Profilering Ændringer i receptortyrosinkinase Phosphorylering anvendelse af antistof Arrays - Advertisement

Summary

Proteome Profiler antistof arrays er en praktisk og omkostningseffektiv måde at screene for ændringer i receptor (RTK) phosphorylering uden at udføre talrige immunpræcipitering (IP) Westerns. Den ARY001 Humant RTK matrix muliggør kvalitativ måling af flere RTK'er i en enkelt prøve ved anvendelse af kemiluminescens-detektion.

Abstract

Den dysregulering af receptor (RTK) udtryk og phosphorylering er ofte forbundet med udviklingen og metastatisk spredning af kræftceller. ^1-3 Betydelig indsats har været fokuseret på udvikling af inhibitorer til at målrette specifikke RTK'er og afbryde de afvigende signalveje i forbindelse med sygdom stater . ^4-7 Formålet med denne undersøgelse var at måle virkningerne af et udvalgt antal af inhibitorer på RTK phosphorylering. Denne undersøgelse anvendte Human Phospho-RTK-array, hvilket er en membran baseret sandwich-immunassay til overvågning stigninger eller fald i phosphorylering for adskillige RTK'er samtidigt i en enkelt prøve. I dette assay udgør både phosphorylerede og ikke-phosphoryleret RTK'er i en lysatprøve opfanges af diskrete antistoffer trykt i to eksemplarer på en nitrocellulosemembran på størrelse med et objektglas. Efter vask grupperingerne inkuberet med anti-phospho-tyrosin-peberrodsperoxidase (HRP),som sandwich med phosphorylerede RTK'er fanget på opstillingen. Efter et andet vasketrin, bliver arrays inkuberes med kemiluminescerende reagenser. Signal genereret ved hvert array stedet er proportional med mængden af ​​phospho-protein bundet af hvert indfangningsantistof. I disse eksperimenter blev arrays anvendes til at måle stigninger i phosphorylering efter ligandstimulering af enten MDA-MB-453 breast cancer eller KATO III gastrisk carcinomceller samt at karakterisere fald i phosphorylering i forbindelse med behandling af celler med inhibitorer selektive mod ErbB eller FGF R familiemedlemmer.

Protocol

1. Prøvefremstilling

1. Saml lysater fra ubehandlet, ligand behandlet, eller inhibitor og ligand behandlede celler at følge retningslinjerne i den menneskelige Phospho-RTK-array dataark. Lysisbufferen er optimeret til dette kit. Substitution af andre lyse puffere kan påvirke den endelige udførelse af arrangementet. At hindre proteolytisk prøve nedbrydning, tilsættes 10 ug / ml aprotinin, 10 ug / ml leupeptin og 10 pg / ml pepstatin A til omfanget af lysisbuffer kræves for hvert cellelysat præparat frisk til hver anvendelse.
2. Lysat koncentration skal måles ved bicinchoninsyre (BCA)-assay. Prøvekoncentration kan empirisk justeres for optimal følsomhed og lav baggrund. Et udvalg af 100-300 ug af lysat anbefales som en første udgangspunkt.
3. Fryse / tø cykler af prøver bør undgås og forsvarlig opbevaring af lysater er nødvendig for at opnå optimal ydeevne. Optø frosne lysatprøver på is.

1. Lad alle kitkomponenter til stuetemperatur før brug. For at undgå forurening, bære handsker mens de udfører procedurerne.
2. Pipette 2,0 ml Array puffer 1 i hver brønd af 4-Well Multi-skål, der skal anvendes. Array Buffer 1 tjener som en blok puffer.
3. Brug flad spids pincet, hver membran, der skal anvendes fra mellem de beskyttende plader og sted i en brønd i 4-Well Multi-fad fjerne. Grupperingen nummer skal vende opad.
4. Ved kontakt med Array puffer 1, vil det blå farvestof fra pletter forsvinder, men indfangnings-antistoffer forbliver i deres specifikke steder.
5. Der inkuberes i 1 time på en vippende platform. Orient bakken, så hvert array rocks ende til ende i sin brønd. Overfladen af ​​grupperingen skal være helt befugtet, og er omfattet af blokbuffer.
6. Medens membranerne blokerer, fortyndes den ønskede mængde cellulært lysat til et slutvolumen på 1,5 ml med Array Buffer 1.
<li> Aspirer Array Buffer 1 fra brøndene i den 4-Well Multi-fad og tilføje fortyndede lysate løsninger. Sæt låget på den 4-Well Multi-skål.
7. Inkuber natten over ved 2-8 ° C på en vippende platform. En kortere inkubationstid kan anvendes, hvis optimal følsomhed ikke er påkrævet.
8. Fjern forsigtigt hver membran fra den 4-Well Multi-fad og anbringes i individuelle plastbeholdere med 20 ml 1X vaskebuffer. 4-Well Multi-skål kan ikke anvendes til at udføre vasketrin. Skyl 4-Well Multi-skål med deioniseret eller destilleret vand og tør grundigt.
9. Vask hver membran med 1X vaskebuffer i 10 min på en vippende platform shaker. Gentag to gange for i alt 3 vaske.
10. Fortynd anti-phospho-tyrosin-peberrodsperoxidase (HRP) påvisning puffer i 1X Array Buffer 2 under anvendelse fortyndingsfaktoren på mærkaten. Pipette 2,0 ml fortyndet opløsning til hver brønd i 4-Well Multi-skål.
11. Omhyggeligt fjerne hver membran fra vask beholder.Så overskydende puffer dryppe ud af membranen og returnere membranen til 4-Well Multi-skål med den fortyndede anti-phospho-tyrosin-HRP. Dæk brøndene med låget.
12. Der inkuberes i 2 timer ved stuetemperatur på en vippende platform.
13. Vask hver opstilling som beskrevet tidligere.
14. Gennemfør de sidste trin uden afbrydelse. Omhyggeligt fjerne hver membran fra vask beholder. Så overskydende puffer dryppe ud af membranen ved at duppe den nedre kant på absorberende papir. Placer hver membran på et stykke plastik sikkerhedsvest med identifikationsnummeret opad.
15. Pipetter 1 ml af den fremstillede Chemi reagensblanding jævnt på hver membran. Anvendelse af mindre end 1 ml Chemi reagensblanding pr membran kan resultere i ufuldstændig dækning membran. Substitution af nogle højintensive kemiluminescerende reagenser til Chemi Reagenser 1 og 2 kan forårsage enten forøget baggrund eller formindsket signal afhængigt af reagenset.
16. Omhyggeligt dække med en plastark protektor. Forsigtigt udglatte eventuelle luftbobler og sikre Chemi reagensblanding spredes jævnt til alle hjørner af hver membran. Inkuberes i 1 min.
17. Position Paper håndklæder på top og sider af plastfolie protektor indeholdende membranerne og omhyggeligt presse overskydende Chemi Reagent Mix.
18. Fjern det øverste plastfolie beskytter og omhyggeligt lægge et absorberende lab tør på toppen af ​​membranerne til duppes off enhver tilbageværende Chemi Reagent Mix.
19. Forlader membraner på den nederste plastfolie protektor, dække membranerne med plast wrap tage sig til forsigtigt at udglatte eventuelle luftbobler. Wrap overskydende plastfolie omkring bagsiden af ​​arket beskytter således at membranerne og ark protector er fuldstændigt indpakket.
20. Anbring membranerne med identifikationsnumrene opad, i en autoradiografifilm kassette, der ikke anvendes med radioaktiv isotop detektion.
21. Udsættes for Kodak BioMax Light film til 1-10 min. Flere engagementer er anbefslut. Alternativt kan billederne blive indsamlet ved hjælp af en kemiluminescens kompatibel imager såsom Carestream Health Image Station 4000mm PRO.

3. Dataanalyse

1. Positive signaler ses på fremkaldte film hurtigt kan identificeres ved at placere gennemsigtighed overlay på arrayet billedet og tilpasse det med parrene af reference-spots trykt i hjørnerne til dette formål. Den stemplede identifikationsnummer på arrayet skal placeres på venstre havde side. Placeringen af ​​kontrol og capture-antistoffer er opført i tillægget af Human Phospho-RTK-array dataark.
2. Pixel tætheder på fremkaldte film kan indsamles ved hjælp af en transmission-mode scanner, såsom Epson Perfection V750 PRO.
3. Oprette en skabelon til at analysere pixeltæthed i hver plet af array ved hjælp af en passende billedbehandling analyse software program. Kompatible programmer omfatter ImageQuant eller ArrayVision software fra GE, Western Vision software med skabeloner er specifikke for proteom Profiler Arrays, BioRad Mængde One, Adobe Photoshop, NIH ImageJ, og Protein Simple AlphaView.
4. Eksport signalværdier til et regneark fil til manipulation i et program som Microsoft Excel.
5. Bestemme den gennemsnitlige signal (pixeltæthed) af parret af dublerede pletter repræsenterer hver RTK.
6. Subtrahere en gennemsnitlig baggrundssignalet fra hver plet. Anvende et signal fra et klart område i arrayet eller negativ kontrol pletter som en baggrundsværdi.
7. Sammenlign tilsvarende signaler på forskellige arrays for at bestemme den relative ændring i RTK phosphorylering niveauer mellem prøver.

4. Repræsentative resultater

Denne protokol viser, hvordan det humane Phospho-RTK array kan anvendes til screening af virkningen af ​​ligand stimulation og inhibitorer på RTK phosphorylering. I figur 1 er data vist for MDA-MB-453 celler, der var ubehandlet, behandlet med 100 ng/ Ml rhNRG-β1/HRG-β1 (HRG-β1) i 5 minutter, eller forbehandlet med kendte ErbB familie inhibitorer ^8-11 før HRGβ1 behandling. For inhibitor eksperimenter blev cellerne inkuberet med 1 uM HDS 029, 200 nM PD 153035, eller 200 nM PD 158780 i SFM i tre timer. Hvert array blev inkuberet med 100 ug af lysat. En stigning i phosphorylering observeres for ErbB2, ErbB3 og ErbB4 opsamling pletter, når de sammenlignede ubehandlede celler med HRG-β1 behandlet MDA-MB-453-celler. Behandlingen af ​​cellerne med alle tre ErbB familien selektive inhibitorer før HRG-β1 inkubation forårsagede reduktioner i ErbB2, ErbB3 og ErbB4 phosphorylering.

I figur 2 er data vist for Kato III-celler vides at overudtrykke RTK FGF R2. I dette sæt forsøg var Kato III-celler ubehandlet, behandlet med 100 ng / ml rhFGF sur (FGF) og 1 ug / ml heparin, eller forbehandlet med FGF R selektive inhibitorer ^12-15 inden behandling medFGF og heparin. The inhibitorer PD173074, PD 161570, PD 166285 og blev anvendt ved en koncentration på 1 uM og inkuberet med Kato III cellerne i 3 timer i serumfrit medium. Mens der er konstitutiv phosphorylering af både EGF R og FGF R2 i ubehandlede KATO III-celler, en forøgelse af FGF R2 phosphorylering blev observeret ved FGF behandling. Inkubering af cellerne med PD 173074, resulterede PD 161570, PD 166285 eller i nedsat FGF R2 og EGF R phosphorylering. Skønt disse inhibitorer er kendte påvirker phosphorylering af FGF R familiemedlemmer, disse resultater viser anvendeligheden af ​​det humane Phospho-RTK-array til overvågning af virkningen af ​​en specifik koncentration af inhibitor kan have på andre RTK'er, såsom EGF R i dette tilfælde.

Figur 1. Induktion og hæmning af modtator tyrosinkinase phosphorylering i brystkræftceller. Array billeder fra Proteome Profiler Menneskelige Phospho-RTK arrays og de ​​tilsvarende histogram profiler er vist. MDA-MB-453-celler var ubehandlede eller behandlet med RTK-inhibitorer efterfulgt af behandling med NRG-β1/HRG-β1. Grupperingen blev brugt til at overvåge virkningerne af inhibitorer på kinase phosphorylering i MDA-MB-453 celler. Klik her for at se større figur .

Figur 2. Induktion og inhibering af receptor-tyrosinkinase phosphorylering i gastriske cancerceller. Array billeder fra en Proteome Profiler Humant Phospho-RTK-array og de ​​tilsvarende histogram profiler er vist. Kato III celler var UNTreated eller behandlet med RTK-hæmmere efterfulgt af behandling med FGF sure og heparin. Klik her for at se større figur .

Referencer

1. Henriksson, ML, Edin, S., Dahlin, AM, Oldenborg, PA, Oberg, A., Van Guelpen, B., Rutegard, J., Stenling, R., & Palmqvist, R. Colorectal kræftceller aktivere tilstødende fibroblaster følge i FGF1/FGFR3 signalering og øget invasion. Am. J. Pathol. 178, 1387-1394 (2011).
2. Morishita, A., Gong, J., Nomura, T., Yoshida, H., Izuishi, K., Suzuki, Y., Kushida, Y., Haba, R., D'Armiento, J., & Masaki, T. Anvendelse af protein-array til at identificere målrettelige receptortyrosinkinaser til behandling af human coloncancer. Int. J. Oncol. 37, 829-835 (2010).
3. Agaram, NP, Laquaglia, MP, Ustun, B., Guo, T., Wong, GC, Socci, ND, Maki, RG,DeMatteo, RP, Besmer, P., & Antonescu, CR Molekylær karakterisering af pædiatriske gastrointestinale stromale tumorer. Clin. Cancer Res. 14, 3204-3215 (2008).
4. Stommel, JM, Kimmelman, AC, Ying, H., Nabioullin, R., Ponugoti, AH, Wiedemeyer, R., Stegh, AH, Bradner, JE, Ligon, KL, Brennan, C., Chin, L., & DePinho, RA Coactivation af receptortyrosinkinaser påvirker responset af tumorceller til målrettede behandlinger. Science. 318, 287-290 (2007).
5. Agarwal, S., Zerillo, C., Kolmakova, J., Christensen, JG, Harris, LN, Rimm, DL, DiGiovanna, MP, & Stern, DF Association of konstitutivt aktiveret hepatocytvækstfaktor-receptoren (Met) med resistens over for en dobbelt EGFR/Her2 inhibitor i ikke-småcellet lungekræft celler. Br. J. Cancer. 100, 941-949 (2009).
6. Dewaele, BM, Floris, G., Finalet-Ferreiro, J., Fletcher, CD, Coindre, JM, Guillou, L., Hogendoorn, PC, Wozniak, A., Vanspauwen, V., Schoffski, P., Marynen, P., Vandenbergh, P., Sciot, R., & Debiec-Rychter, M. Co-aktiverede PDGFRA og EGFR er potentielle terapeutiske mål i intimal sarkom. Cancer Res. 70, 7304-7314 (2010).
7. Yoon, YK, Kim, HP, Han, SW, Hur, HS, Oh, DY, Im, SA, Bang, YJ, & Kim, TY Kombination af EGFR og MEK1 / 2 inhibitor viser synergieffekter ved at undertrykke EGFR/HER3-dependent AKT aktivering i humane gastriske cancerceller. Mol. Kræft Ther. 8, 2526-2536 (2009).
8. Fry, DW, Nelson, JM, Slintak, V., Keller, PR, Rewcastle, GW, Denny, WA, Zhou, H., & Bridges, AJ Biokemiske og antiproliferative egenskaber af 4 - [Ar-(alk) ylamino] pyridopyrimidines, en ny kemisk klasse af potente og specifikke epidermisvækstfaktor-receptortyrosinkinase-inhibitor. Biochem. Pharmacol. 54, 877-887 (1997).
9. Bos,M., Mendelsohn, J., Kim, YM, Albanell, J., Fry, DW, og Baselga, J. PD153035, en tyrosinkinaseinhibitor, forhindrer epidermal vækstfaktorreceptor aktivering og inhiberer vækst af cancerceller i en receptor række- afhængig måde. Clin. Cancer Res. 3, 2099-2106 (1997).
10. Stoll, SW, Kansra, S., Peshick, S., Fry, DW, Leopold, WR, Wiesen, JF, Sibilia, M., Zhang, T., Werb, Z., Derynck, R., Wagner, EF, og Elder, JT Differential udnyttelse og lokalisering af ErbB-receptor-tyrosinkinaser i huden sammenlignet med normale og maligne keratinocyter. neoplasi. 3, 339-350 (2001).
11. Klutchko, SR, Zhou, H., Winters, RT, Tran, TP, Bridges, AJ, Althau, IW, Amato, DM, Elliott, WL, Meade, MA, Roberts, BJ, Fry, DW, Gonzales, AJ, Harvey , PJ, Nelson, JM, Sherwood, V., Han, HK, Pace, G., smaill, JB, Denny, WA, og Showalter, HD tyrosinkinaseinhibitorer. 19. 6-alknyamides af 4-anilinoquinazolines og 4-anilinopyrido [3,4-d] pyrimidiner som irreversible inhibitorer af ErbB familien af tyrosinkinasereceptorer. J. Med. Chem. 49, 1475-1485 (2006).
12. Kunii, K., Davis, L., Gorenstein, J., Hatch, H., Yashiro, M., Di Bacco, A., ELBI, C., & Lutterbach, B. FGFR2-amplificerede gastriske cancercellelinier kræver FGFR2 og ErbB3 signalering for vækst og overlevelse. Cancer Res. 68, 2340-2348 (2008).
13. Zhou, W., Hur, W. McDermott, U., Dutt, A., Xian, W., Ficarro, SB, Zhang, J., Sharma, SV, Brugge, J., Meyerson, M., Settleman, J . & Gray, NS En struktur-guidet tilgang til at skabe covalente FGFR inhibitorer. Chem. Biol. 17, 285-295 (2010).
14. Batley, BL, Doherty, AM, Hamby, JM, Lu, GH, Keller, P., Dahring, TK, Hwang, O., Crickard, K., & Panek RL Inhibering af FGF-1-receptor-tyrosinkinaseaktivitet ved PD 161570 , et nyt protein-Tyrosinkinase-inhibitor. Life Sci. 62 143-150 (1998).
15. Panek, RL, Lu GH, Klutchko, SR, Batley, BL, Darhing, TK, Hamby, JM, Hallak, H., Doherty, AM, og Keiser, JA In vitro farmakologisk karakterisering af PD 166.285, en ny nanomolær potent og bredt aktivt protein tyrosinkinasehæmmer. J. Pharmacol. Exp. Ther. 283, 1433-1444 (1997).

Discussion

The Human Phospho-RTK er en økonomisk og hurtig alternativ til traditionelle metoder såsom immunoprecipitation (IP) Western til screening ændringer i RTK phosphorylering. Under anvendelse af denne fremgangsmåde blev de relative niveauer af 42 phospho-RTK'er screenes samtidigt ved anvendelse af en enkelt prøve af MDA-MB-453 eller Kato III cellelysat. Derudover krævede dette array assay 2,5 time af hands-on tid, hvilket gør denne metode langt mere tid effektiv end at udføre flere IP-westerns. Ved anvendelse af en kemiluminescens-detektion fremgangsmåde blev der ikke specialudstyr, end hvad der typisk anvendes til at indsamle vestlige data påkrævet. Arrays er følsomme og kan anvendes til at sammenligne ændringer i phosphorylering forårsaget af både ligand og inhibitor behandling. Denne metode giver også mulighed for evaluering af inhibitor selektivitet til off-target RTK'er. Positive tilfælde kan yderligere vurderes ved hjælp af et kvantitativt assay, såsom et ELISA.

For effektivt at ansætte arrays til at screene for ændringeri phosphorylering, bør nogle vigtige eksperimentelle retningslinjer følges. Først skal forsøgene omfatte passende kontrolprøver. For eksempel virkningen af ​​inhibitorer på MDA-MB-453 eller Kato III lysater i disse eksperimenter blev målt på lysatprøver fremstillet samme dag. Kun array-data, der indsamles inden for samme eksperiment bør analyseres for at minimere variationer i signalet på grund af forskelle i prøvehåndtering, inkubationstid, pipette teknik eller vask teknik. Sammenligning af signalintensiteter mellem to analytter på samme membran kan ikke anbefales, idet indfangnings-antistoffer ikke er blevet udvalgt til at have parallelle affiniteter.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Human Phospho-RTK Array Kit	R&D Sytems	ARY001
Aprotinin	Sigma	A6279
Leupeptin	Tocris	1167
Pepstatin A	Tocris	1190
MDA-MB-453 cells
Kato III cells
Recombinant Human NRG1-beta 1/HRG1-beta 1 EGF Domain	R&D Systems	396-HB-050
Recombinant Human FGF acidic (aa 16-155)	R&D Systems	232-FA-025
Heparin	Sigma	H4784
HDS 029	Tocris	2646
PD 153035	Tocris	1037
PD 158780	Tocris	2615
PD 173074	Tocris	3044
PD 161570	Tocris	3724
PD 166285	Tocris	3785
BCA assay	Pierce	23225
Phosphate-Buffer Saline (PBS)
Pipettes and pipette tips
Gloves
Deionized or distilled water
Flat-tipped tweezers
Rocking platform shaker
Microcentrifuge
Plastic containers with the capacity to hold 50 ml			For washing arrays
Plastic transparent sheet protector
Plastic wrap
Absorbent lab wipes
Paper towels
Autoradiography cassette
Film developer
Kodak BioMax Light Film	Carestream Health	178 8207
Film developer
Image Station 4000MM PRO	Carestream Health		Chemiluminescence imager compatible with collection of western data may be used instead of film and a film developer.
Epson Perfection Scanner	Epson	V750 PRO	Flatbed scanner with transparency adaptor capable of transmission mode
Image Analysis Software	GE,WesternVision, BioRad, Adobe, NIH, Protein Simple, etc		ImageQuant, ArrayVision, Western Vision, Quantity One, Photoshop, ImageJ, AlphaView, or other compatible program
Microsoft Excel	Microsoft
Computer capable of running image analysis software and Microsoft Excel.