Les changements de profilage dans phosphorylation tyrosine kinase du récepteur à l'aide des puces à anticorps - Publicité

Summary

Tableaux Proteome anticorps profils sont un moyen pratique et économique pour détecter des changements dans la tyrosine kinase du récepteur (RTK) phosphorylation sans effectuer de nombreuses immunoprécipitation (IP) Westerns. Le tableau RTK ARY001 humain permet la mesure qualitative des RTK multiples dans un seul échantillon en utilisant une détection par chimiluminescence.

Abstract

Le dérèglement de la tyrosine kinase du récepteur (RTK) expression et la phosphorylation est fréquemment associée à la propagation développement et métastatique des cellules cancéreuses ^1-3. D'importants efforts ont été concentrés sur les inhibiteurs de développement pour cibler RTK spécifiques et interrompre les voies de signalisation aberrantes associées à des états pathologiques ^4-7. L'objectif de cette étude était de mesurer les effets d'un certain nombre d'inhibiteurs de la phosphorylation sur RTK. Cette étude a utilisé l'homme Phospho-RTK tableau, qui est un immunodosage en sandwich la membrane afin de surveiller les augmentations ou diminutions de la phosphorylation des RTK nombreux simultanément dans un seul échantillon. Dans cet essai, les deux RTK phosphorylée et non phosphorylée présente dans un échantillon de lysat sont capturées par des anticorps distincts imprimés en double à travers une membrane de nitrocellulose de la taille d'une lame de microscope. Après lavage, les tableaux sont mis à incuber avec des anticorps anti-phospho-tyrosine-peroxydase de raifort (HRP),qui prend en sandwich avec RTK phosphorylés capturés sur le tableau. Après une étape de lavage élimine les tableaux sont incubés avec des réactifs chimiluminescents. Signal produit à chaque spot réseau est proportionnelle à la quantité de phospho-protéine liée par chaque anticorps de capture. Dans ces expériences, les tableaux ont été utilisés pour mesurer les augmentations de la phosphorylation suite à une stimulation du ligand soit le cancer du sein MDA-MB-453 ou KATO III cellules cancéreuses gastriques, ainsi que pour caractériser une diminution de la phosphorylation associés au traitement des cellules avec des inhibiteurs sélectifs envers ErbB ou les membres de la famille FGF R.

Protocol

1. Préparation des échantillons

1. Recueillir des lysats de traitement, ligand traité, ou d'un inhibiteur et les cellules ligand traités suivant les directives de la fiche gamme Phospho-RTK humaines. Le tampon de lyse a été optimisé pour ce kit. La substitution des tampons de lyse autres peuvent affecter la performance finale du tableau. Pour éviter la dégradation protéolytique échantillon, ajouter 10 pg / ml d'aprotinine, 10 ug / ml de leupeptine, et 10 pg / ml pepstatine A du volume de tampon de lyse pour chaque préparation de lysat de cellules fraîches pour chaque utilisation.
2. Concentration lysat doit être mesurée à l'aide d'un acide bicinchoninique (BCA) de dosage. Concentration de l'échantillon peut être ajusté empiriquement pour une sensibilité optimale et faible bruit de fond. Une gamme de 100-300 mg de lysat est recommandé comme un point de départ.
3. Cycles gel / dégel des échantillons devraient être évités et la bonne conservation de lysats est nécessaire pour des performances optimales. Dégeler les échantillons de lysat sur la glace.

1. Apportez tous les composants du kit à température ambiante avant utilisation. Pour éviter la contamination, porter des gants pour effectuer les procédures.
2. Pipeter 2,0 ml de 1 tampon de tableau dans chaque puits de la 4-Eh bien Multi-vaisselle doit être utilisé. 1 Tampon tableau sert de tampon de bloc.
3. En utilisant des pinces à pointe plate, retirez chaque membrane à utiliser entre les feuilles de protection et les placer dans un puits de la 4-Eh bien Multi-vaisselle. Le numéro de réseau doit être orientée vers le haut.
4. Lors du contact avec 1 tampon Array, le colorant bleu dans les taches disparaissent, mais les anticorps de capture sont conservés dans leurs emplacements spécifiques.
5. Incuber pendant 1 heure sur une plate-forme à bascule. Orienter le plateau de telle sorte que chaque extrémité des roches tableau se termine à son puits. La surface de la matrice doit être complètement mouillée et couverte par un tampon de bloc.
6. Tandis que les membranes sont de blocage, diluer la quantité désirée de lysat cellulaire à un volume final de 1,5 ml de tampon 1 Array.
<li> Tampon tableau Aspirer 1 à partir des puits de la 4-Eh bien Multi-plat et ajouter des solutions de lysat dilué. Placez le couvercle sur le 4-Eh bien Multi-vaisselle.
7. Incuber une nuit à 2-8 ° C sur un agitateur oscillant. Un temps d'incubation plus courte peut être utilisée si la sensibilité optimale n'est pas nécessaire.
8. Détachez délicatement chaque membrane de la 4-Eh bien Multi-plat et le placer dans des conteneurs en plastique avec 20 ml de tampon de lavage 1X. Le 4-Eh bien Multi-vaisselle ne peut pas être utilisé pour compléter les étapes de lavage. Rincer le 4-Eh bien Multi-vaisselle avec de l'eau déminéralisée ou distillée et séchez soigneusement.
9. Laver chaque membrane avec le tampon de lavage 1X pendant 10 min sur un agitateur à bascule plate-forme. Répéter l'opération deux fois pour un total de 3 lavages.
10. Diluer l'anticorps anti-phospho-tyrosine-peroxydase de raifort tampon de détection (HRP) dans du tampon 1X tableau 2 en utilisant le facteur de dilution sur l'étiquette du flacon. Pipeter 2,0 ml de solution diluée dans chaque puits de la 4-Eh bien Multi-vaisselle.
11. Détachez délicatement chaque membrane de son récipient de lavage.Permettre le tampon en excès de s'écouler à partir de la membrane et la membrane retourne à la 4-multi-puits contenant la vaisselle dilué anti-phospho-tyrosine-HRP. Couvrir les puits avec le couvercle.
12. Incuber pendant 2 heures à température ambiante sur un agitateur oscillant.
13. Laver chaque baie comme décrit précédemment.
14. Effectuez les étapes restantes sans interruption. Détachez délicatement chaque membrane de son récipient de lavage. Permettre le tampon en excès de s'écouler à partir de la membrane en épongeant le bord inférieur sur du papier absorbant. Placer chaque membrane sur une feuille de matière plastique protecteur avec le numéro d'identification vers le haut.
15. Pipeter 1 ml du réactif préparé Chemi Mélanger uniformément sur chaque membrane. Utiliser moins de 1 ml de mélange de réactifs Chemi par membrane peut entraîner une couverture incomplète membrane. La substitution de certains réactifs à haute intensité de chimioluminescence de réactifs Chemi 1 et 2 peuvent provoquer soit augmenté ou fond signal diminué en fonction du réactif.
16. Soigneusement couvrir avec un plastiqueProtège-document. Doucement lisser les bulles d'air et d'assurer Mix Réactif Chemi est répartie uniformément à tous les coins de chaque membrane. Incuber pendant 1 min.
17. Serviettes en papier de position sur le dessus et les côtés du protecteur de feuille de plastique contenant les membranes et bien presser l'excès Mix Réactif Chemi.
18. Retirez le protecteur de feuille supérieure en plastique et posez avec soin un laboratoire essuie-tout absorbant au-dessus des membranes pour éponger tout restant Mix Réactif Chemi.
19. Laissant membranes sur le protecteur de feuille de plastique en bas, couvrir les membranes d'une pellicule plastique en prenant soin de lisser doucement les bulles d'air. Enroulez le wrap excès de plastique autour de l'arrière de la feuille de protection de sorte que les membranes et les protecteurs de feuilles sont complètement enveloppé.
20. Placer les membranes avec les numéros d'identification vers le haut, dans une cassette de film d'autoradiographie qui n'est pas utilisé avec la détection des isotopes radioactifs.
21. Exposer à la lumière du film Kodak BioMax pour 1-10 min. Expositions multiples sont recommterminé. Sinon, les images peuvent être recueillies à l'aide d'un imageur chimiluminescence compatible comme le Carestream Health Image Station 4000MM PRO.

3. Analyse des données

1. Signaux positifs observés sur le film développé peut être rapidement identifié en plaçant la superposition sur l'image de la transparence et de matrice en l'alignant avec les paires de points de référence imprimées dans les coins à cet effet. Le numéro d'identification estampé sur le tableau doit être placé sur le côté gauche avait. L'emplacement des commandes et des anticorps de capture est mentionnée dans l'annexe de la fiche gamme Phospho-RTK humaines.
2. Densités de pixels sur le film développé peut être recueillie à l'aide d'un scanner de mode de transmission tels que l'Epson Perfection V750 PRO.
3. Créer un modèle pour analyser la densité de pixel de chaque point du tableau en utilisant un programme d'imagerie appropriée des logiciels d'analyse. Programmes compatibles comprennent le logiciel ImageQuant ou ArrayVision de GE, sof Vision de l'Ouesttware avec des modèles spécifiques à protéome tableaux de profils, BioRad Quantité One, Adobe Photoshop, NIH ImageJ et AlphaView Protéines simple.
4. La valeur des exportations de signaux dans un fichier tableur pour manipuler dans un programme tel que Microsoft Excel.
5. Déterminer la moyenne du signal (densité de pixels) de la paire de points représentant chaque dupliquée RTK.
6. Soustraire un signal de fond moyenne de chaque spot. Utilisez un signal provenant d'une zone claire de l'ensemble ou des taches de contrôle négatif comme une valeur de fond.
7. Comparer les signaux correspondants sur des tableaux différents pour déterminer la variation relative des niveaux de phosphorylation RTK entre les échantillons.

4. Les résultats représentatifs

Ce protocole démontre comment l'homme Phospho-RTK réseau peut être utilisé pour cribler les effets de la stimulation du ligand et des inhibiteurs de la phosphorylation RTK. Dans la figure 1, les données sont indiquées pour MDA-MB-453 cellules qui ont été traitées, traitées avec 100 ng/ Ml rhNRG-β1/HRG-β1 (HRG-β1) pendant 5 min, ou pré-traités avec des inhibiteurs connus de la famille ErbB ^8-11 avant HRGβ1 traitement. Pour les expériences d'inhibition, les cellules ont été incubées avec 1 uM HDS 029, 200 nM PD 153035 ou 200 nM PD 158780 dans la GDF pendant trois heures. Chaque tableau a été incubé avec 100 pg de lysat. Une augmentation de la phosphorylation est observée pour ErbB2, ErbB3, ErbB4 et taches de capture lors de la comparaison avec les cellules non traitées HRG-β1 traitée MDA-MB-453 cellules. Le traitement des cellules avec les trois inhibiteurs sélectifs de la famille ErbB avant HRG-β1 incubation provoqué des réductions dans ErbB2, ErbB3, ErbB4 et de phosphorylation.

Dans la figure 2, les données sont indiquées pour les cellules Kato III connus pour surexprimer le FGF R2 RTK. Dans cette série d'expériences, les cellules Kato III n'ont pas été traités, traités avec 100 ng / ml rhFGF acide (FGF) et 1 ug / ml d'héparine, ou prétraitée avec le FGF R inhibiteurs sélectifs ^12-15 avant le traitement parFGF et de l'héparine. Le PD173074 inhibiteurs, PD 161570 et PD 166285 ont été utilisés à une concentration de 1 uM et incubées avec les cellules Kato III pour 3 heures dans un milieu sans sérum. Bien qu'il y ait une phosphorylation constitutive à la fois de l'EGF R et R2 FGF dans les cellules non traitées III KATO, une augmentation de la phosphorylation R2 FGF a été observée lors du traitement FGF. L'incubation des cellules avec PD 173074, PD 161570, PD 166285 ou entraîné une baisse de FGF R2 et R EGF phosphorylation. Bien que ces inhibiteurs sont connus affecter la phosphorylation des membres de la famille FGF R, ces résultats démontrent l'utilité de l'homme Phospho-RTK réseau pour surveiller l'effet d'une concentration spécifique de l'inhibiteur peut avoir sur d'autres RTK, tels que EGF R dans ce cas.

Figure 1. L'induction et l'inhibition de la réceptionteur phosphorylation de la tyrosine kinase dans les cellules cancéreuses du sein. images Array de Proteome Profiler homme Phospho-RTK tableaux et les profils correspondants histogramme sont affichés. MDA-MB-453 ont des cellules non traitées ou traitées avec des inhibiteurs de RTK suivie d'un traitement avec NRG-β1/HRG-β1. Le tableau a été utilisé pour surveiller les effets des inhibiteurs de la phosphorylation de la kinase MDA-MB-453 cellules. Cliquez ici pour agrandir la figure .

Figure 2. Images de tableaux d'induction et l'inhibition de la phosphorylation de tyrosine kinase du récepteur dans les cellules de cancer gastrique. D'un profileur Human Proteome Phospho-RTK réseau et les profils correspondants histogramme sont affichés. Kato cellules III étaient untréé ou traités avec des inhibiteurs de RTK suivi d'un traitement avec FGF acide et de l'héparine. Cliquez ici pour agrandir la figure .

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Discussion

The Human Phospho-RTK est une alternative économique et rapide aux méthodes traditionnelles telles que l'immunoprécipitation (IP) de l'Ouest pour les changements de dépistage de la phosphorylation RTK. En utilisant cette méthode, les niveaux relatifs de 42 phospho-RTK ont été projetés simultanément en utilisant un seul échantillon de cellules MDA-MB-453 ou un lysat de cellules Kato III. En outre, ce test tableau dont 2,5 heures de temps de manipulation, ce qui rend cette méthode beaucoup plus efficace que de temps effectuez plusieurs IP-Western. En utilisant une méthode de détection par chimiluminescence, aucun équipement spécialisé delà de ce qui est généralement utilisé pour recueillir des données occidentaux était nécessaire. Les tableaux sont sensibles et peuvent être utilisées pour comparer les changements de phosphorylation causées à la fois par ligand et le traitement inhibiteur. Cette méthode permet également l'évaluation de la sélectivité inhibiteur de hors-cible RTK. Réponses positives peuvent en outre être évaluée en utilisant un dosage quantitatif comme un test ELISA.

Pour utiliser efficacement des tableaux pour détecter des changementsde la phosphorylation, certaines lignes directrices clés expérimentaux doivent être suivies. Tout d'abord, les expériences devraient inclure des échantillons de contrôle appropriés. Par exemple, dans ces expériences l'effet des inhibiteurs de cellules MDA-MB-453 ou Kato III lysats ont été mesurées sur des échantillons de lysat préparés le jour même. Seules les données de tableau qui sont collectées au sein de la même expérience doit être analysé afin de minimiser les variations de signal en raison des différences de manipulation d'échantillon, le temps d'incubation, la technique de la pipette, ou la technique de lavage. Comparaison des intensités de signal entre deux analytes sur la même membrane n'est pas recommandé, car les anticorps de capture n'ont pas été sélectionnés pour avoir des affinités parallèles.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Human Phospho-RTK Array Kit	R&D Sytems	ARY001
Aprotinin	Sigma	A6279
Leupeptin	Tocris	1167
Pepstatin A	Tocris	1190
MDA-MB-453 cells
Kato III cells
Recombinant Human NRG1-beta 1/HRG1-beta 1 EGF Domain	R&D Systems	396-HB-050
Recombinant Human FGF acidic (aa 16-155)	R&D Systems	232-FA-025
Heparin	Sigma	H4784
HDS 029	Tocris	2646
PD 153035	Tocris	1037
PD 158780	Tocris	2615
PD 173074	Tocris	3044
PD 161570	Tocris	3724
PD 166285	Tocris	3785
BCA assay	Pierce	23225
Phosphate-Buffer Saline (PBS)
Pipettes and pipette tips
Gloves
Deionized or distilled water
Flat-tipped tweezers
Rocking platform shaker
Microcentrifuge
Plastic containers with the capacity to hold 50 ml			For washing arrays
Plastic transparent sheet protector
Plastic wrap
Absorbent lab wipes
Paper towels
Autoradiography cassette
Film developer
Kodak BioMax Light Film	Carestream Health	178 8207
Film developer
Image Station 4000MM PRO	Carestream Health		Chemiluminescence imager compatible with collection of western data may be used instead of film and a film developer.
Epson Perfection Scanner	Epson	V750 PRO	Flatbed scanner with transparency adaptor capable of transmission mode
Image Analysis Software	GE,WesternVision, BioRad, Adobe, NIH, Protein Simple, etc		ImageQuant, ArrayVision, Western Vision, Quantity One, Photoshop, ImageJ, AlphaView, or other compatible program
Microsoft Excel	Microsoft
Computer capable of running image analysis software and Microsoft Excel.