Application Notes

שינויים בפרופיל זרחון קולטן טירוזין קינאז באמצעות מערכי נוגדנים - פרסומת

Released: September 27, 2012 doi: 10.3791/4199

Greta J. Wegner¹, David J. Finkel¹, Amy E. James¹, Richard A. Krzyzek¹

¹Array Group, Assay Department, R&D Systems, Inc.

Summary

מערכי נוגדני Profiler Proteome הם דרך נוחה ויעילת עלות למסך לשינויים בקולטן טירוזין קינאז (RTK) זירחון בלי לבצע immunoprecipitation רב (IP) מערבונים. מערך RTK אנוש ARY001 מאפשר מדידה האיכותית של RTKs המרובה בדגימה אחת באמצעות זיהוי chemiluminescence.

Abstract

Dysregulation של קינאז ביטוי הקולטן טירוזין (RTK) וזירחון לעתים קרובות קשור בהתפתחות וההתפשטות גרורתית של תאים סרטניים. מאמץ משמעותי ^1-3 כבר התמקד בפיתוח מעכבים למקד RTKs הספציפי ולקטוע את מעברי אותות החריגים הקשורות למדינות מחלה . ^4-7 מטרת המחקר הייתה למדוד את ההשפעות של מספר נבחר של מעכבים על זירחון RTK. מחקר זה השתמש במערך phospho-RTK האנושי, שהוא immunoassay כריך מבוסס קרום לפקח עליות או ירידות בזירחון לRTKs רב בו זמנית בדגימה אחת. בבדיקה זו, שתי RTKs phosphorylated וunphosphorylated להציג במדגם lysate נתפסו על ידי נוגדנים בדידים המודפסים בשני עותקים על פני קרום ניטרוצלולוזה הגודל של שקופיות מיקרוסקופ. לאחר שטיפה, המערכים מודגרת עם peroxidase אנטי phospho-טירוזין-חזרת (HRP),שכריכים עם RTKs phosphorylated נתפס על המערך. בעקבות צעד לשטוף 2, המערכים מודגרת עם ריאגנטים chemiluminescent. אות שנוצרה בכל מקום מערך היא ביחס ישר לכמות של phospho-חלבון הקשורה בכל נוגדן ללכוד. בניסויים אלה, מערכים שמשו למדידת עלייה בזירחון בעקבות גירוי יגנד של תאים או קרצינומה של קיבת קאטו III סרטן מד"א-MB-453 או שד, כמו גם לאפיין ירידות בזירחון קשורים בטיפול בתאים עם מעכבים סלקטיביים כלפי ErbB או בני משפחת R FGF.

Protocol

1. לדוגמא הכנה

איסוף lysates מ, יגנד מטופל, או מטופל ומעכב תאי יגנד טופלו ביצוע ההנחיות בגיליון הנתונים של המערך האנושי phospho-RTK. חיץ תמוגה עבר אופטימיזציה עבור ערכה זו. ההחלפה של מאגרי תמוגה אחרות עשויה להשפיע על ביצועים הסופיים של המערך. כדי למנוע הידרדרות המדגם פרוטאוליטי, להוסיף 10 מיקרוגרם / מ"ל Aprotinin, 10 מיקרוגרם / המ"ל Leupeptin, וPepstatin 10 מיקרוגרם / מ"ל להיקף מאגר תמוגה הנדרשת לכל הכנת lysate תא טריה לכל שימוש.
ריכוז lysate צריך להימדד באמצעות חומצת bicinchoninic (BCA) assay. ריכוז לדוגמה יכול להיות מותאם באופן אמפירי לרגישות אופטימלית ורקע נמוך. טווח של 100-300 מיקרוגרם של lysate מומלץ כנקודת מוצא ראשונית.
מחזורי הקפאה / פשרה של דגימות יש להימנע ואחסון נכון של lysates נדרש לקבלת ביצועים אופטימליים. הפשר דגימות lysate קפוא בתוך קרח.

תחת = "jove_title"> 2. Assay מערך

הבא את כל רכיבי הערכה לטמפרטורת חדר לפני השימוש. כדי למנוע זיהום, ללבוש כפפות בעת ביצוע הפרוצדורות.
פיפטה 2.0 מ"ל של הצפת מערך 1 לכל אחד גם מצלחת Multi-4-ובכן לשימוש. מאגר המערך 1 משמש כחיץ בלוק.
השימוש בטיפ והשטוחה פינצטה, להסיר כל קרום שישמש מבין הסדינים והמקום המגנים בגם של מנת Multi-4-ובכן. מספר המערך צריך להיות מופנה כלפי מעלה.
במגע עם מאגר המערך 1, את הצבע הכחול מהכתמים ייעלם, אבל ללכוד נוגדנים נשמרים במקומות הספציפיים שלהם.
דגירה במשך שעה 1 על פלטפורמת נדנדה. אוריינט המגש כך שכל אחד מקצות סלעי מערך לסיים ברווחתה. פני השטח של המערך צריכים להיות רטובים לחלוטין ומכוסים על ידי חיץ בלוק.
בעוד הקרומים חוסמים, לדלל את הכמות הרצויה של lysate הסלולרי לנפח סופי של 1.5 מ"ל עם הצפת מערך 1.
דגירת הלילה ב2-8 מעלות צלזיוס בפלטפורמת נדנדה. זמן דגירה קצרה יותר עשוי לשמש אם רגישות אופטימלית אינה נדרשת.
מוציא בזהירות את כל קרום מ- 4-Multi המנה הטובה והמקום למכלי פלסטיק בודד עם 20 מ"ל של הצפה לשטוף 1X. Multi-מנת 4 ובכן לא יכולה לשמש להשלמת שלבי שטיפה. יש לשטוף את הצלחת בעל 4-ובכן במים מזוקקים או deionized ויבש ביסודיות.
שטוף את כל קרום עם מאגר 1X לשטוף למשך 10 דקות על נדנדת פלטפורמת מטרף. חזור על שתי פעמים עבור סכום כולל של 3 כביסות.
דלל את peroxidase חיץ phospho-טירוזין-חזרת אנטי (HRP) זיהוי במאגר המערך 1X 2 באמצעות גורם הדילול על תווית הבקבוקון. פיפטה 2.0 מ"ל של תמיסה מדוללת לכל באר של מנת Multi-4-ובכן.
מוציא בזהירות את כל קרום מיכל הדחתה.אפשר חיץ עודף לניקוז מהקרום ולהחזיר את הממברנה למנת Multi-4-ובכן המכילה אנטי phospho-טירוזין-HRP בדילול המלא. לכסות את הבארות עם המכסה.
דגירה עבור 2 שעות בטמפרטורת חדר על פלטפורמת נדנדה.
שטוף את כל מערך כפי שתואר לעיל.
השלם את השלבים שנותרו ללא הפרעה. מוציא בזהירות את כל קרום מיכל הדחתה. אפשר חיץ עודף כדי לנקז מן הקרום ידי סופג הקצה התחתון על גבי נייר סופג. למקם כל קרום במגן יריעת פלסטיק עם מספר זיהוי פונה כלפי מעלה.
מיליליטר פיפטה 1 למגיב החמים המוכן מערבב באופן שווה על כל הממברנה. שימוש מ"ל פחות מ -1 מיקס מגיבים לחמי קרום עלולה לגרום לכיסוי קרום לא שלם. החלפה של חלק ממגיבי chemiluminescent עצימות גבוהות לריאגנטים חמים 1 ו 2 עלולים לגרום גם רקע מוגבר או מופחתת בהתאם לאות המגיבה.
זהירות מכסה בפלסטיקמגן גיליון. בעדינות להחליק את כל בועות אוויר ולהבטיח מיקס מגיב חמים הוא להתפשט באופן שווה לכל הפינות של כל קרום. דגירה במשך דקות 1.
מגבות נייר עמדה בראש וצידי מגן יריעת פלסטיק המכיל את הקרומים ולסחוט היטב מיקס מגיב חמים עודף.
הסר את מגן יריעת הפלסטיק העליון, שכב בזהירות מעבדה סופגת לנגב על גבי הקרומים למחוק את כל מיקס מגיב חמים שנותר.
השארת קרומים ביריעת פלסטיק המגן התחתון, לכסות את הקרום בניילון נצמד מטפל בעדינות כדי להחליק את כל בועות אוויר. לעטוף בניילון הנצמד העודף סביב החלק האחורי של מגן הגיליון כך שקרום המגן והסדין הם עטופים לגמרי.
הנח את הקרומים עם מספרי זיהוי פונים מעלה, בקלטת סרט autoradiography שלא נמצאים בשימוש עם זיהוי איזוטופ רדיואקטיבי.
לחשוף לאור סרט BioMax קודאק לדקות 1-10. חשיפות מרובות recommהסתיים. לחלופין, תמונות ניתן לגבות באמצעות imager תואם chemiluminescence כגון בריאות Carestream תחנת התמונה 4000MM PRO.

3. ניתוח נתונים

אותות חיוביים ראו בסרט פתח ניתן לזהות במהירות על ידי נחת כיסוי שקיפות בתמונת המערך וליישר אותו עם הזוגות של נקודתי התייחסות שהודפסו בפינות למטרה זו. מספר זיהוי המוטבע במערך צריך להיות ממוקם בצד שמאל הצד היה. המיקום של בקרות וללכוד נוגדנים מופיע בנספח של גיליון הנתונים של המערך האנושי phospho-RTK.
צפיפות הפיקסלים על סרט פתח ניתן לאסוף באמצעות סורק הילוכים במצב כגון V750 PRO שלמות Epson.
יצירת תבנית כדי לנתח צפיפות פיקסל בכל נקודה של המערך באמצעות תוכנת ניתוח הדמיה מתאימה. תוכניות תואמות כוללות תוכנת ImageQuant או ArrayVision מGE, SOF החזון המערביtware עם תבניות ספציפיות לProteome מערכי Profiler, BioRad אחד כמות, Adobe Photoshop, NIH ImageJ, וAlphaView חלבון פשוט.
יצוא ערכי אות לקובץ גיליון אלקטרוני למניפולציה בתכנית כגון Microsoft Excel.
לקבוע את האות הממוצעת (צפיפות פיקסלים) של זוג נקודות כפולות המייצגות כל RTK.
להחסיר אות רקע ממוצעים מכל מקום. השתמש באות מאזור ברור של המערך או נקודתי בקרה שליליות כערך רקע.
השווה אותות מקבילים במערכים שונים כדי לקבוע את השינוי היחסי ברמות זרחון RTK בין דגימות.

4. נציג תוצאות

פרוטוקול זה מדגים כיצד מערך האנושי phospho-RTK יכול לשמש מסך השפעות של גירוי יגנד ומעכבי זרחון על RTK. באיור 1, נתונים מוצגים במד"א-MB-453 תאים היו ללא טיפול, טיפול עם 100 ng/ המ"ל rhNRG-β1/HRG-β1 (HRG-β1) למשך 5 דקות, או מראש טופל במעכבים-משפחת ErbB ידועים ^8-11 לפני HRGβ1 טיפול. על ניסויים של מעכב, התאים הודגרו עם 1 מיקרומטר HDS 029, 200 ננומטר PD 153035, או 200 PD 158780 בSFM nM לשלוש שעות. כל מערך הודגר עם 100 מיקרוגרם של lysate. עלייה בזירחון הוא ציין לERBB2, ErbB3, וErbB4 כתמים ללכוד כאשר משווים תאים שלא טופלו בHRG-β1 טפלו מד"א-MB-453 תאים. הטיפול בתאים עם כל השלושה המעכבים סלקטיביים משפחת ErbB לפני β1-HRG הדגירה נגרם ירידה בERBB2, ErbB3 וErbB4 זרחון.

באיור 2, נתונים מוצגים לתאי קאטו III הידועים overexpress R2 FGF RTK. בקבוצה זו של ניסויים, תאי III קאטו היו ללא טיפול, טיפול עם 100 ng / ml rhFGF חומצי (FGF) והפרין 1 מיקרוגרם / מ"ל, או pretreated עם FGF R סלקטיבית מעכבי ^12-15 לפני הטיפול עםFGF והפרין. מעכבי PD173074, פ"ד 161570, 166285 ופ"ד שמשו בריכוז של 1 מיקרומטר ודגרו עם תאי קאטו III עבור 3 שעות בתקשורת החופשית בסרום. אמנם יש זירחון המכונן של שניהם EGF R ו R2 FGF בתאים שלא טופלו קאטו III, עלייה בזירחון R2 FGF נצפה על טיפול FGF. דגירת התאים עם פ"ד 173074, פ"ד 161570, או 166285 פ"ד הביא ירד FGF R2 ו זירחון R EGF. למרות המעכבים אלה ידועים להשפיע זירחון של בני משפחת R FGF, תוצאות אלה ממחישות את התועלת של מערך phospho-RTK האנוש לניטור ההשפעה של ריכוז מסוים מעכב אולי על RTKs אחר, כגון EGF R במקרה זה.

איור 1. אינדוקציה ועיכוב של רג'פזירחון טירוזין קינאז טור בתאי סרטן השד. תמונות ממערך מערכי Proteome מאבחן אדם phospho-RTK ופרופילי היסטוגרמה המתאימים מוצגים. תאי מד"א-MB-453 היו מטופלים או טופל במעכבי RTK אחריו טיפול עם NRG-β1/HRG-β1. המערך היה בשימוש כדי לנטר את ההשפעות של מעכבי קינאז בזרחון בתאי מד"א-MB-453. לחץ כאן לצפייה בדמות גדולה.

איור 2. אינדוקציה ועיכוב של זרחון טירוזין קינאז רצפטור בתאי סרטן הקיבה. תמונות ממערך מערך Proteome Profiler אנוש phospho-RTK ואת פרופילי היסטוגרמה המתאימים מוצגות. תאי III קאטו היו האנטreated או טופל במעכבי RTK אחרי טיפול עם FGF חומצי והפרין. לחץ כאן לצפייה בדמות גדולה.

הפניות

Henriksson, ML, Edin, ס ', Dahlin, בבוקר, Oldenborg, הרשות פלסטינית, יוברג, א', ואן Guelpen, ב ', Rutegard, ג', Stenling, ר', וPalmqvist, תאי סרטן המעי גס ר להפעיל fibroblasts הסמוך וכתוצאה בFGF1/FGFR3 איתות ופלישה מוגברת. Am. ג'יי Pathol. 178, 1387-1394 (2011).
Morishita, א ', פאלון, ג', נומורה, ט, יושידה, ח', Izuishi, ק, סוזוקי, י', קושידה, י ', הבה, ר', ד 'Armiento, ג', ומסאקי, ט השימוש במערך חלבון לזהות טירוזין קינאז רצפטור להכוונה לטיפול בסרטן המעי גס האנושי. Int. ג'יי Oncol. 37, 829-835 (2010).
Agaram, NP, Laquaglia, חבר פרלמנט, Ustun, ב ', גואו, ט', וונג, GC, Socci, ND, מק"י, RG,DeMatteo, RP, Besmer, פ ', ואנטונסקו, אפיון CR המולקולרי של גידולי סטרומה במערכת עיכול בילדים. Clin. מיל הסרטן. 3204-3215 14, (2008).
Stommel, JM, קימלמן, AC, יינג, ח', Nabioullin, ר ', Ponugoti, א"ח, Wiedemeyer, ר', Stegh, א"ח, Bradner, י"א, Ligon, KL, רנן, ג, צ'ין, ל ', ו DePinho, Coactivation RA של טירוזין קינאז רצפטור משפיע על התגובה של תאים סרטניים לטיפולים ממוקדים. מדע. 318, 287-290 (2007).
Agarwal, ס ', Zerillo, ג, Kolmakova, ג', כריסטנסן, JG, אריס, LN, רים, DL, DiGiovanna, חבר פרלמנט, ושטרן, DF איגוד הקולטן לגורם הופעל constitutively hepatocyte צמיחה (MET) עם התנגדות מעכב EGFR/Her2 כפול בתאי סרטן ריאות שאינם קטן תא. Br. סרטן ג'יי. 100, 941-949 (2009).
Dewaele, BM, פלוריס, ג', Finalet-Ferreiro, ג', פלטשר, תקליטור, Coindre, JM, Guillou, ל ', Hogendoorn, מחשב, ווזניאק, א', Vanspauwen, ו ', Schoffski, פ, Marynen, פ, Vandenbergh, פ, Sciot, ר', וDebiec-Rychter, מ 'השותף הפעיל וPDGFRA EGFR הם מטרות טיפוליות פוטנציאליות בסרקומה intimal. מיל הסרטן. 70, 7304-7314 (2010).
יון, י.ק., קים, HP, האן, SW, חור, HS, אה, ד.י., Im, SA, מפץ, YJ, וקים, שילוב TY של EGFR וMEK1 / 2 מעכב מראה השפעות סינרגטיות ידי EGFR/HER3-dependent דיכוי הפעלת AKT בתאי סרטן קיבת אדם. מול. Ther הסרטן. 8, 2526-2536 (2009).
פריי, ד"ו, נלסון, JM, Slintak, ו ', קלר, יחסי הציבור, Rewcastle, GW, דני, וושינגטון, ואו, ה', וגשרים, תכונות AJ ביוכימיים ונוגדות שגשוג של 4 - [AR (ALK) ylamino] pyridopyrimidines, סוג חדש כימי של מעכב חזק וספציפי צמיחת אפידרמיס גורם הקולטן טירוזין קינאז. Biochem. Pharmacol. 54, 877-887 (1997).
בוס,מ ', מנדלסון, ג', קים, י"מ, Albanell, ג', פריי, ד"ו, וBaselga, PD153035 ג', מעכב טירוזין קינאז, מונעת הפעלת הקולטן לגורם גדילה באפידרמיס ומונעת את הצמיחה של תאים סרטניים במספר קולטני- אופן תלוי. Clin. מיל הסרטן. 3, 2099-2106 (1997).
סטול, SW, Kansra, ס ', Peshick, ס', פריי, ד"ו, ליאופולד, WR, Wiesen, JF, Sibilia, מ ', ג'אנג, ט, Werb, ז', Derynck, ר', וגנר, EF, ואלדר, ניצול JT דיפרנציאל ולוקליזציה של טירוזין קינאז רצפטור ErbB בעור בהשוואה להקרטינוציטים נורמלים וממאירים. Neoplasia. 3, 339-350 (2001).
Klutchko, SR, ג'ואו, ה ', וינטרס, RT, טראן, TP, גשרים, AJ, Althau, IW, אמאטו, DM, אליוט, WL, Meade, MA, רוברטס, בי ג'יי, פריי, ד"ו, גונזלס, AJ, הארווי , PJ, נלסון, JM, שרווד, ו ', האן, HK, פייס, ג', Smaill, JB, דני, וושינגטון, ווולטר, מעכבי טירוזין קינאז HD. 19. 6-alknyamides של 4-4-anilinoquinazolines וanilinopyrido [3,4-D] pyrimidines כמעכבים בלתי הפיכים של משפחת ErbB של קולטני טירוזין קינאז. J. מד. Chem. 49, 1475-1485 (2006).
Kunii, ק ', דייויס, ל', גורנשטיין, ג', האץ', ח', יאשירו, מ ', די באקו, א', Elbi, ג, וLutterbach, קווי B. FGFR2-מוגברים קיבת תאי סרטן דורש FGFR2 וErbb3 איתות לצמיחה ולהישרדות. מיל הסרטן. 68, 2340-2348 (2008).
ואו, וו, חור וו מקדרמוט, ע ', דאט, א', שיאן, וו, Ficarro, SB, ג'אנג, ג', ירמה, SV, ברוז', ג', מאירסון, מ ', Settleman, J . & גריי, NS גישה מודרכת ליצירת מבנה מעכבי FGFR קוולנטיים. כימי. Biol. 17, 285-295 (2010).
Batley, BL, דוהרטי, בבוקר, המבי, JM, לו, GH, קלר, פ ', Dahring, TK, הוואנג, O., Crickard, ק', וPanek עיכוב RL פעילות FGF-1 רצפטור טירוזין קינאז על ידי פ"ד 161570 , חלבון חדש-טירוזין קינאז מעכב. החיים Sci. 143-150 62 (1998).
Panek, RL, לו הורמון הגדילה, Klutchko, SR, Batley, BL, Darhing, TK, המבי, JM, Hallak, ח', דוהרטי, בבוקר, וKeiser, JA באפיון תרופתי מבחנה של פ"ד 166285, חדש וחזק nanomolar הרחב מעכבי טירוזין קינאז חלבון פעילים. ג' Pharmacol. Exp. Ther. 283, 1433-1444 (1997).

Discussion

אדם phospho-RTK הוא חלופה חסכונית ומהירה לשיטות מסורתיות כגון immunoprecipitation (IP) המערבי לשינויי הקרנה בזירחון RTK. באמצעות שיטה זו, הרמות היחסיות של 42-RTKs phospho הוקרנו בו זמנית באמצעות מדגם יחיד של מד"א-MB-453 או lysate התא קאטו III. בנוסף, בדיקת מערך זה נדרשה 2.5 שעות של ידות בזמן, מה שהופך שיטה זו הרבה יותר זמן יעיל יותר מאשר ביצוע מערבונים-IP מרובים. על ידי העסקת שיטת זיהוי chemiluminescence, אין ציוד מיוחד מעבר למה שמשמש בדרך כלל כדי לאסוף נתונים מערביים היה נדרש. מערכים הם רגישים ויכולים לשמש להשוואת שינויים בזירחון שנגרמו על ידי שני יגנד וטיפול מעכב. שיטה זו גם מאפשרת הערכה של הסלקטיביות מעכבת RTKs מחוץ ליעד. להיטים חיוביים עשויים להיות מוערכים נוסף באמצעות בדיקה כמותית כגון ELISA.

יעילות להעסיק מערכים למסך לשינוייםבזירחון, כמה הנחיות ניסיוניות מרכזיות צריכות להיות אחריו. ראשית, צריכים לכלול ניסויי דגימות בקרה מתאימות. לדוגמה, בניסויים אלו ההשפעה של מעכבים על מד"א-MB-453 או קאטו III lysates נמדדה על דוגמאות lysate שהוכנו באותו היום. נתוני מערך יחידים שנאספו באותו הניסוי יש לנתח כדי למזער שינויים באות בשל הבדלים בטיפול מדגם, זמן דגירה, טכניקת pipet, או טכניקת שטיפה. עוצמת אות השוואה בין שני analytes באותו הקרום אינה מומלצת, שכן ללכוד נוגדנים לא נבחרו לזיקות מקבילות.

Acknowledgments

עבודה זו מומנה על ידי R & D Systems, Inc

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Human Phospho-RTK Array Kit	R&D Sytems	ARY001
Aprotinin	Sigma	A6279
Leupeptin	Tocris	1167
Pepstatin A	Tocris	1190
MDA-MB-453 cells
Kato III cells
Recombinant Human NRG1-beta 1/HRG1-beta 1 EGF Domain	R&D Systems	396-HB-050
Recombinant Human FGF acidic (aa 16-155)	R&D Systems	232-FA-025
Heparin	Sigma	H4784
HDS 029	Tocris	2646
PD 153035	Tocris	1037
PD 158780	Tocris	2615
PD 173074	Tocris	3044
PD 161570	Tocris	3724
PD 166285	Tocris	3785
BCA assay	Pierce	23225
Phosphate-Buffer Saline (PBS)
Pipettes and pipette tips
Gloves
Deionized or distilled water
Flat-tipped tweezers
Rocking platform shaker
Microcentrifuge
Plastic containers with the capacity to hold 50 ml			For washing arrays
Plastic transparent sheet protector
Plastic wrap
Absorbent lab wipes
Paper towels
Autoradiography cassette
Film developer
Kodak BioMax Light Film	Carestream Health	178 8207
Film developer
Image Station 4000MM PRO	Carestream Health		Chemiluminescence imager compatible with collection of western data may be used instead of film and a film developer.
Epson Perfection Scanner	Epson	V750 PRO	Flatbed scanner with transparency adaptor capable of transmission mode
Image Analysis Software	GE,WesternVision, BioRad, Adobe, NIH, Protein Simple, etc		ImageQuant, ArrayVision, Western Vision, Quantity One, Photoshop, ImageJ, AlphaView, or other compatible program
Microsoft Excel	Microsoft
Computer capable of running image analysis software and Microsoft Excel.