Application Notes

التنميط التغييرات في الفسفرة باستخدام مستقبلات التيروزين كيناز صالحة جسم - إعلان

Released: September 27, 2012 doi: 10.3791/4199

Greta J. Wegner¹, David J. Finkel¹, Amy E. James¹, Richard A. Krzyzek¹

¹Array Group, Assay Department, R&D Systems, Inc.

Summary

صفائف بروتيوم الأجسام المضادة التعريف هي وسيلة مريحة وفعالة من حيث التكلفة للكشف عن تغيرات في مستقبلات التيروزين كيناز (RTK) الفسفرة بدون تنفيذ العديد مناعي (IP) الغرب. وARY001 مجموعة RTK الإنسان يسمح لقياس النوعية من RTKs متعددة في عينة واحدة باستخدام الكشف لمعان كيميائي.

Abstract

ويرتبط في كثير من الأحيان التقلبات التعبير مستقبلات التيروزين (RTK) كيناز والفسفرة مع انتشار التنمية والمنتشر من الخلايا السرطانية. جهد كبير ^1-3 وقد تركز على تطوير مثبطات لاستهداف RTKs محددة ويقطع مسارات الإشارات الشاذة المرتبطة الحالات المرضية . كان ^4-7 والغرض من هذه الدراسة لقياس الآثار المترتبة على عدد مختار من مثبطات الفسفرة على RTK. تستخدم هذه الدراسة على الإنسان الفوسفات-RTK مجموعة، وهو غشاء المناعية شطيرة القائمة لرصد الزيادة أو النقصان في الفسفرة لRTKs العديد في وقت واحد في عينة واحدة. يتم التقاطها في هذا الاختبار، سواء RTKs فسفرته وunphosphorylated الموجودة في عينة المحللة من قبل الأجسام المضادة منفصلة طبع في تكرار عبر غشاء النيتروسليلوز حجم شريحة المجهر. بعد الغسيل، وحضنت مع صفائف مكافحة الفوسفات، التيروزين، الفجل البيروكسيديز (HRP)،التي السندويشات مع RTKs فسفرته القبض على مجموعة. بعد غسل خطوة الثانية، وحضنت مع صفائف الكواشف chemiluminescent. ولدت في إشارة كل بقعة مجموعة يتناسب مع كمية من البروتين الفوسفات ملزمة لكل الأجسام المضادة الطبيعية. في هذه التجارب، واستخدمت المصفوفات لقياس الزيادات في الفسفرة بعد التحفيز يجند من سرطان الثدي إما MDA-MB-453 أو KATO خلايا سرطان المعدة III، فضلا عن تميز انخفاض في الفسفرة المرتبطة علاج الخلايا مع مثبطات انتقائية نحو ErbB أو الأسرة R أعضاء جمعية جيل المستقبل.

Protocol

1. تحضير العينة

جمع لست] من دون علاج، وتعامل يجند المانع، أو خلايا ويجند تعامل اتباع الإرشادات الموجودة في ورقة البيانات مجموعة الفوسفات الإنسان RTK-. وقد تم تحسين المخزن المؤقت للتحلل هذه المجموعة. قد استبدال مخازن أخرى تؤثر على تحلل الأداء النهائي للمجموعة. لمنع تدهور بروتين عينة، إضافة 10 ميكروغرام / مل أبروتينين، 10 ميكروغرام / مل Leupeptin، و 10 ميكروغرام / مل Pepstatin A إلى حجم المخزن المؤقت المطلوبة للتحلل كل خلية إعداد المحللة جديدة لكل استعمال.
وينبغي قياس تركيز حمض المحللة باستخدام bicinchoninic (BCA) مقايسة. ويمكن تركيز عينة تجريبية لضبط حساسية الأمثل وخلفية منخفضة. ويوصى مجموعة من 100-300 ميكروغرام من المحللة كنقطة انطلاق الأولي.
وينبغي تجنب تجميد / الذوبان دورات العينات ومطلوب التخزين السليم للحصول على الأداء الأمثل لست]. ذوبان الجليد عينات المحللة المجمدة في الجليد.

الحمار = "jove_title"> 2. مجموعة الفحص

جمع كل مكونات عدة إلى درجة حرارة الغرفة قبل الاستخدام. لتجنب التلوث، وارتداء القفازات أثناء تنفيذ الإجراءات.
ماصة 2،0 مل من الاحتياطي صفيف 1 في كل بئر من الطبق متعددة 4-حسنا لاستخدامه. الاحتياطي صفيف 1 بمثابة منطقة عازلة كتلة.
باستخدام شقة بلاغ ملاقط، وإزالة كل الغشاء لاستخدامها من بين الأوراق واقية وقعت في بئر الطبق موضوع-4-حسنا. يجب أن يكون عدد مجموعة أن تواجه التصاعدي.
على اتصال مع العازلة صفيف 1، والصبغة الزرقاء من البقع تختفي، ولكن يتم الاحتفاظ الأجسام المضادة الطبيعية في مواقعها المحددة.
احتضان لمدة 1 ساعة على منصة هزاز. توجيه علبة بحيث يكون لكل مجموعة الصخور نهاية لانهاء جيدا في أعماله. وينبغي على سطح مبلل تماما مجموعة والتي تغطيها كتلة عازلة.
في حين أن الأغشية يتم حظر، يخفف من كمية المطلوبة من المحللة الخلوية إلى الحجم النهائي من 1.5 مل مع العازلة صفيف 1.
احتضان بين عشية وضحاها في C ° 2-8 على منصة هزاز. ويمكن استخدام الوقت أقصر الحضانة إذا كان غير مطلوب حساسية الأمثل.
إزالة بعناية كل غشاء من الطبق متعددة 4-حسنا ومكان في حاويات بلاستيكية الفردية مع 20 مل من الاحتياطي اغسل 1X. قد لا 4 حسنا موضوع متعدد طبق استخدامها لإكمال الخطوات يغسل. شطف 4-حسنا موضوع متعدد الطبق مع الماء منزوع الأيونات أو المقطر ويجف تماما.
يغسل كل الغشاء مع العازلة غسل 1X لمدة 10 دقيقة على شاكر منصة هزاز. كرر مرتين ليصبح المجموع من 3 غسلات.
تمييع مكافحة الفوسفات، التيروزين، الفجل البيروكسيديز العازلة الكشف (HRP) في المخزن المؤقت صفيف 1X 2 باستخدام عامل تخفيف على الملصق القارورة. ماصة 2.0 مل من محلول مخفف في كل بئر من طبق موضوع-4-حسنا.
إزالة بعناية كل غشاء من الحاويات غسل به.السماح لاستنزاف الفائض عازلة من الغشاء والعودة الغشاء إلى الطبق موضوع-4-حسنا تحتوي على الفوسفات المخفف المضادة لل-التيروزين-HRP. تغطية الآبار مع الغطاء.
احتضان لمدة 2 ساعة في درجة حرارة الغرفة على منصة هزاز.
يغسل كل مجموعة كما هو موضح سابقا.
أكمل الخطوات المتبقية دون انقطاع. إزالة بعناية كل غشاء من الحاويات غسل به. السماح لاستنزاف الفائض عازلة من الغشاء بواسطة النشاف الحافة السفلية على الورق ماصة. وضع كل الغشاء الحامي على ورقة من البلاستيك مع تحديد عدد مواجهة.
مزيج ماصة 1 مل من الكاشف كيماوية معدة بشكل متساو على كل الغشاء. قد تستخدم أقل من 1 مل من مزيج الكاشف كيماوية في الغشاء يؤدي إلى تغطية غير كاملة الغشاء. قد استبدال بعض الكواشف كثافة عالية chemiluminescent لالكواشف كيماوية 1 و 2 تسبب إما زيادة أو إشارة الخلفية تقلص تبعا لكاشف.
تغطية بعناية مع البلاستيكورقة حامي. تخفيف بلطف من أي فقاعات الهواء وضمان ينتشر كيماوية ميكس الكاشف بالتساوي إلى كل ركن من أركان كل الغشاء. احتضان لمدة 1 دقيقة.
المناشف ورقة موقف على أعلى وجوانب حامي ورقة من البلاستيك يحتوي على الأغشية والضغط الزائد بعناية ميكس الكاشف كيماوية.
إزالة الجزء العلوي حامي ورقة من البلاستيك، ووضع بعناية مختبر ماصة يمسح على رأس الأغشية لطخة من أي الكاشف كيماوية المتبقية ميكس.
ترك الأغشية على الحامي ورقة من البلاستيك أسفل، وتغطي الأغشية مع غلاف بلاستيكي مع الحرص على تخفيف بلطف من أي فقاعات الهواء. التفاف التفاف البلاستيك الزائدة حول الجانب الخلفي من الحامي ورقة بحيث يتم التفاف تماما الأغشية وحامي ورقة.
وضع الأغشية مع أرقام التعريف مواجهة، وذلك في تصوير الإشعاع الذاتي كاسيت الفيلم الذي لم يتم استخدام النظائر المشعة مع الكشف.
تعرض الفيلم لايت كوداك BioMax للدقيقة 1-10. التعرض لأخطار متعددة هي موصىانتهى. بدلا من ذلك، يتم جمع الصور باستخدام جهاز تصوير التوهج متوافق مثل الصحة Carestream صورة محطة 4000MM PRO.

3. تحليل البيانات

يمكن إشارات إيجابية تظهر على الفيلم وضعت حددت بسرعة عن طريق وضع تراكب الشفافية على الصورة ومجموعة جعله يتفق مع أزواج من البقع المرجعية المطبوعة في زوايا لهذا الغرض. يجب وضع رقم تعريف ختمها على مجموعة على الجانب الأيسر كان. يتم سرد الموقع من الضوابط والأجسام المضادة الطبيعية في الملحق من ورقة البيانات مجموعة الفوسفات الإنسان RTK-.
ويمكن جمع كثافة بكسل على الفيلم تطويرها باستخدام ماسح ضوئي انتقال وضع مثل إبسون V750 PRO الكمال.
إنشاء قالب لتحليل كثافة بكسل في كل بقعة من الصفيف باستخدام تحليل التصوير المناسبة برنامج حاسوبي. وتشمل البرامج برامج متوافقة ImageQuant أو ArrayVision من GE، الغربية SOF الرؤيةtware مع قوالب محددة لبروتيوم صالحة المحلل، BioRad الكمية واحد، أدوبي فوتوشوب، يماغيج NIH، وAlphaView البروتين البسيط.
تصدير القيم إشارة إلى ملف جدول بيانات للتلاعب في برنامج مثل Microsoft Excel.
تحديد إشارة المتوسط (كثافة البكسل) من زوج من البقع المكررة يمثل كل RTK.
طرح إشارة الخلفية متوسط من كل بقعة. استخدام إشارة واضحة من منطقة لمجموعة المراقبة السلبية أو بقع كقيمة الخلفية.
مقارنة الإشارات المقابلة على المصفوفات المختلفة لتحديد التغير النسبي في مستويات الفسفرة RTK بين العينات.

4. ممثل النتائج

هذا البروتوكول يوضح كيف يمكن استخدام الإنسان الفوسفات-RTK مجموعة لفحص آثار التحفيز يجند ومثبطات الفسفرة على RTK. في الشكل 1، وبيانات عن MDA-MB-453 التي كانت الخلايا غير المعالجة، وتعامل مع 100 نانوغرام/ مل rhNRG-β1/HRG-β1 (HRG-β1) لمدة 5 دقائق، أو ما قبل المعالجة مع مثبطات معروفة الأسرة ErbB ^8-11 قبل HRGβ1 العلاج. للتجارب المانع، وحضنت الخلايا مع 1 ميكرومتر HDS 029، 200 نانومتر PD 153035 أو 158780 PD 200 نانومتر في SFM لمدة ثلاث ساعات. وحضنت كل مجموعة مع 100 ميكروغرام من المحللة. لوحظ زيادة في الفسفرة لErbB3، ERBB2، والبقع القبض ErbB4 عند مقارنة مع الخلايا غير المعالجة HRG-β1 تعامل MDA-MB-453 الخلايا. تسبب في علاج الخلايا مع كل المثبطات الثلاثة ErbB الأسرة انتقائية قبل الحضانة-β1 HRG تخفيضات في ERBB2، ErbB3، والفسفرة ErbB4.

في الشكل 2، يتم عرض البيانات للخلايا III كاتو يعرف إلى overexpress على R2 FGF RTK. في هذه المجموعة من التجارب، كانت كاتو الخلايا غير المعالجة III، وتعامل مع 100 نانوغرام / مل rhFGF الحمضية (FGF) و 1 الهيبارين ميكروغرام / لتر، أو سابقة التجهيز مع مثبطات انتقائية FGF R ^12-15 قبل العلاج معFGF والهيبارين. تم استخدام مثبطات PD173074، PD 161570، 166285 وPD بتركيز من 1 ميكرومتر وحضنت مع الخلايا III كاتو لمدة 3 ساعة في وسائل الإعلام الحرة في الدم. في حين أن هناك الفسفرة التأسيسي للR EGF كل من جمعية جيل المستقبل وR2 في الخلايا غير المعالجة III KATO، وزيادة في الفسفرة R2 FGF لوحظ على العلاج FGF. احتضان الخلايا مع PD 173074، 161570 أدى PD، أو PD 166285 في انخفاض FGF R2 وEGF الفسفرة R. على الرغم من تعرف هذه مثبطات الفسفرة تؤثر على أعضاء جمعية جيل المستقبل الأسرة R، وهذه النتائج تثبت فائدة مجموعة الفوسفات-RTK الإنسان لرصد تأثير على تركيز محدد من المانع قد يترتب على RTKs أخرى، مثل R EGF في هذه الحالة.

الشكل 1. الحث وتثبيط رجبوتظهر تور الفسفرة التيروزين كيناز في خلايا سرطان الثدي. صور صفيف من التعريف صفائف بروتيوم الفوسفات-RTK الإنسان وملامح الرسم البياني المقابل. كانت MDA-MB-453 الخلايا غير المعالجة أو المعالجة مع مثبطات RTK تليها العلاج مع NRG-β1/HRG-β1. تم استخدام مجموعة لرصد آثار مثبطات كيناز على الفسفرة في MDA-MB-453 الخلايا. اضغط هنا لمشاهدتها بشكل اكبر شخصية .

الشكل 2. وتظهر الصور صفيف استقراء وتثبيط مستقبلات التيروزين كيناز الفسفرة في خلايا سرطان المعدة. من مجموعة الفوسفات التعريف RTK-بروتيوم الإنسان وملامح المناظرة الرسم البياني. كانت كاتو الخلايا III الاتحاد الوطني للعمالreated أو تعامل مع مثبطات RTK تليها العلاج مع الحمضية FGF والهيبارين. اضغط هنا لمشاهدتها بشكل اكبر شخصية .

مراجع

Henriksson، ML، إدين، S.، داهلين، AM، Oldenborg، PA، أوبيرغ، A.، فان Guelpen، B.، Rutegard، J.، Stenling، R.، وPalmqvist، R. خلايا سرطان القولون والمستقيم تنشيط الخلايا الليفية المجاورة مما أدى في إشارة وFGF1/FGFR3 الغزو المتزايد. صباحا. J. Pathol. 178، 1387-1394 (2011).
موريشيتا، A.، غونغ، J.، نومورا، T.، يوشيدا، H.، Izuishi، K.، سوزوكي، Y.، Kushida، Y.، هابا، R.، D'Armiento، J.، & ماساكي، T. استخدام البروتين لتحديد مجموعة كاينيسات مستقبلات التيروزين استهداف لعلاج سرطان القولون الإنسان. كثافة العمليات. J. Oncol 37، 829-835 (2010).
Agaram، NP، Laquaglia، MP، أوستون، B.، قوه، T.، وونغ، GC، Socci، ND، ماكي، RG،DeMatteo، RP، Besmer، P.، وAntonescu، CR التوصيف الجزيئي للأورام انسجة الجهاز الهضمي للأطفال. كلين. الدقة السرطان 14، 3204-3215 (2008).
Stommel، JM، Kimmelman، AC، يينغ، H.، Nabioullin، R.، Ponugoti، AH، Wiedemeyer، R.، Stegh، AH، برادنر، JE، Ligon، KL، برينان، C.، الذقن، L.، و DePinho، RA Coactivation من مستقبلات التيروزين كيناز يؤثر على استجابة الخلايا السرطانية إلى العلاجات المستهدفة. العلوم. 318، 287-290 (2007).
أغاروال، S.، Zerillo، C.، Kolmakova، J.، كريستنسن، JG، هاريس، LN، ريم، DL، DiGiovanna، MP، وشتيرن، DF رابطة تنشيط جوهري الكبدية مستقبلات عوامل النمو (الحد) مع المقاومة ل المانع المزدوج في EGFR/Her2 غير صغيرة الخلايا خلايا سرطان الرئة. برازيلي. J. السرطان. 100، 941-949 (2009).
Dewaele، BM، فلوريس، G.، Finalet-فيرييرو، J.، فليتشر، CD، Coindre، JM، غيو، L.، هوغندورن، PC، زنياك، A.، Vanspauwen، V.، Schoffski، P.، Marynen، P.، Vandenbergh، P.، Sciot، R.، وDebiec Rychter، M. PDGFRA المشارك المنشط و EGFR هي الأهداف العلاجية المحتملة في ساركومة باطنة. الدقة السرطان 70، 7304-7314 (2010).
يون، YK، كيم، HP، هان، SW، حور، HS، أوه، DY، ايم، SA، بانج، YJ، وكيم، TY مزيج من EGFR وMEK1 / 2 مثبط يظهر آثار التآزر من قمع EGFR/HER3-dependent AKT التنشيط في خلايا سرطان المعدة. مول. ذر السرطان. 8، 2526-2536 (2009).
جمهورية يوغوسلافيا الاتحادية، DW، نيلسون، JM، Slintak، V.، كيلر، PR، Rewcastle، GW، ديني، WA، تشو، H.، والجسور، والخصائص الكيميائية الحيوية وأنتيبروليفرتيف] AJ من 4 - [AR (ALK) ylamino] pyridopyrimidines، فئة جديدة من المواد الكيميائية قوية ومحددة عامل نمو البشرة مستقبلات التيروزين كيناز المانع. الكيميائية الحيوية. Pharmacol 54، 877-887 (1997).
بوس،M.، مندلسون، J.، كيم، YM، Albanell، J.، فراي، DW، وBaselga، J. PD153035، مثبط التيروزين كيناز، ويمنع البشرة مستقبلات عوامل النمو ويحول دون تفعيل نمو الخلايا السرطانية في رقم ومستقبلات تعتمد الطريقة. كلين. الدقة السرطان. 3، 2099-2106 (1997).
ستول، SW، Kansra، S.، Peshick، S.، فراي، DW، ليوبولد، WR، Wiesen، JF، Sibilia، M.، تشانغ، T.، Werb، Z.، Derynck، R.، واغنر، EF، والمسنين، JT استخدام التفاضلية وتوطين كاينيسات مستقبلات التيروزين ErbB في الجلد مقارنة مع الخلايا القرنية الطبيعية والخبيثة. الأورام. 3، 339-350 (2001).
Klutchko، SR، تشو، H.، وينترز، RT، تران، TP، الجسور، AJ، Althau، IW، أماتو، DM، إليوت، WL، ميد، MA، روبرتس، BJ، فراي، DW، غونزاليس، AJ، هارفي ، PJ، نيلسون، JM، شيروود، V.، هان، HK، بيس، G.، Smaill، JB، ديني، WA، وشوالتر، مثبطات التيروزين كيناز HD. 19. 6 ALKnyamides من anilinoquinazolines-4 و4-anilinopyrido [3،4-D] البريميدينات باسم مثبطات لا رجعة فيه من عائلة مستقبلات ErbB التيروزين كيناز. J. ميد. ك 49، 1475-1485 (2006).
Kunii، K.، ديفيس، L.، Gorenstein، J.، هاتش، H.، ياشيرو، M.، دي Bacco، A.، Elbi، C.، وLutterbach، B. FGFR2 تضخيم-خلية سرطان المعدة تتطلب خطوط FGFR2 ويشير Erbb3 للنمو والبقاء على قيد الحياة. الدقة السرطان 68، 2340-2348 (2008).
تشو، W.، حور، W. ماكديرموت، U.، دوت، A.، شيان، W.، Ficarro، SB، تشانغ، J.، شارما، SV، بروج، J.، ميرسون، M.، Settleman، J . ورمادي، NS A نهج هيكل موجهة لخلق مثبطات FGFR التساهمية. علم. بيول 17، 285-295 (2010).
باتلي، BL، دوهرتي، AM، Hamby، JM، لو، GH، كيلر، P.، Dahring، TK، هوانج، O.، Crickard، K.، وبانيك RL تثبيط النشاط FGF-1 عن طريق مستقبلات التيروزين كيناز PD 161570 ، وهو بروتين جديدالتيروزين كيناز مثبطات-. الحياة العلوم 62 143-150 (1998).
بانيك، RL، لو GH، Klutchko، SR، باتلي، BL، Darhing، TK، Hamby، JM، حلاق، H.، دوهرتي، AM، وكيسر، JA في المختبر توصيف الدوائية للPD 166285، وفعالة وجديدة nanomolar على نطاق واسع التيروزين كيناز المانع بالموقع البروتين. J. Pharmacol. إكسب. THER. 283، 1433-1444 (1997).

Discussion

الإنسان الفوسفات-RTK هو بديل اقتصادي وسريع إلى الطرق التقليدية مثل مناعي (IP) الغربية لإجراء تغييرات في الفسفرة RTK الفرز. باستخدام هذه الطريقة، تم فحص مستويات نسبية من 42 RTKs-الفوسفات في وقت واحد باستخدام عينة واحدة من MDA-MB-453 أو كاتو lysate الخلية III. وبالإضافة إلى ذلك، يتطلب هذا الاختبار مجموعة 2،5 ساعة من التدريب العملي في الوقت المحدد، مما يجعل هذه الطريقة أكثر فعالية من الوقت أداء متعددة IP-الغرب. من خلال استخدام طريقة الكشف لمعان كيميائي، كان مطلوبا لا يتجاوز ما المعدات المتخصصة وعادة ما تستخدم لجمع البيانات الغربية. صفائف حساسة، ويمكن استخدامه لمقارنة التغيرات في الفسفرة الناجمة عن كل من يجند والعلاج المانع. هذا الأسلوب يسمح أيضا تقييم الانتقائية مثبط لهدف خارج RTKs. ويمكن مشاهدة مزيد من التقييم الإيجابي باستخدام مقايسة الكمية مثل ELISA.

لتوظيف فعال للكشف عن صفائف التغييراتفي الفسفرة، ينبغي اتباع بعض الإرشادات الأساسية التجريبية. أولا، يجب أن تشمل التجارب عينات المقارنة الملائمة. على سبيل المثال، في هذه التجارب تم قياس تأثير مثبطات على MDA-MB-453 أو كاتو لست] على عينات المحللة III أعد في نفس اليوم. ينبغي تحليل بيانات مجموعة فقط التي يتم جمعها داخل نفس التجربة لتقليل الاختلافات في إشارة بسبب الاختلافات في التعامل مع عينة والوقت الحضانة، تقنية الماصة، أو تقنية الغسيل. لا ينصح شدة إشارة مقارنة بين اثنين من analytes على الغشاء نفسه، حيث أن عدم تحديد الأجسام المضادة لالتقاط الانتماءات المتوازية.

Acknowledgments

وقد تم تمويل هذا العمل من قبل شركة R & D، ونظم

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Human Phospho-RTK Array Kit	R&D Sytems	ARY001
Aprotinin	Sigma	A6279
Leupeptin	Tocris	1167
Pepstatin A	Tocris	1190
MDA-MB-453 cells
Kato III cells
Recombinant Human NRG1-beta 1/HRG1-beta 1 EGF Domain	R&D Systems	396-HB-050
Recombinant Human FGF acidic (aa 16-155)	R&D Systems	232-FA-025
Heparin	Sigma	H4784
HDS 029	Tocris	2646
PD 153035	Tocris	1037
PD 158780	Tocris	2615
PD 173074	Tocris	3044
PD 161570	Tocris	3724
PD 166285	Tocris	3785
BCA assay	Pierce	23225
Phosphate-Buffer Saline (PBS)
Pipettes and pipette tips
Gloves
Deionized or distilled water
Flat-tipped tweezers
Rocking platform shaker
Microcentrifuge
Plastic containers with the capacity to hold 50 ml			For washing arrays
Plastic transparent sheet protector
Plastic wrap
Absorbent lab wipes
Paper towels
Autoradiography cassette
Film developer
Kodak BioMax Light Film	Carestream Health	178 8207
Film developer
Image Station 4000MM PRO	Carestream Health		Chemiluminescence imager compatible with collection of western data may be used instead of film and a film developer.
Epson Perfection Scanner	Epson	V750 PRO	Flatbed scanner with transparency adaptor capable of transmission mode
Image Analysis Software	GE,WesternVision, BioRad, Adobe, NIH, Protein Simple, etc		ImageQuant, ArrayVision, Western Vision, Quantity One, Photoshop, ImageJ, AlphaView, or other compatible program
Microsoft Excel	Microsoft
Computer capable of running image analysis software and Microsoft Excel.