Application Notes

Antikor Diziler kullanarak Tirozin Kinaz Fosforilasyon profilleme değişiklikler - Reklam

Released: September 27, 2012 doi: 10.3791/4199

Greta J. Wegner¹, David J. Finkel¹, Amy E. James¹, Richard A. Krzyzek¹

¹Array Group, Assay Department, R&D Systems, Inc.

Summary

Proteom Profiler antikor diziler sayıda immünopresipitasyon (IP) Westernler yapmadan reseptör tirozin kinaz (RTK) fosforilasyon değişiklikler için ekran için uygun ve düşük maliyetli bir yoldur. ARY001 İnsan RTK dizi kemilüminesans algılama kullanarak tek bir örnek birden RTKlar niteliksel olarak ölçülmesini sağlar.

Abstract

Reseptör tirozin kinaz (RTK) ekspresyonu ve fosforilasyon düzensizliği sık kanserli hücrelerin gelişimini ve metastazı ile ilişkili. ^1-3 önemli çaba belirli RTKlar hedeflemek ve hastalık durumları ile ilişkili anormal sinyal yolları kesmek için gelişmekte inhibitörleri odaklanmıştır . Bu çalışmanın ^4-7 amacı RTK fosforilasyonuna inhibitörleri, belirli bir sayıda etkilerini ölçmektir. Bu çalışmada, tek bir örnek aynı anda çok sayıda RTKlar için fosforilasyonu artar veya azalır izlemek için bir membran tabanlı sandviç kitidir İnsan Fosfo-RTK dizisi kullanılır. Bu denemede, her ikisi de fosforile ve fosforlanmamış RTKlar bir lizat numune içinde mevcut bir nitroselüloz zar, bir mikroskop slaydı büyüklüğü karşısında iki kopya halinde basılmış farklı antikorları tarafından yakalanır. Yıkamadan sonra, diziler, anti-fosfo-tirozin-yaban turpu peroksidaz (HRP) ile kuluçkaya bırakıldıdizi yakalanan fosforile RTKlar ile hangi sandviç. Bir ikinci yıkama adımından sonra, diziler chemiluminescent reaktifleri ile inkübe edilir. Her dizi noktada üretilen sinyal her yakalama antikorla bağlanır fosfo-protein miktarı ile doğru orantılıdır. Bu deneylerde, diziler MDA-MB-453 göğüs kanseri ya da Kato III mide kanseri hücreleri, hem de ErbB karşı selektif inhibitörleri ile hücrelerin tedavisi ile ilişkili fosforilasyon azalmasına karakterize etmek için her iki ligand uyarımını takiben fosforilasyon artışı ölçmek için kullanılmıştır veya FGF R aile üyeleri.

Protocol

1. Örnek Hazırlanması

İnsan Fosfo-RTK dizi veri sayfasındaki yönergeleri izleyerek tedavi edilmezse, ligand tedavi veya önleyici ve ligand tedavi hücrelerinden lizatları toplayın. Lizis tamponu bu kit için optimize edilmiştir. Diğer lizis tampon ikame dizisinin nihai performansını etkileyebilir. Proteolitik örnek düşmeyi önlemek için, 10 ug / ml Aprotinin, 10 ug / ml Löpeptin, 10 ug / ml Pepstatin her kullanım için taze her bir hücre lizatı hazırlanması için gerekli lizis tampon hacmi A ilave edin.
Lizat konsantrasyonu bicinchoninic asit (BCA) deneyi kullanılarak ölçülür. Numune konsantrasyonu ampirik optimum hassasiyet ve düşük arka plan için ayarlanabilir. Lizat 100-300 mikrogram Bir dizi, bir başlangıç noktası olarak tavsiye edilir.
Numunelerin donma / çözülme döngüleri kaçınılmalıdır ve lizatları uygun depolama optimum performans için gereklidir. Buz üzerinde donmuş lizat örnekleri çözülme.

Kullanmadan önce oda sıcaklığına kadar tüm kit bileşenleri getir. Işlemleri yaparken kontaminasyonu önlemek için eldiven giyin.
Kullanılacak 4-Multi-Well çanak her oyuğuna Dizi Tampon 1 2.0 ml. Dizi Tampon 1 blok tampon olarak hizmet vermektedir.
Düz uçlu cımbız kullanarak, 4-İyi Multi-çanak bir kuyuya koruyucu çarşaf ve yerde arasından kullanılmak üzere her membran kaldırmak. Dizi numarasını yukarıya dönük olmalıdır.
Dizi Tampon 1 ile temas ettiğinde noktalar mavi boya kaybolur, ancak yakalama antikorlar kendi özel yerlerde tutulur.
Sallanan bir platform üzerinde 1 saat süreyle inkübe edin. Orient tepsiye böylece her dizi kayalar sonunda onun da içinde biteceğini söyledi. Dizinin yüzeyi tamamen ıslatılmalı ve blok tampon ile kaplanmış olmalıdır.
Membranlar bloke edilirken, Dizi Tampon 1 ile 1,5 ml nihai hacmi hücresel lizat istenilen miktarda sulandırın.
Sallanan bir platform üzerinde 2-8 ° C'de bir gece inkübe edin. Optimum hassasiyet gerekli değilse daha kısa inkübasyon süresi kullanılabilir.
Dikkatlice 1X Yıkama Tamponu 20 ml ile bireysel plastik kaplar içine 4-Peki Multi-çanak ve yerden her membran kaldırmak. 4-Peki Multi-bulaşık yıkama adımları tamamlamak için kullanılan olabilir. Deiyonize veya distile su ile 4-Peki Multi-çanak iyice durulayın ve kurulayın.
Bir sallanan bir platform çalkalayıcı üzerinde 10 dakika süreyle 1X Wash Buffer ile her bir membran yıkayın. 3 yıkar toplam iki kez tekrarlayın.
Flakon etiketi üzerindeki seyreltme faktörü kullanarak 2 1X Array Tampon içinde anti-fosfo-tirozin-horseradish peroksidaz (HRP) algılama tampon seyreltin. 4-Multi-Well çanak her oyuğuna pipetle seyreltilmiş 2.0 ml.
Dikkatlice yıkama kabı her membran kaldırmak.Membran tahliye ve seyreltilmiş anti-fosfo-tirozin-HRP içeren 4-Peki Multi-çanak membran dönmek için aşırı arabellek izin ver. Kapaklı kuyuları kaplayın.
Bir sallanan platform üzerinde oda sıcaklığında 2 saat süreyle inkübe edin.
Daha önce anlatıldığı gibi, her dizi yıkayın.
Kesintisiz kalan adımları tamamlayın. Dikkatlice yıkama kabı her membran kaldırmak. Aşırı arabellek emici kağıda alt kenarı blot ile membran dışarı akmasını sağlayın. Yukarı bakacak kimlik numarası ile bir plastik levha koruyucusu her membran yerleştirin.
Hazırlanan CHEMI reaktifi pipetleyin 1 ml her bir membran üzerine eşit karıştırın. Membran başına CHEMI Reaktif Karışımı az 1 ml kullanılması eksik membran kapsama neden olabilir. Chemi Reaktifler 1 ve 2 için bazı yüksek yoğunluklu chemiluminescent reaktif ikame reaktif bağlı olarak artan veya azalan arka plan sinyal ya da neden olabilir.
Dikkatli bir plastik kapaklevha koruyucusu. Yavaşça herhangi bir hava kabarcığı yumuşatmak için ve CHEMI Reaktif Karışımı Her membran her köşesine yayılıyor sağlamak. 1 dakika boyunca inkübe edin.
Pozisyon kağıt üst ve membranlar içeren plastik levha koruyucusu yanlarında havlu ve dikkatle aşırı CHEMI Reaktif Mix sıkmak.
Üst plastik levha koruyucusu çıkarın ve dikkatle bir emici laboratuvar kalan CHEMI Reaktif Karışımı kapalı leke membranları üstüne silin yatıyordu.
Alt plastik levha koruyucusu membranlar bırakarak, plastik wrap yavaşça herhangi bir hava kabarcığı düzeltmek için dikkat çekici membranları kapsamaktadır. Membranlar ve levha koruyucusu tamamen sarılmış böylece levha koruyucusu arka etrafında aşırı plastik wrap sarın.
Radyoaktif izotop algılama ile kullanılmayan bir otoradyografi film kaseti içinde, yukarı bakacak kimlik numaraları ile membranlar yerleştirin.
1-10 dakika boyunca Kodak Biomax Işık film Açığa. Çoklu pozlama recomm vardırsona erdi. Alternatif olarak, görüntüleri, Carestream Health olarak kemilüminesans uyumlu kamera kullanılarak toplanabilir Image Station 4000mm PRO.

3. Veri Analizi

Geliştirilmiş film görülen olumlu sinyalleri hızla dizi görüntü üzerinde şeffaf kaplama yerleştirmek ve bu amaç için köşe basılmış referans noktaları çiftleri ile hizalayarak ile tespit edilebilir. Dizi damgalı kimlik numarası sol vardı tarafta konulmalıdır. Kontrolleri ve yakalama antikorların konumu İnsan Fosfo-RTK dizi veri sayfasının Ek listelenir.
Geliştirilen film Piksel yoğunlukları gibi Epson Perfection V750 PRO gibi bir iletim modu tarayıcı kullanılarak toplanabilir.
Uygun bir görüntü analiz programı kullanılarak dizinin her nokta piksel yoğunluğu analiz etmek için bir şablon oluşturun. Uyumlu programlar GE'den ImageQuant veya ArrayVision yazılım, Batı Vizyon sof dahilProfiler Diziler, BioRad Miktar biri, Adobe Photoshop, NIH ImageJ ve Protein Basit AlphaView proteom özgü şablonları ile tware.
Microsoft Excel gibi bir programda manipülasyon için bir elektronik tablo dosyasına sinyal değerlerini aktarın.
Her RTK temsil yinelenen lekeler çiftinin ortalama sinyal (piksel yoğunluğu) belirleyin.
Her nokta bir ortalama arka plan sinyali çıkarın. Dizi ya da bir arka plan değeri olarak negatif kontrol noktaları açık bir alan bir sinyal kullanın.
Numuneler arasındaki RTK fosforilasyon seviyeleri göreceli değişiklik belirlemek için farklı dizilerde karşılık gelen sinyalleri karşılaştırın.

4. Temsilcisi Sonuçlar

Bu protokol, insan Fosfo-RTK dizisi RTK fosforilasyonu üzerinde ligand uyarılması ve inhibitörlerinin etkilerini taranması için nasıl kullanılabileceğini göstermektedir. Şekil 1 'de, veri 100 ng ile muamele edilmiş, tedavi edilmemiş olan MDA-MB-453 hücreleri için gösterilir5 dk, veya bilinen ErbB aile inhibitörleri önce HRGβ1 tedavi için ^8-11 ile önceden tedavi edilen / ml rhNRG-β1/HRG-β1 (HRG-β1). Inhibitörü deneyler için, hücreler 1 uM HDS 029, 200 nM PD 153035, ya da üç saat boyunca 200 nM SFM PD 158780 ile birlikte inkübe edildi. Her dizinin lisatı 100 ug ile inkübe edildi. Fosforilasyon bir artış ErbB2, ErbB3 için gözlendi ve ErbB4 yakalama noktalar HRG-β1 ile tedavi edilmemiş hücrelerin karşılaştırma MDA-MB-453 hücrelerinin tedavi edilir. Önceki HRG-β1 inkübasyon için her üç ErbB aile selektif inhibitörleri ile hücrelerin tedavi ErbB2 azalmalar, ErbB3, ErbB4 ve fosforilasyon neden olmuştur.

Şekil 2, veri RTK FGF, R2 overexpress için bilinen Kato III hücrelerine için gösterilir. Bu deney kümesinde, Kato III hücrelerine önce ile muamele ile 100 ng / ml rhFGF asidik (FGF) ve 1 ug / ml heparin, ya da FGF R ^12-15 selektif inhibitörleri ile işlemden geçirilmiş ile muamele edilmiş, tedavi edilmemiş edilerekFGF ve heparin. Inhibitörleri PD173074, PD 161570, PD 166285 ve 1 uM bir konsantrasyonda kullanılmakta ve serumsuz ortam içinde, 3 saat boyunca Kato III hücre ile enkübe edildi. EGF R ve işlenmemiş KATO III hücrelerinde FGF R2 hem kurucu fosforilasyon, FGF R2 fosforilasyon bir artış olsa da FGF tedavisi üzerine gözlenmiştir. PD 173074 ile hücreler inkübe, PD 161570, PD 166285 veya FGF, R2 ve EGF R fosforilasyon azalma ile sonuçlanmıştır. Bu inhibitörler FGF R aile üyelerinin fosforilasyon etkiler bilinmesine rağmen, bu sonuçlar, inhibitör spesifik bir konsantrasyon, bu durumda bu tür EGF R gibi diğer RTKlar, üzerinde olası etkileri izlenmesi için insan fosfo-RTK dizi fayda gösterir.

Şekil 1. Recep indüksiyonu ve inhibisyonumeme kanseri hücrelerinde tor tirozin kinaz fosforilasyon. Proteome Profiler'ı İnsan fosfo-RTK dizileri ve karşılık gelen histogram profillerden Dizi görüntüleri gösterilir. MDA-MB-453 hücrelerinin tedavi edilmemiş ya da RTK inhibitörleri NRG-β1/HRG-β1 ile Örnek ile muamele edildi. Dizi MDA-MB-453 hücrelerinde kinaz fosforilasyon üzerine inhibitörlerinin etkilerini gözlemlemek için kullanıldı. büyük bir rakam görmek için buraya tıklayın .

Şekil 2,
Şekil 2. Bir Proteome Profiler İnsan fosfo-RTK dizisi ve karşılık gelen histogram profillerden indüksiyonu ve mide kanseri hücrelerinde reseptör tirozin kinaz fosforilasyon inhibisyonu. Görüntüler dizisi gösterilir. Kato III hücreler unt vardıreated veya FGF asidik ve heparin ile tedavi takip RTK inhibitörleri ile tedavi. büyük bir rakam görmek için buraya tıklayın .

Referanslar

Henriksson'a ML, Edin, S., Dahlin, AM, Oldenborg, PA, Oberg, A., Van Guelpen, B., Rutegard, J., Stenling, R., ve Palmqvist, R. Kolorektal kanser hücrelerinin aktive edilen bitişik fibroblastlar FGF1/FGFR3 sinyalizasyon ve artan invazyonu. Am. J. Pathol. 178, 1387-1394 (2011).
Morishita, A., Gong, J., Nomura, T., Yoshida, H., Izuishi, K., Suzuki, Y., Kushida, Y., Haba, R., D'Armiento, J., ve Masaki, T. protein dizisinin kullanılması, insan kolon kanseri tedavisi için, hedeflenebilir reseptör tirozin kinazlar tanımlamak için. Int. J. Oncol. 37, 829-835 (2010).
Agaram, NP, Laquaglia, MP, Üstün, B., Guo, T. Wong, GC, Socci, ND, Maki, RG,Pediatrik gastrointestinal stromal tümörlerin DeMatteo, RP, Besmer, P., & Antonescu, CR moleküler karakterizasyonu. Clin. Kanser Araş. 14, 3204-3215 (2008).
Stommel, JM, KimmelKimmelman, AC, Ying, H., Nabioullin, R., Ponugoti, AH, Wiedemeyer, R., Stegh, AH, Bradner, JE, Ligon, KL, Brennan, C., Chin, L., & DePinho, reseptör tirozin kinaz RA Coactivation hedefe yönelik tedaviler, tümör hücrelerinin tepkisini etkiler. Bilim. 318, 287-290 (2007).
Agarwal, S., Zerillo, C., Kolmakova, J., Christensen, JG, Harris, LN, Rimm, DL, DiGiovanna, MP, ve Stern, bir direnç ile yapısal aktive hepatosit büyüme faktörü reseptörünün DF Derneği (Met) küçük olmayan hücreli akciğer kanseri hücrelerinde çift EGFR/Her2 inhibitörü. Br. J. Kanser. 100, 941-949 (2009).
Dewaele, BM Floris, G., Finalet-Ferreiro, J., Fletcher, CD, Coindre, JM, Guillou, L., Hogendoorn, PC, Wozniak, A., Vanspauwen, V., Schoffski, P., MARYNEN, P., Vandenbergh, P., Sciot, R., ve Debiec-Rychter, M. Co-aktif PDGFRA ve EGFR intimal sarkom potansiyel terapötik hedeflerdir. Kanser Araş. 70, 7304-7314 (2010).
Yoon, YK, Kim, HP, Han, GB, Hur, HS Oh, DY, Im, SA, Bang, YJ, & Kim, EGFR ve MEK1 / 2 inhibitörü TY Kombinasyon baskılayarak EGFR/HER3-dependent tarafından sinerjistik etki gösterir insan mide kanseri hücreleri AKT aktivasyonu. Mol. Kanser Ther. 8, 2526-2536 (2009).
Fry, DW, Nelson, JM, Slintak, V., Keller, PR, Rewcastle, GW, Denny, WA, Zhou, H., ve Köprüler, 4 AJ Biyokimyasal ve antiproliferatif özellikleri - [Ar (alk) ilamino] piridopirimidinler, güçlü ve spesifik bir epidermal büyüme faktörü reseptör tirozin kinaz inhibitörlerinin, yeni bir kimyasal sınıf. Biochem. J. Pharmacol. 54, 877-887 (1997).
Bos,M., Mendelsohn, J. Kim, YM, Albanell, J. Fry, DW, & Baselga, J. PD153035, bir tirozin kinaz inhibitörü, epidermal büyüme faktörü reseptör aktivasyonu engeller ve bir reseptör kanser hücrelerinin büyümesini engeller sayısı- bağımlı bir tarzda, J. Clin.. Cancer Res. 3, 2099-2106 (1997).
Stoll, SW, Kansra, S., Peshick, S., Fry, DW, Leopold, WR, Wiesen, JF, Sibilia, M., Zhang, T., Werb, Z., Derynck, R., Wagner, EF, & Elder, normal ve malign keratinositler kıyasla deride ErbB reseptör tirozin kinaz JT Diferansiyel kullanımı ve yerelleştirme. Neoplazi. 3, 339-350 (2001).
Klutchko, SR, Zhou, H., Winters, RT, Tran, TP, Köprüler, AJ, Althau, IW, Amato, DM, Elliott, WL, Meade, Fry MA, Roberts, BJ, DW, Gonzales, AJ, Harvey , PJ, Nelson, JM, Sherwood, V., Han, HK, Pace, G., pencere Classic, JB, Denny, WA, ve Showalter, HD Tirozin kinaz inhibitörleri. 19. 6-alktirozin kinaz reseptörleri ailesinin bir ErbB tersinmez inhibitörleri olarak 4-anilinoquinazolines ve 4-anilinopyrido [3,4-d] pirimidin nyamides. J. Med. Chem. 49, 1475-1485 (2006).
Kunii, K., Davis, L., Gorenstein, J., Hatch, H., Yashiro, M., Di Bacco, A., Elbi, C., ve Lutterbach, B. FGFR2 amplifiye mide kanseri hücre hattı FGFR2 gerektirir ve Erbb3 büyüme ve hayatta kalmak için sinyalizasyon. Kanser Araş. 68, 2340-2348 (2008).
Zhou, W., Hur, W. McDermott, U., Dutt, A., Xian, W., Ficarro, SB, Zhang, J., Sharma, SV, Brugge, J., Meyerson, M., Settleman, J . & Gray, NS kovalent FGFR inhibitörleri oluşturmak için bir yapı güdümlü bir yaklaşım. Chem. Biol. 17, 285-295 (2010).
PD 161570 tarafından FGF-1 reseptör tirozin kinaz aktivitesi Batley, BL, Doherty, AM, Hamby, JM, Lu, GH, Keller, P., Dahring, TK, Hwang, O., Crickard, K., & Panek RL inhibisyonu yeni bir protein-Tirosin kinaz inhibitörüdür. Life Sci. 62. 143-150 (1998).
Panek, RL, Lu GH, Klutchko, SR, Batley, BL, Darhing, TK, Hamby, JM, Hallak, H., Doherty, AM, ve Keiser, PD 166285 in vitro farmakolojik karakterizasyonu JA, yeni nanomolar güçlü ve geniş aktif protein tirozin kinaz inhibitörü. J. Pharmacol. Tec. Ther. 283, 1433-1444 (1997).

Discussion

İnsan Fosfo-RTK gibi RTK fosforilasyon tarama değişiklikler için Batı immünopresipitasyon (IP) gibi geleneksel yöntemlere ekonomik ve hızlı bir alternatiftir. Bu yöntemi kullanarak, 42 fosfo-RTKlar göreli MDA-MB-453 veya Kato III hücre lizat tek bir örnek kullanılarak eş zamanlı tarandı. Buna ek olarak, bu dizi deney bu yöntem çok daha fazla zaman etkili birden fazla IP-Western değerlendirme yerine yapma, 2.5 saat eller zaman gereklidir. Bir kemilüminesans algılama yöntemi kullanılarak, genellikle Batı veri toplamak için kullanılan ötesinde hiçbir özel ekipman gerekli oldu. Diziler hassas olan ve ligand ve inhibitörü ile meydana fosforilasyon değişiklikleri karşılaştırmak için kullanılabilir. Bu yöntem aynı zamanda off-hedef RTKlar için önleyici seçicilik değerlendirilmesine olanak tanımaktadır. Pozitif isabet ayrıca, bu tür bir ELISA gibi bir miktar tayini kullanılarak değerlendirilebilir.

Etkili değişiklikler için ekrana diziler istihdam etmekfosforilasyonu, bazı temel deneysel kurallara uyulmalıdır. İlk deneyler uygun kontrol numuneleri içermelidir. Örneğin, bu deneylerde MDA-MB-453 veya Kato III lizatları üzerine inhibitörlerinin etkisi aynı gün hazırlanan lizat örneklerinde ölçüldü. Aynı deney içinde toplanan Sadece dizi veri numune işleme, kuluçka süresi, pipet tekniği ya da yıkama tekniği nedeniyle sinyal değişimleri en aza indirmek için analiz edilmelidir. Yakalama antikorlar paralel yakınlıkları olması seçilmemiştir beri aynı zarı iki analit arasındaki karşılaştırma sinyal intensitesi, tavsiye edilmez.

Acknowledgments

Bu eser R & D Systems, Inc tarafından finanse edilmiştir

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Human Phospho-RTK Array Kit	R&D Sytems	ARY001
Aprotinin	Sigma	A6279
Leupeptin	Tocris	1167
Pepstatin A	Tocris	1190
MDA-MB-453 cells
Kato III cells
Recombinant Human NRG1-beta 1/HRG1-beta 1 EGF Domain	R&D Systems	396-HB-050
Recombinant Human FGF acidic (aa 16-155)	R&D Systems	232-FA-025
Heparin	Sigma	H4784
HDS 029	Tocris	2646
PD 153035	Tocris	1037
PD 158780	Tocris	2615
PD 173074	Tocris	3044
PD 161570	Tocris	3724
PD 166285	Tocris	3785
BCA assay	Pierce	23225
Phosphate-Buffer Saline (PBS)
Pipettes and pipette tips
Gloves
Deionized or distilled water
Flat-tipped tweezers
Rocking platform shaker
Microcentrifuge
Plastic containers with the capacity to hold 50 ml			For washing arrays
Plastic transparent sheet protector
Plastic wrap
Absorbent lab wipes
Paper towels
Autoradiography cassette
Film developer
Kodak BioMax Light Film	Carestream Health	178 8207
Film developer
Image Station 4000MM PRO	Carestream Health		Chemiluminescence imager compatible with collection of western data may be used instead of film and a film developer.
Epson Perfection Scanner	Epson	V750 PRO	Flatbed scanner with transparency adaptor capable of transmission mode
Image Analysis Software	GE,WesternVision, BioRad, Adobe, NIH, Protein Simple, etc		ImageQuant, ArrayVision, Western Vision, Quantity One, Photoshop, ImageJ, AlphaView, or other compatible program
Microsoft Excel	Microsoft
Computer capable of running image analysis software and Microsoft Excel.