Los cambios de perfiles en la fosforilación de la tirosina quinasa del receptor del uso de arrays de anticuerpos - Publicidad

Summary

Proteome arrays de anticuerpos Profiler son una manera eficiente y costo conveniente para la detección de cambios en receptores tirosina quinasa (RTK) fosforilación sin realizar numerosas inmunoprecipitación (IP) Westerns. La matriz ARY001 RTK humano permite la medición cualitativa de las RTK múltiples en una única muestra usando la detección de quimioluminiscencia.

Abstract

La desregulación de la tirosina quinasa del receptor (RTK) de expresión y fosforilación se asocia frecuentemente con el desarrollo y la propagación metastásica de las células cancerosas. Esfuerzo significativo ^1-3 se ha centrado en desarrollar inhibidores para orientar las RTK específicas e interrumpir las rutas de señalización aberrantes asociados con estados de enfermedad ^4-7. El propósito de este estudio fue medir los efectos de un número selecto de los inhibidores de la fosforilación RTK. Este estudio utilizó el Humano Phospho-RTK matriz, que es un inmunoensayo de sándwich basado en membrana para controlar los aumentos o disminuciones en la fosforilación de RTK numerosos simultáneamente en una única muestra. En este ensayo, tanto las RTK fosforilados y no fosforilados presentes en una muestra de lisado son capturados por los anticuerpos discretas impresas por duplicado a través de una membrana de nitrocelulosa del tamaño de un portaobjetos de microscopio. Después del lavado, los arrays se incubaron con anti-fosfo-tirosina-peroxidasa de rábano (HRP),que sándwiches con RTK fosforilados capturados en la matriz. Después de una segunda etapa de lavado, los arrays se incubaron con reactivos quimioluminiscentes. Señal generada en cada punto de matriz es proporcional a la cantidad de fosfo-proteína unida por cada anticuerpo de captura. En estos experimentos, las matrices se utilizan para medir el aumento de la fosforilación después de la estimulación del ligando de cualquiera de cáncer de mama MDA-MB-453 o células KATO III de carcinoma gástrico, así como para caracterizar la disminución en la fosforilación asociados con el tratamiento de las células con inhibidores selectivos hacia ErbB o FGF R familiares.

Protocol

1. Preparación de la muestra

1. Recoger lisados ​​de tratamiento, tratamiento ligando, o un inhibidor de las células y ligandos tratados siguiendo las directrices de la hoja de datos array Humanos Phospho-RTK. El tampón de lisis que ha sido optimizado para este kit. La sustitución de otros tampones de lisis puede afectar al rendimiento final de la matriz. Para evitar la degradación proteolítica de la muestra, añadir 10 g / ml aprotinina, 10 mg / ml de leupeptina, y 10 ug / ml de pepstatina A para el volumen de tampón de lisis que se requiere para cada preparación de lisado celular fresca para cada uso.
2. Concentración lisado se medirá usando un ácido bicinconínico (BCA) de ensayo. Concentración de la muestra se puede ajustar empíricamente para una sensibilidad óptima y bajo fondo. Una gama de 100-300 g de lisado se recomienda como un punto de partida inicial.
3. Ciclos descongelación / congelación de las muestras deben ser evitados y almacenamiento adecuado de los lisados ​​se requiere para un rendimiento óptimo. Descongele las muestras de lisado en hielo.

1. Lleve todos los componentes del kit a temperatura ambiente antes de su uso. Para evitar la contaminación, use guantes al realizar los procedimientos.
2. Pipetear 2,0 ml de búfer de matriz 1 en cada pocillo de la 4-Bien Múltiples plato para ser utilizado. Buffer matriz 1 sirve como un amortiguador bloque.
3. Utilizando pinzas de punta plana, retire las membranas a utilizar de entre las hojas protectoras y colocar en una fuente de la 4-Bueno multi-plato. El número de serie debe estar mirando hacia arriba.
4. Al entrar en contacto con el tampón de matriz 1, el colorante azul de las manchas desaparecerán, pero los anticuerpos de captura son retenidos en sus ubicaciones específicas.
5. Incubar durante 1 h en una plataforma oscilante. Oriente la bandeja de manera que cada extremo matriz rocas para terminar en su bien. La superficie de la matriz debe ser completamente mojados y cubiertos por tampón de bloqueo.
6. Mientras que las membranas están bloqueando, se diluye la cantidad deseada de lisado celular a un volumen final de 1,5 ml con tampón de matriz 1.
<li> Buffer matriz Aspirar una de las fuentes de la 4-Bueno multi-plato y añadir soluciones diluidas lisado. Coloque la tapa sobre el 4-Bueno multi-plato.
7. Incubar durante la noche a 2-8 ° C en una plataforma oscilante. Un tiempo de incubación más corto puede ser usado si una sensibilidad óptima, no es necesario.
8. Retire cuidadosamente cada membrana de la 4-Bien Múltiples plato y colocar en recipientes individuales de plástico con 20 ml de tampón de lavado 1X. El 4-Bueno Múltiples plato no puede ser utilizado para completar los pasos de lavado. Enjuague el 4-Bueno multi-plato con agua desionizada o destilada y secar bien.
9. Lavar cada membrana con tampón de lavado 1X durante 10 min en un agitador de plataforma oscilante. Repetir dos veces para un total de 3 lavados.
10. Diluir el anti-fosfo-tirosina-peroxidasa de rábano (HRP) en tampón de detección búfer de matriz 1X 2 usando el factor de dilución en la etiqueta del vial. Pipetear 2,0 ml de solución diluida en cada pocillo de la 4-Bien multi-plato.
11. Retire con cuidado cada membrana de su recipiente de lavado.Permitir que el exceso de tampón para drenar de la membrana y la membrana volver a la 4-Bien Múltiples plato que contiene la solución diluida de anti-fosfo-tirosina-HRP. Cubrir los pocillos con la tapa.
12. Incubar durante 2 horas a temperatura ambiente en una plataforma oscilante.
13. Lavar cada matriz como se ha descrito anteriormente.
14. Complete los pasos restantes sin interrupción. Retire con cuidado cada membrana de su recipiente de lavado. Permitir que el exceso de tampón para drenar de la membrana por transferencia el borde inferior sobre el papel absorbente. Colocar cada membrana en un protector de lámina de plástico con el número de identificación hacia arriba.
15. Pipetear 1 ml del reactivo preparado Chemi Mezclar uniformemente sobre cada membrana. Utilizar menos de 1 ml de mezcla de reactivos Chemi por membrana puede dar lugar a una cobertura incompleta de membrana. La sustitución de algunos reactivos de alta intensidad quimioluminiscente para Chemi Reactivos 1 y 2, pueden provocar ya sea aumentado o fondo señal disminuida dependiendo del reactivo.
16. Con cuidado, cubrir con un plásticolámina protectora. Suavemente suavizar las burbujas de aire y asegurar Mix Chemi reactivo se distribuye uniformemente a todos los rincones de cada membrana. Incubar durante 1 min.
17. Toallas de papel en la posición superior y los lados del protector de lámina de plástico que contiene las membranas y cuidadosamente exprimir el exceso de reactivo Mix Chemi.
18. Retire el protector superior lámina de plástico y coloque cuidadosamente un laboratorio paño absorbente en la parte superior de las membranas para borrar cualquier resto de mezcla de reactivos Chemi.
19. Dejando de membranas en el protector de plástico de la hoja inferior, cubra las membranas con un envoltorio de plástico con cuidado de alisar suavemente las burbujas de aire. Envolver el exceso de envoltura de plástico alrededor de la parte posterior del protector de la hoja de modo que las membranas y el protector de hojas están completamente envuelto.
20. Coloque las membranas con los números de identificación hacia arriba, en un casete de película de autorradiografía que no se utiliza con la detección de isótopos radiactivos.
21. Exponer a la película Kodak BioMax Light por 1-10 min. Exposiciones múltiples son recomterminado. Alternativamente, las imágenes pueden ser recolectados a través de una cámara de quimioluminiscencia compatible, como el de Carestream Health Image Station 4000MM PRO.

3. Análisis de Datos

1. Señales positivas observadas en la película revelada se pueden identificar rápidamente mediante la colocación de la superposición de la transparencia en la imagen matriz y alinearlo con los pares de puntos de referencia impresas en las esquinas para este propósito. El número de identificación estampada en la matriz debe ser colocado en el lado izquierdo tenía. La ubicación de los controles y los anticuerpos de captura se enumeran en el Apéndice de la hoja de datos array Humanos Phospho-RTK.
2. Densidades de píxeles en la película desarrollada puede ser recogida mediante un escáner modo de transmisión, tales como el Epson Perfection V750 PRO.
3. Crear una plantilla para analizar la densidad de píxeles en cada punto de la matriz mediante un adecuado análisis de imágenes de software. Programas compatibles incluyen software ImageQuant o ArrayVision de GE, sof Western Visiontware con plantillas específicas para proteoma Arrays Profiler, BioRad Cantidad One, Adobe Photoshop, ImageJ NIH, y AlphaView proteína simple.
4. Exportar valores de señal en un archivo de hoja de cálculo para su manipulación en un programa como Microsoft Excel.
5. Determinar la señal promedio (densidad de píxeles) del par de puntos duplicados que representan cada RTK.
6. Resta una señal de fondo promedio de cada lugar. Utilizar una señal de un área clara de la matriz o de puntos de control negativo como un valor de fondo.
7. Comparar las señales correspondientes en diferentes matrices para determinar el cambio relativo en los niveles de fosforilación de RTK entre las muestras.

4. Los resultados representativos

Este protocolo se muestra cómo el humano Phospho-RTK matriz puede utilizarse para cribar los efectos de la estimulación del ligando y los inhibidores de la fosforilación de RTK. En la Figura 1, se muestran datos para MDA-MB-453 células que no fueron tratadas, se trató con 100 ng/ Ml rhNRG-β1/HRG-β1 (HRG-β1) durante 5 min, o pre-tratados con inhibidores conocidos de la familia ErbB ^8-11 antes de HRGβ1 tratamiento. Para los experimentos de inhibidor, se incubaron las células con 1 mM de HDS 029, 200 nM EP 153035, EP 158780 o 200 nM en SFM durante tres horas. Cada matriz se incubó con 100 g de lisado. Un incremento en la fosforilación se observa para ErbB2, ErbB3, y ErbB4 puntos de captura cuando se comparan las células no tratadas con HRG-β1 tratados MDA-MB-453 células. El tratamiento de las células con los tres inhibidores de la familia erbB selectivos antes de HRG-β1 incubación causó reducciones en ErbB2, ErbB3, ErbB4 y la fosforilación.

En la Figura 2, se muestran datos para las células Kato III conocidos para sobreexpresar la R2 RTK FGF. En este conjunto de experimentos, las células Kato III se dejaron sin tratar, se trataron con 100 ng / ml rhFGF ácido (FGF) y heparina 1 g / ml, o pretratadas con FGF R inhibidores selectivos de ^12-15 antes del tratamiento conFGF y la heparina. El PD173074 inhibidores, PD 161570, y PD 166285 se utilizaron a una concentración de 1 mM y se incubaron con las células Kato III durante 3 horas en medio libre de suero. Si bien no es la fosforilación constitutiva de ambos EGF-R y R2 FGF en células no tratadas KATO III, un incremento en la fosforilación R2 FGF se observó a tratamiento FGF. La incubación de las células con la EP 173074, EP 161570, EP 166285 o como resultado una disminución FGF R2 y la fosforilación de EGF-R. Aunque estos inhibidores son conocidos afecta a la fosforilación de los miembros de la familia de FGF R, estos resultados demuestran la utilidad de la Human Phospho-RTK matriz para monitorizar el efecto de una concentración específica de inhibidor se puede tener en RTKs otros, tales como EGF-R en este caso.

Figura 1. La inducción y la inhibición de receptorestor fosforilación de la tirosina cinasa en las células del cáncer de mama. imágenes de matriz de Proteome Profiler Humanos RTK Phospho-arrays y los perfiles correspondientes histogramas se muestran. MDA-MB-453 células se dejaron sin tratar o tratados con inhibidores de RTK seguido de tratamiento con NRG-β1/HRG-β1. La matriz se utilizó para monitorizar los efectos de los inhibidores de la fosforilación quinasa en MDA-MB-453 células. Haga clic aquí para ampliar la cifra .

Figura 2. Inducción y la inhibición de la fosforilación de tirosina quinasa del receptor en células de cáncer gástrico. Imágenes matriz a partir de un proteoma humano Profiler Phospho-RTK matriz y los perfiles de histograma correspondiente se muestran. Kato células III fueron untreado o tratados con inhibidores de la RTK seguido de tratamiento con FGF ácido y heparina. Haga clic aquí para ampliar la cifra .

Referencias

1. Henriksson, ML, Edin, S., Dahlin, AM, Oldenborg, PA, Oberg, A., Guelpen Van, B., Rutegard, J., Stenling, R., & Palmqvist, R. células del cáncer colorrectal activan los fibroblastos adyacentes resultantes en FGF1/FGFR3 señalización y la invasión creciente. Soy. J. Pathol. 178, 1387-1394 (2011).
2. Morishita, A., Gong, J., Nomura, T., Yoshida, H., Izuishi, K., Suzuki, Y., Kushida, Y., Haba, R., D'Armiento, J., & Masaki, T. El uso de la matriz de proteína para identificar los receptores de tirosina quinasas dirigibles para el tratamiento de cáncer de colon humano. Int. J. Oncol. 37, 829-835 (2010).
3. Agaram, NP, Laquaglia, MP, Ustun, B., Guo, T. Wong, GC, Socci, ND, Maki, RG,DeMatteo, RP, Besmer, P., & Antonescu, CR Caracterización molecular de los tumores pediátricos del estroma gastrointestinal. Clin. Cancer Res. 14, 3204-3215. (2008).
4. Stommel, JM, Kimmelman, AC, Ying, H., Nabioullin, R., Ponugoti, AH, Wiedemeyer, R., Stegh, AH, Bradner, JE, Ligon, KL, Brennan, C., Chin, L., & DePinho, RA coactivación de receptores de tirosina quinasas afecta a la respuesta de las células tumorales a las terapias dirigidas. Science. 318, 287-290 (2007).
5. Agarwal, S., Zerillo, C., Kolmakova, J., Christensen, JG, Harris, LN, Rimm, DL, DiGiovanna, MP, y Stern, DF Asociación de constitutivamente activada del receptor de factor de crecimiento de hepatocitos (Met) con resistencia a un inhibidor dual EGFR/Her2 en la no-células pequeñas células de cáncer de pulmón. fr. J. Cancer. 100, 941-949 (2009).
6. Dewaele, BM, Floris, G., Finalet-Ferreiro, J., Fletcher, CD, Coindre, JM, Guillou, L., Hogendoorn, PC, Wozniak, A., Vanspauwen, V., Schoffski, P., MARYNEN, P., Vandenbergh, P., Sciot, R., & Debiec Rychter-, M. Co-PDGFRA y activado EGFR son objetivos terapéuticos potenciales en el sarcoma intimal. Cancer Res. 70, 7.304 a 7.314 (2010).
7. Yoon, YK, Kim, HP, Han, SW, Hur, HS, Oh, DY, Im, SA, Bang, YJ, y Kim, Combinación IDAD del EGFR y MEK 1/2 inhibidor muestra efectos sinérgicos al suprimir EGFR/HER3-dependent AKT activación en células humanas de cáncer gástrico. Mol. Ther cáncer. 8, 2526-2536 (2009).
8. Fry, DW, Nelson, JM, Slintak, V., Keller, PR, Rewcastle, GW, Denny, WA, Zhou, H., & Bridges, propiedades bioquímicas y AJ antiproliferativos de 4 - [Ar (ALK) ilamino] piridopirimidinas, una nueva clase química de potente y específico inhibidor de factor de crecimiento epidérmico receptor tirosina quinasa. Biochem. Pharmacol. 54, 877-887 (1997).
9. Bos,M., Mendelsohn, J., Kim, YM, Albanell, J., Fry, DW, y Baselga, J. PD153035, un inhibidor de tirosina quinasa, evita que el factor de crecimiento epidérmico activación del receptor e inhibe el crecimiento de células cancerosas en un número de receptores- forma dependiente. Clin. Cancer Res. 3, 2099-2106 (1997).
10. Stoll, SW, Kansra, S., Peshick, S., Fry, DW, Leopold, WR, Wiesen, JF, Sibilia, M., Zhang, T., Werb, Z., Derynck, R., Wagner, EF, y personas mayores, la utilización de JT diferencial y la localización de tirosina cinasas receptoras erbB en la piel en comparación con los queratinocitos normales y malignas. Neoplasia. 3, 339-350 (2001).
11. Klutchko, SR, Zhou, H. Winters, RT, Tran, TP, Bridges, AJ, Althau, IW, Amato, DM, Elliott, WL, Meade, MA, Roberts, BJ, Fry, DW, Gonzales, AJ, Harvey , PJ, Nelson, JM, Sherwood, V., Han, HK, Pace, G., Smaill, JB, Denny, WA, y Showalter, HD inhibidores de la tirosina cinasa. 19. 6-alknyamides de 4-anilinoquinazolinas y 4-anilinopyrido [3,4-d] pirimidinas como inhibidores irreversibles de la familia ErbB de receptores tirosina quinasa. J. Med. Chem. 49, 1475-1485 (2006).
12. Kunii, K., Davis, L., Gorenstein, J., Hatch, H., Yashiro, M., Di Bacco, A., Elbi, C., & Lutterbach, B. FGFR2-amplificación de líneas celulares de cáncer gástrico requieren FGFR2 y ErbB3 de señalización para el crecimiento y la supervivencia. Cancer Res. 68, 2340-2348 (2008).
13. Zhou, W., Hur, W. McDermott, U., Dutt, A., Xian, W., Ficarro, SB, Zhang, J., Sharma, SV, Brugge, J., Meyerson, M., Settleman, J . & Gray, NS Un enfoque estructura guiada a la creación de inhibidores covalentes FGFR. Chem. Biol.. 17, 285-295 (2010).
14. Batley, BL, Doherty, AM, Hamby, JM, Lu, GH, Keller, P., Dahring, TK, Hwang, O., Crickard, K., & Panek RL La inhibición de la actividad de FGF-1 receptor de la tirosina cinasa de PD 161570 , una proteína nuevaDe la tirosina quinasa. Life Sci. 62 143-150 (1998).
15. Panek, RL, Lu GH, Klutchko, SR, Batley, BL, Darhing, TK, Hamby, JM, Hallak, H., Doherty, AM, y Keiser, JA En la caracterización farmacológica in vitro de la EP 166285, una nueva y potente nanomolar y ampliamente tirosina activo inhibidor de la proteína quinasa. J. Pharmacol. Exp. Ther. 283, 1433-1444 (1997).

Discussion

The Human fosfo-RTK es una alternativa económica y rápida a los métodos tradicionales, como la inmunoprecipitación (IP) Western detección de cambios en la fosforilación de RTK. Usando este método, los niveles relativos de 42 fosfo-RTK se rastrearon simultáneamente usando una sola muestra de MDA-MB-453 o lisado celular Kato III. Además, este ensayo requiere array 2,5 horas de práctica en el tiempo, por lo que este método mucho más efectivo que el tiempo de realización de múltiples IP-Oeste. Mediante el empleo de un método de detección de quimioluminiscencia, ningún equipo especializado más allá de lo que se suele utilizar para recoger datos occidentales se requería. Las matrices son sensibles y pueden ser utilizados para comparar los cambios en la fosforilación causada tanto por ligando y el tratamiento con inhibidor. Este método también permite la evaluación de la selectividad de inhibidor de RTK fuera de objetivo. Éxitos positivos pueden ser adicionalmente evaluada usando un ensayo cuantitativo tal como un ELISA.

Para emplear eficazmente las matrices para la detección de cambiosen la fosforilación, algunas pautas experimentales clave deben ser seguidas. En primer lugar, los experimentos deben incluir muestras de control adecuadas. Por ejemplo, en estos experimentos el efecto de los inhibidores de MDA-MB-453 o Kato III lisados ​​se midió en las muestras de lisado preparadas el mismo día. Sólo los datos de matriz que se recoge dentro del mismo experimento deben ser analizados para minimizar las variaciones en la señal debido a las diferencias en el manejo de muestras, tiempo de incubación, la técnica de pipeta, o la técnica de lavado. Comparación de las intensidades de señal entre dos analitos en la misma membrana no es recomendable, ya que los anticuerpos de captura no fueron seleccionados para tener afinidades paralelas.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Human Phospho-RTK Array Kit	R&D Sytems	ARY001
Aprotinin	Sigma	A6279
Leupeptin	Tocris	1167
Pepstatin A	Tocris	1190
MDA-MB-453 cells
Kato III cells
Recombinant Human NRG1-beta 1/HRG1-beta 1 EGF Domain	R&D Systems	396-HB-050
Recombinant Human FGF acidic (aa 16-155)	R&D Systems	232-FA-025
Heparin	Sigma	H4784
HDS 029	Tocris	2646
PD 153035	Tocris	1037
PD 158780	Tocris	2615
PD 173074	Tocris	3044
PD 161570	Tocris	3724
PD 166285	Tocris	3785
BCA assay	Pierce	23225
Phosphate-Buffer Saline (PBS)
Pipettes and pipette tips
Gloves
Deionized or distilled water
Flat-tipped tweezers
Rocking platform shaker
Microcentrifuge
Plastic containers with the capacity to hold 50 ml			For washing arrays
Plastic transparent sheet protector
Plastic wrap
Absorbent lab wipes
Paper towels
Autoradiography cassette
Film developer
Kodak BioMax Light Film	Carestream Health	178 8207
Film developer
Image Station 4000MM PRO	Carestream Health		Chemiluminescence imager compatible with collection of western data may be used instead of film and a film developer.
Epson Perfection Scanner	Epson	V750 PRO	Flatbed scanner with transparency adaptor capable of transmission mode
Image Analysis Software	GE,WesternVision, BioRad, Adobe, NIH, Protein Simple, etc		ImageQuant, ArrayVision, Western Vision, Quantity One, Photoshop, ImageJ, AlphaView, or other compatible program
Microsoft Excel	Microsoft
Computer capable of running image analysis software and Microsoft Excel.