Profilering Veranderingen in receptor tyrosine kinase Fosforylatie met behulp van antilichamen Arrays - Advertentie

Summary

Proteoom Profiler antilichaam arrays zijn een gemakkelijke en kosteneffectieve manier om het scherm voor de veranderingen in de receptor tyrosine kinase (RTK) fosforylering zonder het uitvoeren van een groot aantal immunoprecipitatie (IP) Westerns. De ARY001 Human RTK matrix maakt het kwalitatieve meting van meerdere RTK's in een monster met behulp chemiluminescentiedetectie.

Abstract

De ontregeling van receptor tyrosine kinase (RTK) expressie en fosforylering wordt vaak geassocieerd met de ontwikkeling en metastase van kankercellen. ^1-3 aanzienlijke inspanning is gericht op het ontwikkelen van specifieke remmers RTKs richten en de afwijkende signaalwegen geassocieerd met ziekten onderbreken . ^vier-zeven Het doel van deze studie was om de effecten van een select aantal remmers op RTK fosforylering te meten. Deze studie gebruikte Human Phospho-RTK matrix, een membraan gebaseerde sandwich immunoassay een toename of afname van fosforylatie gelijktijdig controleren voor talrijke RTKs in een enkel monster. In deze assay, zowel gefosforyleerd en niet-gefosforyleerd RTKs aanwezig in een lysaat monster worden opgevangen door afzonderlijke antilichamen gedrukt in tweevoud over een nitrocellulosemembraan de grootte van een microscoopglaasje. Na het wassen worden de arrays geïncubeerd met anti-fosfo-tyrosine-mierikswortelperoxidase (HRP),die sandwiches met gefosforyleerde RTKs vastgelegd op de array. Na een tweede wasstap worden de arrays geïncubeerd met chemiluminescent reagens. Signaal gegenereerd om elk array spot is evenredig met de hoeveelheid van fosfo-eiwit gebonden door elke capture antilichaam. In deze experimenten werden arrays aangewend om fosforylatie te meten na ligand stimulatie van ofwel MDA-MB-453 borstkanker of KATO III cellen maagkanker, alsmede afname van fosforylering in verband met de behandeling van cellen met selectieve remmers richting ErbB karakteriseren of FGF R familieleden.

Protocol

1. Monstervoorbereiding

1. Verzamel lysaten van onbehandelde, ligand behandeld, of remmer en ligand behandelde cellen volgens de richtlijnen in de Human Phospho-RTK-array datasheet. De lysis buffer is geoptimaliseerd voor deze kit. De substitutie van andere lysis buffers kunnen de uiteindelijke resultaten van de array. Voor proteolytische afbraak monster voorkomen, voeg 10 ug / ml aprotinine, 10 ug / ml leupeptine, en 10 ug / ml pepstatine A het volume lysisbuffer voor elke cellysaat bereiding vers voor elk gebruik.
2. Lysaat concentratie wordt gemeten met een bicinchoninic zuur (BCA) assay. Monsterconcentratie kunnen empirisch worden aangepast voor een optimale gevoeligheid en lage achtergrond. Een reeks van 100-300 ug van lysaat wordt aanbevolen als een eerste uitgangspunt.
3. Vorst / dooi cycli van de monsters moet worden vermeden en de juiste opslag van lysaten is vereist voor optimale prestaties. Ontdooi bevroren lysaatmonsters op ijs.

1. Breng alle componenten van de kit op kamertemperatuur voor gebruik. Om verontreiniging te voorkomen, draag handschoenen tijdens het uitvoeren van de procedures.
2. Pipetteer 2,0 ml Array Buffer 1 in elk putje van de 4-Well Multi-schotel te gebruiken. Array Buffer 1 dient als buffer blok.
3. Met behulp van een flatscreen-tip pincet, verwijdert u elk membraan om gebruikt te worden van tussen de beschermende platen en plaats in een goed van de 4-Well Multi-schotel. De array-nummer moet naar boven gericht.
4. Bij contact met Array Buffer 1, zal de blauwe kleurstof van de spots verdwijnt maar de invangantilichamen blijven in hun specifieke locaties.
5. Incubeer gedurende 1 uur op een schommelende platform. Plaats de lade, zodat elke array rotsen begin tot het einde in zijn goed. Het oppervlak van de array volledig bevochtigd en onder blokbuffer.
6. Terwijl de membranen blokkeren verdunnen gewenste hoeveelheid cellulaire lysaat tot een eindvolume van 1,5 ml met Array Buffer 1.
<li> Zuig Array buffer 1 uit de putjes van de 4-Well Multi-schotel en voeg verdund lysaat oplossingen. Plaats het deksel op de 4-Well Multi-schotel.
7. Incubeer overnacht bij 2-8 ° C op een schommelende platform. Een kortere incubatietijd kan worden gebruikt als optimale gevoeligheid is niet vereist.
8. Verwijder voorzichtig elk membraan van de 4-Well Multi-schotel en plaats in afzonderlijke plastic containers met 20 ml 1X wasbuffer. De 4-Well Multi-schotel kan niet worden gebruikt om wasstappen voltooien. Spoel de 4-Well Multi-schotel met gedeïoniseerd of gedestilleerd water en goed afdrogen.
9. Was elk membraan met 1X wasbuffer gedurende 10 minuten op een schommelende platform shaker. Herhaal twee keer voor een totaal van 3 wasbehandelingen.
10. Verdun de anti-fosfo-tyrosine-mierikswortel peroxidase (HRP) detectie-buffer in 1X Array Buffer 2 met behulp van de verdunningsfactor op het etiket van de flacon. Pipetteer 2,0 ml van de verdunde oplossing in elk putje van de 4-Well Multi-schotel.
11. Verwijder voorzichtig elk membraan van haar wassen container.Overtollig buffer voor de afvoer van het membraan en het membraan naar het 4-Well Multi-schotel met de verdunde anti-fosfo-tyrosine-HRP. Bedek de wells met het deksel.
12. Incubeer 2 uur bij kamertemperatuur op een schommelende platform.
13. Was elk array zoals eerder beschreven.
14. Voer de overige stappen zonder onderbreking. Verwijder voorzichtig elk membraan van haar wassen container. Laat overtollige buffer om uit het membraan afvoer door te deppen de onderkant op absorberend papier. Plaats elke membraan op een plastic beschermer het identificatienummer naar boven.
15. Pipetteer 1 ml van de bereide Chemi Reagent Meng gelijkmatig op elk membraan. Gebruik van minder dan 1 ml van Reagens Chemi Mix per membraan kunnen onvolledige membraan dekking. Vervanging van een aantal hoge intensiteit chemiluminescent reagens voor Chemi Reagens 1 en 2 kan een toegenomen of verminderde achtergrond signaal afhankelijk van het reagens.
16. Voorzichtig bedekken met een plasticblad beschermer. Voorzichtig en trek zo alle luchtbellen en zorgen voor Chemi Reagens Mix is ​​gelijkmatig verspreid naar alle uithoeken van elk membraan. Incubeer gedurende 1 min.
17. Position paper handdoeken op bovenkant en zijkanten van plastic beschermer die de membranen en zorgvuldig knijp het overtollige Chemi Reagens Mix.
18. Verwijder de bovenste plastic beschermer en zorgvuldig lag een absorberend lab vegen op de top van de membranen te wissen uit de resterende Chemi Reagens Mix.
19. Het verlaten van membranen aan de onderkant plastic beschermer, betrekking hebben op de membranen met plastic omslag en zorg ervoor dat voorzichtig glad te strijken eventuele luchtbellen. Wikkel de overtollige kunststof wikkel rond de achterzijde van het vel beschermer zodat de membranen en platen beschermer volledig verpakt.
20. Plaats de membranen met de identificatienummers naar boven, in een autoradiografie film cassette die niet wordt gebruikt om radioactieve isotoop detectie.
21. Blootstellen aan Kodak BioMax Licht film voor 1-10 minuten. Meervoudige belichting zijn aanbevelingbeëindigd. Als alternatief kan beelden worden verzameld met behulp van een chemiluminescentie compatibele imager, zoals de Carestream Health Afbeelding Station 4000MM PRO.

3. Data-analyse

1. Positieve signalen waargenomen op de ontwikkelde film kan snel worden geïdentificeerd door het plaatsen van de transparantie overlay op de array beeld en gelijk met de paren van referentie spots gedrukt in de hoeken voor dit doel. De gestempelde identificatienummer op de array worden geplaatst aan de linker kant had. De locatie van controles en capture antilichamen is opgenomen in de bijlage van het Human Phospho-RTK-array datasheet.
2. Pixel dichtheden op de ontwikkelde film kunnen worden verzameld met behulp van een transmissie-mode scanner, zoals de Epson Perfection V750 PRO.
3. Maak een sjabloon om pixeldichtheid te analyseren in elke plek van de array met behulp van een geschikte beeldvormende analyse software programma. Compatibele programma's omvatten ImageQuant of ArrayVision software van GE, West-Vision software met sjablonen die specifiek zijn voor Profiler Arrays, BioRad Hoeveelheid One, Adobe Photoshop, NIH ImageJ, en Protein Simple AlphaView proteoom.
4. Exporteren signaalwaarden naar een spreadsheet-bestand voor manipulatie in een programma zoals Microsoft Excel.
5. Bepaal het gemiddelde signaal (pixel dichtheid) van het paar dubbele spots die elk RTK.
6. Trek een gemiddelde achtergrond signaal van elke plek. Gebruik een signaal van een lege plaats in matrix of negatieve controle spots als achtergrondwaarde.
7. Vergelijk overeenkomstige signalen op verschillende arrays de relatieve verandering in fosforylatie RTK niveaus tussen monsters te bepalen.

4. Representatieve resultaten

Dit protocol toont hoe de Human Phospho-RTK matrix kan worden gebruikt om de effecten van ligand stimulatie en remmers screenen op RTK fosforylering. In Figuur 1 worden gegevens getoond voor MDA-MB-453 cellen die waren behandeld, behandeld met 100 ng/ Ml rhNRG-β1/HRG-β1 (HRG-β1) gedurende 5 min, of voorbehandeld met bekende ErbB familie remmers ^8-11 voor HRGβ1 behandeling. Voor inhibitor experimenten werden de cellen geïncubeerd met 1 uM HDS 029 200 nM PD 153035, of 200 nM PD 158780 SFM in drie uur. Elke array werd geïncubeerd met 100 ug lysaat. Een toename in fosforylering waargenomen voor ErbB2, ErbB3, en ErbB4 capture spots bij vergelijking met onbehandelde cellen HRG-β1 behandeld MDA-MB-453 cellen. De behandeling van cellen met drie ErbB familie selectieve remmers voor HRG-β1 incubatie veroorzaakt vermindering van ErbB2, ErbB3, en ErbB4 fosforylering.

In figuur 2 is weergegeven gegevens voor Kato III cellen waarover de RTK FGF R2 overexpressie. In deze reeks experimenten, Kato III cellen onbehandeld, behandeld met 100 ng / ml rhFGF zuur (FGF) en 1 ug / ml heparine, of voorbehandeld met FGF R remmers ^12-15 voorafgaand aan behandeling metFGF en heparine. De remmers PD173074, PD 161570, PD 166285 en werden gebruikt bij een concentratie van 1 uM en geïncubeerd met de Kato III cellen gedurende 3 uur in serumvrij medium. Hoewel er constitutieve fosforylatie van zowel EGF en FGF R R2 in onbehandelde KATO III cellen, een toename van FGF R2 fosforylatie werd gezien na FGF behandeling. Het incuberen van de cellen met PD 173074, PD 161570, of PD 166285 resulteerde in afname van FGF R2 en EGF R fosforylering. Hoewel deze remmers bekend invloed op de fosforylatie van FGF familieleden R, tonen deze resultaten het nut van de Human Phospho-RTK array voor monitoren van het effect van een bepaalde concentratie remmer kan hebben andere RTK's, zoals EGF R in dit geval.

Figuur 1. Inductie en remming van ontvangsttor tyrosine kinase fosforylering in borstkankercellen. Array beelden van Proteome Profiler Human Phospho-RTK arrays en de bijbehorende histogram profielen staan. MDA-MB-453 cellen werden onbehandeld of behandeld met remmers RTK gevolgd door behandeling met NRG-β1/HRG-β1. De matrix werd gebruikt om de effecten van remmers controleren op kinase fosforylering in MDA-MB-453-cellen. Klik hier om groter bedrag bekijken .

Figuur 2. Inductie en remming van receptor tyrosine kinase fosforylering maagkanker cellen. Array beelden van een Proteome Profiler Human Phospho-RTK array en de bijbehorende histogram profielen staan. Kato III cellen untreated of behandeld met RTK-remmers gevolgd door behandeling met FGF zure en heparine. Klik hier om een grotere afbeelding te bekijken .

Referenties

1. Henriksson, ML, Edin, S., Dahlin, AM, Oldenborg, PA, Oberg, A., Van Guelpen, B., Rutegard, J., Stenling, R., & Palmqvist, R. Colorectale kanker cellen te activeren aangrenzende fibroblasten als gevolg in FGF1/FGFR3 signalering en verhoogde invasie. Am. J. Pathol. 178, 1387-1394 (2011).
2. Morishita, A., Gong, J., Nomura, T., Yoshida, H., Izuishi, K., Suzuki, Y., Kushida, Y., Haba, R., D'Armiento, J., & Masaki, T. Het gebruik van eiwit array te targeten receptor tyrosine kinases voor de behandeling van humane darmkanker identificeren. Int. J. Oncol. 37, 829-835 (2010).
3. Agaram, NP, Laquaglia, MP, Ustun, B., Guo, T., Wong, GC, Socci, ND, Maki, RG,DeMatteo, RP, Besmer, P., & Antonescu, CR Moleculaire karakterisering van pediatrische gastro-intestinale stromale tumoren. Clin. Cancer Res. 14, 3204 tot 3,215 (2008).
4. Stommel, JM, Kimmelman, AC, Ying, H., Nabioullin, R., Ponugoti, AH, Wiedemeyer, R., Stegh, AH, Bradner, JE, Ligon, KL, Brennan, C., Chin, L., & DePinho, RA Coactivation van receptor tyrosine kinases invloed op de respons van tumorcellen gerichte therapieën. Science. 318, 287-290 (2007).
5. Agarwal, S., Zerillo, C., Kolmakova, J., Christensen, JG, Harris, LN, Rimm, DL, DiGiovanna, MP, & Stern, DF Association of constitutief geactiveerde hepatocytgroeifactorreceptor (Met) met resistentie tegen een dual EGFR/Her2 inhibitor in niet-kleincellige longkankercellen. Br. J. Cancer. 100, 941-949 (2009).
6. Dewaele, BM, Floris, G., Finalet-Ferreiro, J., Fletcher, CD, Coindre, JM, Guillou, L., Hogendoorn, PC, Wozniak, A., Vanspauwen, V., Schoffski, P., Marynen, P., Vandenbergh, P., Sciot, R., & Debiec-Rychter, M. Co-geactiveerde PDGFRA en EGFR potentiële therapeutische targets in intimale sarcoma. Cancer Res. 70, 7304 tot 7314 (2010).
7. Yoon, YK, Kim, HP, Han, SW, Hur, HS, Oh, DY, Im, SA, Bang, YJ, & Kim, TY Combinatie van EGFR en MEK1 / 2 remmer geeft synergetische effecten door het onderdrukken van EGFR/HER3-dependent AKT-activering in menselijke maagkanker cellen. Mol. Cancer Ther. 8, 2526-2536 (2009).
8. Fry, DW, Nelson, JM, Slintak, V., Keller, PR, Rewcastle, GW, Denny, WA, Zhou, H., & Bruggen, AJ Biochemische en antiproliferatieve eigenschappen van 4 - [Ar (alk) ylamino] pyridopyrimidines, een nieuwe chemische klasse van krachtige en specifieke epidermale groeifactor receptor tyrosine kinase remmer. Biochem. Pharmacol. 54, 877-887 (1997).
9. Bos,M., Mendelsohn, J., Kim, YM, Albanell, J., Fry, DW, en Baselga, J. PD153035, een tyrosine kinase inhibitor, voorkomt epidermale groeifactor receptor activatie en remt groei van kankercellen in een receptor nummer afhankelijke wijze. Clin. Cancer Res. 3, 2099-2106 (1997).
10. Stoll, SW, Kansra, S., Peshick, S., Fry, DW, Leopold, WR, Wiesen, JF, Sibilia, M., Zhang, T., Werb, Z., Derynck, R., Wagner, EF, & Elder, JT Differential gebruik en lokalisatie van ErbB-receptor tyrosine kinases van de huid in vergelijking met normale en kwaadaardige hoorncellen. Neoplasia. 3, 339-350 (2001).
11. Klutchko, SR, Zhou, H., Winters, RT, Tran, TP, Bruggen, AJ, Althau, IW, Amato, DM, Elliott, WL, Meade, MA, Roberts, BJ, Fry, DW, Gonzales, AJ, Harvey , PJ, Nelson, JM, Sherwood, V., Han, HK, Pace, G., Smaill, JB, Denny, WA, & Showalter, HD Tyrosine kinase-remmers. 19. 6-alknyamides van 4-anilinoquinazolines en 4-anilinopyrido [3,4-d] pyrimidinen als irreversibele remmers van de ErbB familie van tyrosine kinase receptoren. J. Med. Chem. 49, 1475-1485 (2006).
12. Kunii, K., Davis, L., Gorenstein, J., Hatch, H., Yashiro, M., Di Bacco, A., ELBI, C., & Lutterbach, B. FGFR2-amplified maagkanker cellijnen vereisen FGFR2 en ErbB3 signalering voor groei en overleving. Cancer Res. 68, 2340-2348 (2008).
13. Zhou, W., Hur, W. McDermott, U., Dutt, A., Xian, W., Ficarro, SB, Zhang, J., Sharma, SV, Brugge, J., Meyerson, M., Settleman, J . & Gray, NS Een structuur-geleide benadering van het creëren van covalente FGFR-remmers. Chem. Biol. 17, 285-295 (2010).
14. Batley, BL, Doherty, AM, Hamby, JM, Lu, GH, Keller, P., Dahring, TK, Hwang, O., Crickard, K., & Panek RL Remming van FGF-1 receptor tyrosine kinase-activiteit door PD 161570 , een nieuw eiwit-Tyrosine kinase inhibitor. Life Sci. 143-150 62 (1998).
15. Panek, RL, Lu GH, Klutchko, SR, Batley, BL, Darhing, TK, Hamby, JM, Hallak, H., Doherty, AM, & Keiser, JA In vitro farmacologische karakterisering van PD 166285, een nieuw nanomolaire krachtige en breed actieve proteïne tyrosine kinase inhibitor. J. Pharmacol. Exp. Ther. 283, 1433-1444 (1997).

Discussion

De Human Phospho-RTK is een voordelige en snel alternatief voor de traditionele methoden, zoals immunoprecipitatie (IP) Western voor screening veranderingen in de RTK fosforylering. Met deze methode waren de relatieve niveaus van 42 fosfo-RTKs tegelijkertijd gescreend met een monster van MDA-MB-453 of Kato III cellysaat. Bovendien vereist deze array assay 2,5 uur van hands-on tijd, waardoor deze methode veel tijd effectiever dan het uitvoeren van meerdere IP-Westerns. Door toepassing van een chemiluminescentiedetectie methode is geen speciale apparatuur dan wordt meestal gebruikt om Western verzamelen vereist. Arrays gevoelig en kan worden gebruikt om veranderingen in fosforylering veroorzaakt door zowel ligand en inhibitor behandeling te vergelijken. Deze methode maakt het ook mogelijk de evaluatie van de remmer selectiviteit naar off-target RTK's. Positieve resultaten kan verder worden geëvalueerd met een kwantitatieve test zoals een ELISA.

Om effectief te gebruiken arrays om te screenen op veranderingenin fosforylatie, moet een aantal belangrijke experimentele richtlijnen worden gevolgd. Ten eerste moet experimenten omvatten passende controle monsters. Bijvoorbeeld, in deze experimenten het effect van remmers op MDA-MB-453 of Kato III lysaten werden gemeten op lysaatmonsters bereid op dezelfde dag. Alleen array data die worden verzameld in dezelfde experiment te worden geanalyseerd om variaties in signaal vanwege verschillen in omgang met monsters, incubatietijd, pipet techniek of wastechniek minimaliseren. Het vergelijken van signaal intensiteiten tussen twee analyten op hetzelfde membraan wordt niet aanbevolen, omdat capture antilichamen werden niet geselecteerd op de parallelle affiniteiten hebben.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Human Phospho-RTK Array Kit	R&D Sytems	ARY001
Aprotinin	Sigma	A6279
Leupeptin	Tocris	1167
Pepstatin A	Tocris	1190
MDA-MB-453 cells
Kato III cells
Recombinant Human NRG1-beta 1/HRG1-beta 1 EGF Domain	R&D Systems	396-HB-050
Recombinant Human FGF acidic (aa 16-155)	R&D Systems	232-FA-025
Heparin	Sigma	H4784
HDS 029	Tocris	2646
PD 153035	Tocris	1037
PD 158780	Tocris	2615
PD 173074	Tocris	3044
PD 161570	Tocris	3724
PD 166285	Tocris	3785
BCA assay	Pierce	23225
Phosphate-Buffer Saline (PBS)
Pipettes and pipette tips
Gloves
Deionized or distilled water
Flat-tipped tweezers
Rocking platform shaker
Microcentrifuge
Plastic containers with the capacity to hold 50 ml			For washing arrays
Plastic transparent sheet protector
Plastic wrap
Absorbent lab wipes
Paper towels
Autoradiography cassette
Film developer
Kodak BioMax Light Film	Carestream Health	178 8207
Film developer
Image Station 4000MM PRO	Carestream Health		Chemiluminescence imager compatible with collection of western data may be used instead of film and a film developer.
Epson Perfection Scanner	Epson	V750 PRO	Flatbed scanner with transparency adaptor capable of transmission mode
Image Analysis Software	GE,WesternVision, BioRad, Adobe, NIH, Protein Simple, etc		ImageQuant, ArrayVision, Western Vision, Quantity One, Photoshop, ImageJ, AlphaView, or other compatible program
Microsoft Excel	Microsoft
Computer capable of running image analysis software and Microsoft Excel.