゾーン、J.キム、YM Albanell、J.フライ、DW＆Baselga、J. PD153035、チロシンキナーゼ阻害剤は、上皮成長因子受容体の活性化を抑制し、受容体の数の癌細胞の増殖を抑制する依存的。CLIN。癌解像度 3、2099年から2106年（1997年）。
ストール、SW、Kansra、S. Peshick、S.フライ、DW、レオポルド、WR Wiesenの、JF、Sibilia、M.、チャン、T. Werb、Z. Derynck、R.ワーグナー、EF、＆エルダー、正常および悪性のケラチノサイトに比べて皮膚のErbB受容体チロシンキナーゼのJTの差の利用率とローカライズ。新形成。3、339から350（2001）。
Klutchko、SR周、H.、ウィンターズ、RT、トラン、TP、橋、AJ Althau、IW、アマート、DM、エリオット、WL、ミード、マサチューセッツ、ロバーツ、BJ、フライ、DW、ゴンザレス、AJハーヴェイ、PJ、ネルソン、JM、シャーウッド、V.、漢、香港、ペイス、G. Smaill、JB、デニー、WA＆ショウォーター、HDのチロシンキナーゼ阻害剤。 19。 6-ALKチロシンキナーゼ受容体ErbBファミリーの不可逆的阻害剤として4-anilinoquinazolinesと4 anilinopyrido [3,4-d]ピリミジンのnyamides、J.メッド。ケム49、1475年から1485年（2006年）。
國井、K.デイビス、L. Gorenstein、J.、ハッチ、H.、矢代、M.ディ·バッコ、A. Elbi、C.＆Lutterbachのは、B. FGFR2増幅された胃癌細胞株はFGFR2を必要とするとERBB3成長と生存のために合図する。がんResは68、2340から2348（2008）。
周、W.、許、W·マクダーモット、U.ダット、A.、西安、W. Ficarro、SBチャン、J.、シャルマ、SV、ブルージュ、J.マイヤーソン、M. Settleman、J 。＆グレー、NS共有FGFRの阻害剤を作成するための構造誘導アプローチ。ケム。 BIOL 17、285から295（2010）。
PD 161570により、FGF-1受容体チロシンキナーゼ活性のバトリー、BL、ドハーティ、AM、ハンビー、JM、呂、GHケラー、P. Dahring、TK、黄、O.、Crickard、K.＆Panek RLの阻害、新たなタンパク質チロシンキナーゼ阻害剤。 生命科学62 143から150（1998）。
Panek、RL、呂GH、Klutchko、SR、バトリー、BL、Darhing、TK、ハンビー、JM Hallak、H.、ドハーティ、AM＆カイザー、PD 166285 の in vitro薬理特性評価における JA、新しいナノモル強力かつ広範に活性タンパク質チロシンキナーゼ阻害剤、J.薬理学。経験。 THER。283、1433年から1444年（1997年）。

Discussion

人間ホスホ-RTKは、RTKのリン酸化の変化をスクリーニングするためのウェスタン免疫沈降（IP）などの従来の方法に経済的かつ高速な代替手段です。この方法を使用すると、42ホスホ-RTKの相対的なレベルは、MDA-MB-453や加藤IIIの細胞溶解物の単一のサンプルを使用して同時にスクリーニングした。また、このアレイアッセイは、この方法の方がはるかに時間効率の複数のIP-西部劇を実行するよりも作り、2.5時間のハンズオンタイムを必要とした。化学発光検出法を用いることにより、一般的に欧米のデータを収集するために使用されるものを超えない特殊な機器は必要ありませんでした。配列は敏感であり、リガンドおよびインヒビター治療の両方によって引き起こされるリン酸化の変化を比較するために用いることができる。また、このメソッドは、オフターゲットのRTKに対する阻害剤選択性の評価を可能にします。肯定的なヒットはさらにELISAなどの定量的アッセイを用いて評価することができる。

効果的に変更するための画面に配列を採用するリンでは、いくつかの重要な実験のガイドラインに従う必要があります。まず、実験は適切なコントロールサンプルを含める必要があります。例えば、これらの実験では、MDA-MB-453や加藤IIIの溶解液に阻害剤の効果は、同じ日に準備ライセート試料で測定した。同じ実験内で収集された唯一の配列データは、サンプル処理の違い、インキュベーション時間、ピペット技法、または洗浄技術に起因する信号のばらつきを最小限にするために分析されるべきである。捕捉抗体が平行親和性を有するように選択されていなかったので、同じ膜上の2つの分析対象物との間の信号強度を比較することは、推奨されません。

Acknowledgments

この作品は、R＆D Systems社によって資金を供給された

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Human Phospho-RTK Array Kit	R&D Sytems	ARY001
Aprotinin	Sigma	A6279
Leupeptin	Tocris	1167
Pepstatin A	Tocris	1190
MDA-MB-453 cells
Kato III cells
Recombinant Human NRG1-beta 1/HRG1-beta 1 EGF Domain	R&D Systems	396-HB-050
Recombinant Human FGF acidic (aa 16-155)	R&D Systems	232-FA-025
Heparin	Sigma	H4784
HDS 029	Tocris	2646
PD 153035	Tocris	1037
PD 158780	Tocris	2615
PD 173074	Tocris	3044
PD 161570	Tocris	3724
PD 166285	Tocris	3785
BCA assay	Pierce	23225
Phosphate-Buffer Saline (PBS)
Pipettes and pipette tips
Gloves
Deionized or distilled water
Flat-tipped tweezers
Rocking platform shaker
Microcentrifuge
Plastic containers with the capacity to hold 50 ml			For washing arrays
Plastic transparent sheet protector
Plastic wrap
Absorbent lab wipes
Paper towels
Autoradiography cassette
Film developer
Kodak BioMax Light Film	Carestream Health	178 8207
Film developer
Image Station 4000MM PRO	Carestream Health		Chemiluminescence imager compatible with collection of western data may be used instead of film and a film developer.
Epson Perfection Scanner	Epson	V750 PRO	Flatbed scanner with transparency adaptor capable of transmission mode
Image Analysis Software	GE,WesternVision, BioRad, Adobe, NIH, Protein Simple, etc		ImageQuant, ArrayVision, Western Vision, Quantity One, Photoshop, ImageJ, AlphaView, or other compatible program
Microsoft Excel	Microsoft
Computer capable of running image analysis software and Microsoft Excel.