Modifiche profiling in fosforilazione recettore tirosina chinasi utilizzando Array Anticorpo - Pubblicità

Summary

Proteoma array di anticorpi Profiler sono un modo conveniente ed efficiente per controllare i cambiamenti delle recettore tirosin-chinasi (RTK) fosforilazione senza eseguire numerosi immunoprecipitazione (IP) Western. La matrice ARY001 RTK umana consente la misura qualitativa di RTK multipli in un singolo campione mediante chemiluminescenza.

Abstract

La disregolazione di recettore tirosina chinasi (RTK), l'espressione e la fosforilazione è frequentemente associata alla diffusione di sviluppo e metastatica delle cellule tumorali. ^1-3 notevole impegno si è concentrato sugli inibitori in via di sviluppo per indirizzare specifiche RTK e interrompere le vie di segnalazione aberranti associate a stati di malattia . ^4-7 La scopo di questo studio è stato quello di misurare gli effetti di un numero selezionato di inibitori sulla fosforilazione RTK. Questo studio ha utilizzato l'Umano fosfo-RTK array, che è un immunodosaggio su membrana a sandwich per monitorare aumenti o diminuzioni nella fosforilazione di RTK numerosi simultaneamente in un singolo campione. In questo saggio, sia RTK fosforilata e non fosforilata presenti in un campione lisato sono catturati da anticorpi discreti stampati in duplicato su una membrana di nitrocellulosa delle dimensioni di un vetrino da microscopio. Dopo il lavaggio, gli array sono incubati con anti-fosfo-tirosina-perossidasi di rafano (HRP),che panini con RTK fosforilata catturati sulla matrice. A seguito di una seconda fase di lavaggio, gli array sono incubati con reagenti chemiluminescenti. Segnale generato ad ogni punto di matrice è proporzionale alla quantità di fosfo-proteina legata per ciascun anticorpo di cattura. In questi esperimenti, gli array sono stati utilizzati per misurare aumenti fosforilazione dopo stimolazione del ligando o MDA-MB-453 cancro al seno o KATO III cellule di carcinoma gastrico, nonché per caratterizzare diminuzione fosforilazione legati al trattamento delle cellule con inibitori selettivi verso ErbB o FGF R familiari.

Protocol

1. Preparazione del campione

1. Raccogliere lisati da non trattata, trattata ligando, o inibitore e le cellule trattate ligando seguendo le linee guida del umano fosfo-RTK datasheet array. Il tampone di lisi è stata ottimizzata per questo kit. La sostituzione dei tamponi di lisi altri possono influenzare le prestazioni finali della matrice. Per evitare la degradazione proteolitica campione, aggiungere 10 ug / ml di aprotinina, 10 pg / ml di leupeptina, e 10 ug / ml di pepstatina A al volume di tampone di lisi richiesti per ogni campione lisato di cellule fresche per ogni uso.
2. Lisato concentrazione deve essere misurata utilizzando un acido bicinconinico (BCA) dosaggio. Concentrazione del campione può essere empiricamente regolato per sensibilità ottimale e basso fondo. Una gamma di 100-300 mg di lisato è raccomandato come un punto di partenza iniziale.
3. Cicli gelo / disgelo di campioni deve essere evitato e la corretta conservazione dei lisati è necessaria per ottenere prestazioni ottimali. Scongelare i campioni congelati lisato su ghiaccio.

1. Portare tutti i componenti del kit a temperatura ambiente prima dell'uso. Per evitare la contaminazione, indossare i guanti durante l'esecuzione delle procedure.
2. Pipettare 2,0 ml di tampone Array 1 in ciascun pozzetto della 4-Well Multi-piatto da utilizzare. Buffer matrice 1 funge da buffer di blocco.
3. Utilizzo a testa piatta pinzette, rimuovere ogni membrana da utilizzare tra gli strati di protezione e collocare in un pozzo del 4-Well Multi-piatto. Il numero di serie deve essere rivolto verso l'alto.
4. In caso di contatto con tampone Array 1, il colorante blu dalle macchie scompaiono, ma gli anticorpi di cattura vengono mantenuti nelle loro posizioni specifiche.
5. Incubare per 1 ora su una piattaforma oscillante. Orientare il vassoio in modo che ogni estremità matrice rocce per finire nel suo bene. La superficie della matrice deve essere completamente bagnata e coperta da buffer di blocco.
6. Mentre le membrane è bloccare, diluire la quantità desiderata di lisato cellulare per un volume finale di 1,5 ml con tampone Array 1.
<li> Buffer Array Aspirare 1 da pozzi della 4-Well Multi-piatto e aggiungere soluzioni diluite lisato. Mettere il coperchio sul 4-Well Multi-piatto.
7. Incubare per una notte a 2-8 ° C su una piattaforma oscillante. Un tempo di incubazione più breve può essere utilizzata se la sensibilità ottimale non è necessaria.
8. Rimuovere con cura ogni membrana dal 4-Well Multi-piatto e il luogo in singoli contenitori di plastica con 20 ml di tampone di lavaggio 1X. L'hotel a 4-Well Multi-piatto non può essere utilizzato per completare le fasi di lavaggio. Sciacquare la 4-Well Multi-piatto con acqua deionizzata o distillata e asciugare accuratamente.
9. Lavare ogni membrana con tampone di lavaggio 1X per 10 min su una piattaforma oscillante shaker. Ripetere due volte per un totale di 3 lavaggi.
10. Diluire l'anti-fosfo-tirosina-perossidasi di rafano (HRP) rilevamento buffer in 1X tampone Array 2 utilizzando il fattore di diluizione sull'etichetta del flacone. Pipettare 2,0 ml di soluzione diluita in ciascun pozzetto della 4-Well Multi-piatto.
11. Rimuovere con cura ogni membrana dal suo contenitore di lavaggio.Permettono tampone in eccesso dalla membrana e la membrana ritorna al 4-Well Multi-piatto contenente il diluita anti-fosfo-tirosina-HRP. Coprire i pozzetti con il coperchio.
12. Incubare per 2 ore a temperatura ambiente su una piattaforma oscillante.
13. Lavare ogni matrice come descritto in precedenza.
14. Completare i passaggi rimanenti senza interruzione. Rimuovere con cura ogni membrana dal suo contenitore di lavaggio. Lasciare tampone in eccesso dalla membrana tamponando il bordo inferiore su carta assorbente. Posizionare ogni membrana su un protettore foglio di plastica con il numero di identificazione rivolto verso l'alto.
15. Pipettare 1 ml del reagente preparato Chemi Mescolare in modo uniforme su ogni membrana. Utilizzando meno di 1 ml di miscela di reagente Chemi per membrana può causare una copertura incompleta della membrana. Sostituzione di alcuni reagenti ad alta intensità per reagenti chemiluminescenti Chemi 1 e 2 possono provocare sia sfondo aumentata o diminuita a seconda del segnale del reagente.
16. Coprire accuratamente con una plasticafoglio di protezione. Delicatamente appianare eventuali bolle d'aria e garantire Mix reagente Chemi si diffonde in modo uniforme in tutti gli angoli di ogni membrana. Incubare per 1 min.
17. Asciugamani di carta di posizione sulla parte superiore e sui lati della protezione foglio di plastica che contiene le membrane e con attenzione spremere eccesso Mix Reagente Chemi.
18. Rimuovere la protezione superiore foglio di plastica e adagiare un laboratorio assorbente imbevuto di sopra delle membrane per cancellare l'eventuale restante miscela di reagente Chemi.
19. Lasciando membrane sul foglio di plastica di protezione basso, coprire le membrane con la pellicola trasparente avendo cura di lisciare delicatamente eventuali bolle d'aria. Avvolgere la pellicola di plastica in eccesso intorno alla parte posteriore del foglio di protezione in modo che le membrane e protettore foglio vengono completamente avvolta.
20. Posizionare le membrane con i numeri di identificazione rivolti verso l'alto, in un rullino autoradiografia che non viene utilizzato con rilevamento isotopo radioattivo.
21. Esporre su pellicola Kodak Luce BioMax per 1-10 min. Esposizioni multiple sono raccomfinita. In alternativa, le immagini possono essere raccolti utilizzando un sensore compatibile chemiluminescenza come la Carestream Health Immagine Stazione 4000MM PRO.

3. Analisi dei dati

1. Segnali positivi osservati sulla pellicola sviluppata possa individuare rapidamente ponendo la sovrapposizione trasparenza sull'immagine matrice e allineandolo con le coppie di punti di riferimento stampati negli angoli per questo scopo. Il numero di identificazione stampato sulla matrice deve essere posizionato sul lato sinistro aveva. La posizione dei controlli e anticorpi di cattura sono elencati in appendice della Human fosfo-RTK datasheet array.
2. Densità di pixel su pellicola sviluppata possono essere raccolti con una trasmissione in modalità scanner, come la Epson Perfection V750 PRO.
3. Creare un modello per analizzare la densità di pixel in ogni punto della matrice utilizzando un apposito programma di analisi software di imaging. Programmi compatibili includono software ImageQuant o ArrayVision da GE, sof Vision occidentaletware con modelli specifici per proteoma Array Profiler, BioRad Quantity One, Adobe Photoshop, NIH ImageJ e AlphaView proteina semplice.
4. Esporta i valori del segnale in un file di foglio di calcolo per la manipolazione in un programma come Microsoft Excel.
5. Determinare il segnale medio (densità di pixel) della coppia di punti duplicati rappresentano ogni RTK.
6. Sottrarre un segnale mediato sfondo da ogni macchia. Utilizzare un segnale proveniente da una zona libera della matrice o macchie di controllo negativo come valore di fondo.
7. Confrontare i segnali corrispondenti matrici differenti per determinare la variazione relativa in livelli di fosforilazione RTK tra campioni.

4. Risultati rappresentativi

Questo protocollo dimostra come l'umano Phospho-RTK matrice può essere usata per selezionare gli effetti della stimolazione ligando e inibitori sulla fosforilazione RTK. In figura 1, dato viene mostrato per MDA-MB-453 cellule che erano non trattata, trattata con 100 ng/ Ml rhNRG-β1/HRG-β1 (HRG-β1) per 5 min, o pre-trattati con inibitori noti della famiglia ErbB ^8-11 prima HRGβ1 trattamento. Per gli esperimenti di inibitori, le cellule sono state incubate con 1 pM HDS 029, 200 nM PD 153.035, o 200 nM PD 158.780 in SFM per tre ore. Ogni matrice è stata incubata con 100 microgrammi di lisato. Un aumento di fosforilazione è osservato per ErbB2, ErbB3 e ERBB4 macchie di cattura quando si confrontano le cellule non trattate con HRG-β1 trattati MDA-MB-453 cellule. Il trattamento delle cellule con tutti e tre gli inibitori selettivi della famiglia ErbB prima HRG-β1 incubazione causato riduzioni ErbB2, ERBB3 e ErbB4 fosforilazione.

In figura 2, dato viene mostrato per cellule Kato III noti per sovraesprimere R2 RTK FGF. In questa serie di esperimenti, Kato III erano cellule non trattate, trattate con 100 ng / ml rhFGF acido (FGF) e 1 mg / ml di eparina, o pretrattati con FGF R inibitori selettivi ^12-15 prima del trattamento conFGF ed eparina. Il PD173074 inibitori, PD 161.570, 166.285 e PD sono stati usati ad una concentrazione di 1 pM e incubati con le cellule Kato III per 3 ore in siero media liberi. Mentre non vi è fosforilazione costitutiva sia R EGF e FGF R2 in cellule non trattate KATO III, un aumento fosforilazione R2 FGF è stato osservato dopo trattamento FGF. Incubazione delle cellule con PD 173074, PD 161570, 166285 o PD ha determinato una riduzione FGF R2 e EGF fosforilazione R. Sebbene questi inibitori sono noti influenzare la fosforilazione dei membri della famiglia FGF R, questi risultati dimostrano l'utilità della Human Phospho-RTK matrice per monitorare l'effetto di una specifica concentrazione di inibitore può avere su RTKs altri, come EGF R in questo caso.

Figura 1. Induzione e inibizione della ricezionetor fosforilazione della tirosina chinasi in cellule di cancro al seno. immagini Array di proteoma Profiler umani fosfo-RTK array e dei profili corrispondenti istogrammi vengono visualizzati. MDA-MB-453 cellule erano trattati o trattati con inibitori RTK seguita da trattamento con NRG-β1/HRG-β1. L'array è stato utilizzato per monitorare gli effetti degli inibitori di chinasi fosforilazione in MDA-MB-453 cellule. Clicca qui per ingrandire la figura .

Figura 2. Immagini Array induzione e inibizione della fosforilazione recettore tirosin-chinasi in cellule di cancro gastrico. Da un proteoma umano Profiler fosfo-RTK array e dei profili corrispondenti istogrammi vengono visualizzati. Kato cellule III sono state untreated o trattati con inibitori RTK seguito da trattamento con acido FGF ed eparina. Clicca qui per ingrandire la figura .

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Discussion

The Human fosfo-RTK è un'alternativa economica e veloce per i metodi tradizionali come immunoprecipitazione (IP) Western per i cambiamenti di screening nella fosforilazione RTK. Usando questo metodo, i livelli relativi di 42 fosfo-RTKs stati selezionati simultaneamente utilizzando un unico campione di MDA-MB-453 o lisato cellulare Kato III. Inoltre, questo saggio matrice richiesta 2,5 hr di mani-in tempo, rendendo questo metodo molto più tempo efficace di eseguire più IP-western. Con l'ausilio di un metodo di rilevazione di chemiluminescenza, senza attrezzature specializzate al di là di ciò che viene in genere utilizzato per raccogliere i dati è stato richiesto occidentali. Array sono sensibili e possono essere utilizzati per confrontare i cambiamenti nella fosforilazione causate dai ligando e trattamento inibitore. Questo metodo consente anche la valutazione della selettività inibitore di off-target RTKs. Risultati positivi possono essere ulteriormente valutata usando un saggio quantitativo come un ELISA.

Per utilizzare in modo efficace gli array per controllare i cambiamentinella fosforilazione, alcune linee guida fondamentali sperimentali devono essere seguite. In primo luogo, gli esperimenti devono includere campioni di controllo appropriate. Ad esempio, in questi esperimenti l'effetto degli inibitori di MDA-MB-453 o Kato III lisati sono stati misurati su campioni lisati preparati nello stesso giorno. Dati di matrice solo che vengono raccolti entro lo stesso esperimento devono essere analizzate per minimizzare le variazioni di segnale dovute a differenze di manipolazione dei campioni, il tempo di incubazione, tecnica pipetta, o tecnica di lavaggio. Intensità di segnale confronto tra due analiti sulla membrana stessa non è raccomandato, in quanto gli anticorpi di cattura non sono stati selezionati per avere affinità parallele.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Human Phospho-RTK Array Kit	R&D Sytems	ARY001
Aprotinin	Sigma	A6279
Leupeptin	Tocris	1167
Pepstatin A	Tocris	1190
MDA-MB-453 cells
Kato III cells
Recombinant Human NRG1-beta 1/HRG1-beta 1 EGF Domain	R&D Systems	396-HB-050
Recombinant Human FGF acidic (aa 16-155)	R&D Systems	232-FA-025
Heparin	Sigma	H4784
HDS 029	Tocris	2646
PD 153035	Tocris	1037
PD 158780	Tocris	2615
PD 173074	Tocris	3044
PD 161570	Tocris	3724
PD 166285	Tocris	3785
BCA assay	Pierce	23225
Phosphate-Buffer Saline (PBS)
Pipettes and pipette tips
Gloves
Deionized or distilled water
Flat-tipped tweezers
Rocking platform shaker
Microcentrifuge
Plastic containers with the capacity to hold 50 ml			For washing arrays
Plastic transparent sheet protector
Plastic wrap
Absorbent lab wipes
Paper towels
Autoradiography cassette
Film developer
Kodak BioMax Light Film	Carestream Health	178 8207
Film developer
Image Station 4000MM PRO	Carestream Health		Chemiluminescence imager compatible with collection of western data may be used instead of film and a film developer.
Epson Perfection Scanner	Epson	V750 PRO	Flatbed scanner with transparency adaptor capable of transmission mode
Image Analysis Software	GE,WesternVision, BioRad, Adobe, NIH, Protein Simple, etc		ImageQuant, ArrayVision, Western Vision, Quantity One, Photoshop, ImageJ, AlphaView, or other compatible program
Microsoft Excel	Microsoft
Computer capable of running image analysis software and Microsoft Excel.