受体酪氨酸激酶磷酸化抗体阵列分析变化 - 广告

Summary

蛋白质组的探查抗体阵列是一个方便和符合成本效益的方式来筛选受体酪氨酸激酶（RTK）的磷酸化的变化，没有进行的众多免疫沉淀（IP）的西部片。 ARY001人类的RTK阵列允许多个RTK的采用化学发光检测在单个样品的定性测量。

Abstract

受体酪氨酸激酶（RTK）的表达和磷酸化的失调是经常与癌细胞的发展和转移扩散^。1-3很大的努力一直专注于开发抑制剂，针对特定的RTK和中断的异常信号转导通路与疾病状态^4-7本研究的目的是测量的影响RTK磷酸化抑制剂对一些选定的。本研究利用人的磷酸化的RTK阵列，这是一个膜基于夹心免疫监视的增加或减少的磷酸化，为众多的RTK同时在单个样品。在该试验中，出现的裂解物样品中的磷酸化和未磷酸化的RTK的捕获由离散重复跨硝酸纤维素膜在显微镜载玻片大小印刷的抗体。洗涤后，将阵列中温育的抗磷酸 - 酪氨酸 - 辣根过氧化物酶（HRP），三明治阵列上的捕获与磷酸化的RTK。阵列的第二洗涤步骤，都与化学发光试剂孵育。每个阵点产生的信号是正比于磷酸化的蛋白质的量的约束，每个捕获抗体。在这些实验中，阵列被用来衡量任MDA-MB-453乳腺癌或KATO III胃癌细胞，以及表征跌幅的磷酸化与朝向ErbB受体选择性的抑制剂处理过的细胞的配体刺激后，在磷酸化的增加或成纤维细胞生长因子R家族的成员。

Protocol

1。样品制备

1. 收集裂解液未经处理的，配体处理，或抑制剂和配体处理过的细胞按照人的磷酸化RTK阵列数据表中的准则。本试剂盒裂解缓冲液进行了优化。其他裂解缓冲液的替代可能会影响到最终的阵列性能。为了防止样品降解的蛋白水解，加10微克/毫升抑肽酶，10微克/毫升亮抑酶肽，和10微克/毫升胃酶抑素A所需的每个细胞裂解液的制备每次使用新鲜的裂解缓冲液的体积。
2. 溶胞产物的浓度应使用二辛可宁酸（BCA）法测定。样品浓度可以根据经验调整，以获得最佳灵敏度和低背景。一个被推荐为最初的出发点范围为100-300微克的细胞裂解液。
3. 冻结/解冻周期的样品，应避免和妥善储存裂解所需的最佳性能。在冰上解冻裂解样品。

1. 把所有的试剂至室温后方可使用。为了避免污染，戴上手套，在执行程序。
2. 阵列的缓冲液1到4井的多盘的各孔中以使用2.0毫升移液管。阵列的缓冲液1，作为一个块缓冲器。
3. 用平头镊子，删除每个膜被用于从在4井的多盘的井之间的保护片和地点。该数组数应朝上。
4. 在接触阵列的缓冲液1，蓝染的斑点就会消失，但捕获抗体保留在他们的具体位置。
5. 孵育1小时摇摆的平台上。东方托盘，使每个阵列岩石年底结束其良好的。阵列的表面，应完全润湿和覆盖的块缓冲器。
6. 虽然膜的阻塞，细胞溶胞产物的所需量的稀释到最终体积为1.5毫升与阵列的缓冲液1，。
<李>吸液数组缓冲区1井的4井多道菜和，加入稀释裂解解决方案。将盖4多菜。
7. 在2-8°C孵育过夜摇摆的平台上。也可以使用更短的温育时间，不是必需的，如果最佳灵敏度。
8. 小心地取出每4井多道菜和地方保护膜，成单个的塑料容器中，用20毫升的洗涤缓冲液。该4井多盘可能无法用于完成洗涤步骤。 4井多道菜用蒸馏水或去离子水冲洗，并彻底晾干。
9. 每10分钟摇摆平台振动筛膜，洗涤缓冲液洗净。重复两次，共洗3次。
10. 稀释的抗磷酸 - 酪氨酸 - 辣根过氧化物酶（HRP）的检测缓冲液中1X的阵列缓冲器2小瓶标签上使用的稀释因子。 2.0毫升稀释的溶液用移液管进入4-井的多盘的各孔中。
11. 从洗容器中，小心地取出每一个膜。允许多余的缓冲区，从膜中排出并返回膜4井多维菜含有稀释的抗磷酸化酪氨酸-HRP。用盖子盖住井。
12. 的摆动平台上，在室温下孵育2小时。
13. 每个阵列洗净如前所述。
14. 完成剩余的步骤，而不用中断。从洗容器中，小心地取出每一个膜。让多余的缓冲把水从上吸水纸的下缘杂交膜。将每个膜在塑料片上的保护器与朝上的识别号码。
15. 吸取1毫升的制备化学试剂混合均匀地分布到每一个膜。使用小于1毫升的的CHEMI试剂混合每膜可能会导致不完整的膜覆盖。换人CHEMI试剂1和2的一些高强度的化学发光试剂，既可能导致背景增加或减少的信号，根据使用的试剂。
16. 小心盖好，用塑料表保护。轻轻抚平任何气泡，并确保化学试剂混合均匀分布，每个膜的各个角落。孵育1分钟。
17. 顶部和两侧的塑料片保护膜的位置纸巾小心地挤压出过量的化学试剂混合。
18. 取出最上面的塑料片保护和仔细奠定吸水抹布擦拭顶部的膜涂抹任何剩余的化学试剂混合。
19. 留在底部的塑料片保护膜，覆盖膜，用保鲜膜护理，轻轻地消除任何气泡。用过量的保鲜膜，使膜和片材保护完全包裹的片材保护周围的背面。
20. 将膜与朝上的识别号码，是没有使用放射性同位素检测，在放射自显影胶片盒。
21. 暴露在柯达的标美光薄膜为1-10分钟。多重曝光RECOMM结束。可替换地，图像可以被收集如Carestream Health公司使用兼容化学发光成像仪 图片站4000MM PRO。

3。数据分析

1. 显影的胶片上所见到的阳性信号，可以快速识别阵列上的图像，并通过将重叠的透明度，它与对印刷在用于此目的的角部的参考点对齐。应被放置在阵列上的冲压识别号码，在左侧有副作用。人类的磷酸化RTK阵列数据表的附录中列出的位置控制和捕获抗体。
2. 像素密度上开发的薄膜，如爱普生Perfection V750 PRO扫描仪使用传输模式，可以收集。
3. 创建一个模板来分析的像素密度在每一个点的数组，使用适当的图像分析软件程序。兼容的计划包括ImageQuant或ArrayVision软件从GE，西方视野SOFtware特定蛋白质组探查器阵列，BioRad公司数量，Adobe公司的Photoshop，NIH ImageJ的，蛋白质简单AlphaView的模板。
4. 输出信号值操纵在一个程序中，如Microsoft Excel电子表格文件。
5. 确定的平均信号（像素密度）对重复点代表每个RTK。
6. 减去平均每个点的背景信号。使用信号作为背景值的数组或阴性对照点的空白区域。
7. 比较不同的阵列上相应的信号，以确定样本之间的RTK磷酸化水平的相对变化。

4。代表性的成果

此协议演示如何人权磷酸化的RTK阵列可被用于筛选RTK磷酸化的配位体的刺激和抑制剂的影响。在图1中，数据被显示的MDA-MB-453细胞，未经处理的，用100纳克/毫升rhNRG-β1/HRG-β1的（HRG-β1）为5分钟，或预先用已知ErbB家族抑制剂^8-11前HRGβ1治疗。对于抑制剂的实验中，将细胞温育用1μMHDS 029，200纳米PD 153035，或200纳米PD 158780在SFM3小时的。每个阵列孵育的细胞裂解物用100微克。为表达ErbB2，ErbB3的磷酸化的增加，观察到，和ErbB4的捕捉点，比较时，未经处理的细胞与HRG-β1的处理的MDA-MB-453细胞。与所有三个ErbB家族HRG-β1孵化前的选择性抑制剂处理细胞造成减少表达ErbB2，ErbB3的，和ErbB4磷酸化。

在图2中，数据被示为加藤III细胞已知的过量表达的RTK FGF R2。在这组实验中，加藤III细胞未经处理的处理之前，用100纳克/毫升rhFGF酸性（FGF）和1μg/ ml的肝素，或与FGFŕ选择性抑制剂^12-15预处理成纤维细胞生长因子和肝素。的抑制剂PD173074，PD 161570和PD 166285，使用的浓度为1μM和孵育中Kato III细胞在无血清介质中的3小时。虽然是两个表皮生长因子R和FGF R2未处理KATO III细胞组成型磷酸化，增加在FGF R2磷酸化时观察到成纤维细胞生长因子的治疗。培养的细胞PD 173074 PD 161570 PD 166285 R2 FGF和EGFŕ磷酸化降低。虽然这些抑制剂是已知的影响的磷酸化的FGF R家族成员，这些结果表明人类的磷酸化的RTK效果监测特定浓度的抑制剂可以具有对其他的RTK的，在这种情况下，如EGFŕ阵列的效用。

图1。的诱导和抑制受体器在乳腺癌细胞中的酪氨酸激酶磷酸化蛋白质组探查人类的磷酸化RTK阵列和对应的直方图分布的阵列图像显示。 MDA-MB-453细胞，未经处理或处理随后治疗NRG-β1/HRG-β1RTK抑制剂。该数组是用来监测MDA-MB-453细胞中的蛋白激酶磷酸化的抑制剂的影响。 点击此处查看大图 。

图2。在胃癌细胞中的受体酪氨酸激酶磷酸化的诱导和抑制。阵列探查人类蛋白质组磷酸化RTK阵列和相应的直方图配置文件中的图像显示。加藤III细胞UNTreated或成纤维细胞生长因子酸性和肝素治疗RTK抑制剂治疗。 点击此处查看大图 。

参考文献

1. 邱显，ML，爱丁堡，S.，大林，AM，Oldenborg，PA，奥伯格，A.，凡Guelpen，B.，Rutegard，J.，Stenling，R.，＆Palmqvist，R.大肠癌细胞激活邻近的成纤维细胞产生在FGF1/FGFR3信令和增加入侵。病理学。178，1387年至1394年（2011年）。
2. 森下，A.，龚，J.，野村，T.，吉田，H.，Izuishi，K.，铃木，Y.，栉田，Y.，哈巴，R.，D'Armiento，J.，＆正树， T.蛋白质芯片的使用，以确定定位的受体酪氨酸激酶为治疗人类结肠癌。肿瘤学37，829-835（2010）。
3. NP，Agaram，的Laquaglia，MP，Ustun，B.，郭，T.，黄，GC，索奇，ND，牧，RG，DeMatteo RP，Besmer，P.，＆安东内斯库，CR分子小儿胃肠道间质肿瘤的临床表征。癌症14，3204-3215（2008）。
4. Stommel，JM，基姆尔曼，AC，英，H.，Nabioullin，R.，Ponugoti，AH，Wiedemeyer，R.，Stegh，AH，布拉德纳，JE，利根，KL，布伦南，C.，下巴，L.，＆ DePinho，RA共同作用的受体酪氨酸激酶会影响肿瘤细胞的反应，有针对性的治疗。 科学 318，287-290（2007）。
5. 阿加瓦尔，S.，泽里洛，Kolmakova，J.，克里斯滕森，JG，哈里斯，LN，RIMM，DL，DiGiovanna，MP，和斯特恩，DF协会与阻力的组成性激活的肝细胞生长因子受体（MET）双EGFR/HER2抑制剂在非小细胞肺癌细胞与Br。 J.癌症。100，941-949（2009）。
6. Dewaele，BM，弗洛里，G.， - 费雷罗Finalet，J.，弗莱彻，CD，Coindre，JM，古洛，：L.，Hogendoorn，PC，沃兹尼亚克，A.，Vanspauwen，五，Schoffski，P.，Marynen，P.，Vandenbergh，P.，Sciot，R.，＆Debiec Rychter，M.共激活P​​DGFRA EGFR是潜在的治疗靶点血管内膜肉瘤癌症研究，70，7304-7314（2010）。
7. 尹，YK，金，HP，汉，SW，户珥，HS，呵呵，DY，我，SA，爆炸，YJ，金，TY相结合的表皮生长因子受体和MEK1 / 2抑制剂的协同效应，通过抑制EGFR/HER3-dependent AKT的活化在人胃癌细胞分子。癌症疗法。，2526年至2536年（2009年）。
8. 弗莱，DW，尼尔森，JM，Slintak，V.，凯勒，PR，鲁卡斯尔，GW，丹尼，WA，周，H.，＆桥梁，AJ生化和抗增殖4 - [AR（ALK）氨基] pyridopyrimidines一种新的化学有效和具体的表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂类。 生化。药理学 54，877-887（1997）。
9. 博斯M.，门德尔松，J.，金YM，Albanell，J.，弗莱，DW，巴塞尔加，J. PD153035，一种酪氨酸激酶抑制剂，可以防止表皮生长因子受体激活和抑制癌细胞生长的受体的数量依赖性。 临床。癌症研究 3，二零九九年至二一○六年（1997年）。
10. ：SW，斯托尔，Kansra，S.，Peshick，S.，弗莱，DW，利奥波德，WR，维森，JF，Sibilia，M.，章研究，Werb，Z.，Derynck，R.，瓦格纳，EF，及老人，ErbB受体酪氨酸激酶JT利用差异化和本地化的皮肤比正常的和恶性的角质细胞瘤。3，339-350（2001）。
11. Klutchko，SR，周，H.，冬天，RT，陈德良，TP，桥梁，AJ，Althau，IW，阿马托，DM，埃利奥特，WL，米德，MA，罗伯茨，BJ，炒，DW，冈萨雷斯，AJ，哈维，PJ，尼尔森，JM，西华，V.，韩，香港，吴佩慈，G.，Smaill，JB，丹尼，WA，与沙氏，HD酪氨酸激酶抑制剂。 19。 6-ALKnyamides ErbB家族的酪氨酸激酶受体的不可逆抑制剂的4 -苯胺基和4 - anilinopyrido [3,4-d]嘧啶。J.医学。 49，1475年至1485年（2006年）。
12. 国井，K.戴维斯，L.，Gorenstein内，J.，舱口盖，H.，八城政基，M.，Di Bacco酒店，A.，ELBI，C.，＆Lutterbach，B. FGFR2放大胃癌细胞株需要FGFR2和ErbB3信号的生长和存活的癌症研究。68，2340年至2348年（2008年）。
13. 周户珥，W.麦克德莫特，U.，杜特，A.，西安，W.，Ficarro，SB，张，J.，夏尔马，SV，布鲁日，J.，迈耶森，M.，Settleman，J，W，灰色，NS创造共价FGFR抑制剂的结构引导的方法。;生物学17，285-295（2010）。
14. 巴特利，BL，多尔蒂，AM，汉比，JM，陆，GH，凯勒，P.，Dahring，TK，黄某，O.，Crickard，K.，＆Panek RL FGF-1受体酪氨酸激酶活性的抑制PD 161570 ，一种新的蛋白酪氨酸激酶抑制剂。 生命科学 62，143-150（1998）。
15. Panek，RL，陆GH，Klutchko，SR，巴特利，BL，Darhing，TK，汉比，JM，哈拉克，H.，多尔蒂，AM，与凯泽的PD 166285，JA 在体外药理特性，一个新的纳摩尔强有力的和广泛活性蛋白酪氨酸激酶抑制剂。J.药理学。进出口。进一步。283，1433年至1444年（1997年）。

Discussion

人类的磷酸化RTK是一种既经济又快速替代传统的方法，如免疫沉淀（IP）西方筛选RTK磷酸化的变化。 42磷酸化的RTK的相对水平，使用这种方法，同时使用一个单一的对MDA-MB-453或加藤III细胞裂解物样品进行了筛选。此外，该阵列检测需要2.5小时的时间，使得这种方法更多的时间效益比进行多个IP-西部片的。通过采用化学发光检测方法，没有专门的设备超出通常用于收集西部数据是必要的。阵列是敏感的，可用于比较两个配位体和抑制剂的治疗引起的磷酸化的变化。这种方法也允许脱靶的RTK抑制剂选择性的评价。可进一步使用如用ELISA定量测定评价的正命中。

为了有效地使用数组屏幕的变​​化磷酸化，一些关键的实验指导方针应该得到遵守。首先，实验中应包括适当的对照样品。例如，在这些实验中，对MDA-MB-453或加藤III裂解物的抑制剂的效果，测定溶解物样品制备在同一天。应该只有阵列内的相同的实验收集的数据进行分析，以尽量减少信号由于在样品处理中的差异，培养时间，移液管的技术，或洗涤技术的变化。在同一膜的两种分析物之间的比较信号强度是不推荐的，因为捕获抗体被选择为具有平行的亲和力。

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Human Phospho-RTK Array Kit	R&D Sytems	ARY001
Aprotinin	Sigma	A6279
Leupeptin	Tocris	1167
Pepstatin A	Tocris	1190
MDA-MB-453 cells
Kato III cells
Recombinant Human NRG1-beta 1/HRG1-beta 1 EGF Domain	R&D Systems	396-HB-050
Recombinant Human FGF acidic (aa 16-155)	R&D Systems	232-FA-025
Heparin	Sigma	H4784
HDS 029	Tocris	2646
PD 153035	Tocris	1037
PD 158780	Tocris	2615
PD 173074	Tocris	3044
PD 161570	Tocris	3724
PD 166285	Tocris	3785
BCA assay	Pierce	23225
Phosphate-Buffer Saline (PBS)
Pipettes and pipette tips
Gloves
Deionized or distilled water
Flat-tipped tweezers
Rocking platform shaker
Microcentrifuge
Plastic containers with the capacity to hold 50 ml			For washing arrays
Plastic transparent sheet protector
Plastic wrap
Absorbent lab wipes
Paper towels
Autoradiography cassette
Film developer
Kodak BioMax Light Film	Carestream Health	178 8207
Film developer
Image Station 4000MM PRO	Carestream Health		Chemiluminescence imager compatible with collection of western data may be used instead of film and a film developer.
Epson Perfection Scanner	Epson	V750 PRO	Flatbed scanner with transparency adaptor capable of transmission mode
Image Analysis Software	GE,WesternVision, BioRad, Adobe, NIH, Protein Simple, etc		ImageQuant, ArrayVision, Western Vision, Quantity One, Photoshop, ImageJ, AlphaView, or other compatible program
Microsoft Excel	Microsoft
Computer capable of running image analysis software and Microsoft Excel.