Profilering Endringer i tyrosinkinase Fosforylering ved bruk av antistoff Arrays - Reklame

Summary

Proteom Profiler antistoff arrays er en praktisk og kostnadseffektiv måte å screene for endringer i reseptor tyrosin kinase (RTK) fosforylering uten å utføre mange immunoutfelling (IP) Westerns. Den ARY001 Menneskelig RTK matrise tillater for kvalitativ måling av flere RTK i en enkelt prøve med kjemiluminescens deteksjon.

Abstract

Den feilregulering av reseptor tyrosin kinase (RTK) uttrykk og fosforylering er ofte forbundet med utvikling og metastatisk spredning av kreftceller. ^1-3 Betydelig innsats har blitt fokusert på å utvikle hemmere for å målrette bestemte RTK og avbryte avvikende signalveier assosiert med sykdom stater . ^4-7 Hensikten med denne studien var å måle effekten av et utvalgt antall hemmere på RTK fosforylering. Denne studien benyttet Human Phospho-RTK matrise, som er en membran basert-sandwich immunoassay å overvåke økning eller reduksjon i fosforylering for mange RTK samtidig i en enkelt prøve. I denne analysen, både fosforylerte og unphosphorylated RTK presentere i et lysat prøve er fanget av diskrete antistoffer trykt i duplikat på en nitrocellulosemembran størrelsen av et objektglass. Etter vasking, blir oppstillingene inkubert med anti-fosfo-tyrosin-pepperrot peroksidase (HRP),som smørbrød med fosforylerte RTK tatt på tabellen. Etter en andre vasketrinn, blir arrays inkubert med kjemiluminescerende reagenser. Signal generert ved hver matrise spot er proporsjonal med mengden av fosfo-protein bundet av hver henting antistoff. I disse eksperimentene, ble arrays brukes til å måle økninger i fosforylering etter ligand stimulering av enten MDA-MB-453 brystkreft eller KATO III gastrisk karcinomceller, samt å karakterisere nedgang i fosforylering forbundet med behandling av celler med inhibitorer selektive mot ErbB eller FGF R familiemedlemmer.

Protocol

1. Prøvepreparering

1. Samle lysates fra ubehandlet, ligand behandlet, eller hemmer og ligand behandlede celler følge retningslinjene i Human Phospho-RTK rekke dataark. Lysis buffer er optimalisert for dette settet. Substitusjon av andre lysis buffere kan påvirke den endelige ytelsen i matrisen. Å forhindre proteolytisk sample degradering, tilsett 10 ug / ml aprotinin, 10 ug / ml leupeptin, og 10 ug / ml Pepstatin A til volumet av lyseringsbuffer kreves for hver cellelysat forberedelse frisk for hver bruk.
2. Lysatet konsentrasjon skal måles ved hjelp av en bicinchoninic syre (BCA) assay. Eksempel konsentrasjon kan empirisk justeres for optimal følsomhet og lavt bakgrunn. Et utvalg av 100-300 ug lysat anbefales som en innledende utgangspunkt.
3. Fryse / tine sykluser av prøvene bør unngås og riktig oppbevaring av lysates er nødvendig for optimal ytelse. Tine frosne lysate prøver på isen.

1. Bring alle kit komponenter til romtemperatur før bruk. For å unngå forurensning, hansker mens du utfører prosedyrene.
2. Pipetter 2,0 ml Array buffer 1 i hver brønn av den 4-Well Multi-tallerken som skal brukes. Array Buffer 1 fungerer som en blokk buffer.
3. Bruke flat-tip pinsett, fjerner du hver membran som skal brukes fra mellom de beskyttende ark og legg i en brønn 4-Godt Multi-parabolen. Matrisen nummer skal vende oppover.
4. Ved kontakt med Array buffer 1, vil den blå fargestoff fra stedene forsvinne, men fangstinnstillingene antistoffer beholdes i deres spesifikke steder.
5. Inkuber i 1 time på en gyngende plattform. Orientere skuffen slik at hver rekke bergarter ende til ende i godt sin. Overflaten av matrisen bør helt fuktet og dekket av blokk buffer.
6. Mens membranene blokkerer, fortynne den ønskede mengden av cellulært lysat til et sluttvolum på 1,5 ml med Array buffer 1.
<li> Sug Array buffer 1 fra brønnene på det 4-Godt Multi-form og legg i fortynnede lysat løsninger. Sett lokket på 4-Godt Multi-parabolen.
7. Inkuber over natten ved 2-8 ° C på en gyngende plattform. En kortere inkubasjonstid kan benyttes dersom optimal følsomhet ikke er nødvendig.
8. Fjern forsiktig hver membran fra 4-Godt Multi-tallerken og fyll i enkelte plastbeholdere med 20 ml 1X vaskebuffer. Det 4-brønns Multi-tallerken kan ikke brukes til å fullføre vasketrinnet. Skyll 4-Godt Multi-tallerken med avionisert eller destillert vann og tørk grundig.
9. Vask hver membran med 1X vaskebuffer i 10 min på en gyngende plattform shaker. Gjenta to ganger for totalt 3 vasker.
10. Fortynn anti-fosfo-tyrosin-pepperrot peroksidase (HRP) deteksjon buffer i 1X Array Buffer 2 hjelp fortynningsfaktoren på flaskeetiketten. Pipetter 2,0 ml fortynnet oppløsning i hver brønn av den 4-Well Multi-tallerken.
11. Fjern forsiktig hver membran fra sin vask container.At overskytende buffer renne fra membranen og returnere membranen til 4-brønners Multi-tallerken med den fortynnede anti-fosfo-tyrosin-HRP. Dekk brønnene med lokket.
12. Inkuber i 2 timer ved romtemperatur på en gyngende plattform.
13. Vask hver matrise som beskrevet tidligere.
14. Fullfør de gjenværende trinnene uten avbrudd. Fjern forsiktig hver membran fra sin vask container. At overskytende buffer renne fra membranen av blotting underkanten på absorberende papir. Plasser hver membran på en plastduk protector med identifikasjonsnummer opp.
15. Pipetter 1 ml av den tilberedte Chemi Reagent Bland jevnt på hver membran. Bruker mindre enn 1 ml Chemi Reagent Mix pr membranen kan resultere i ufullstendig membran dekning. Substitusjon av noen høyintensitets kjemiluminescerende reagenser for Chemi Reagenser 1 og 2 kan forårsake enten økt bakgrunn eller redusert signal avhengig reagenset.
16. Nøye dekke med plastark beskytter. Forsiktig jevne ut eventuelle luftbobler og sikre Chemi Reagent Mix er spredt jevnt til alle hjørner av hvert membran. Inkuber i 1 min.
17. Posisjon papirhåndklær på toppen og sidene av plast ark protector inneholder membraner og nøye klem ut overflødig Chemi Reagent Mix.
18. Fjern den øverste plast ark beskytter og nøye lå en absorberende lab tørk på toppen av membraner å utslette av eventuelle gjenværende Chemi Reagent Mix.
19. Leaving membraner på bunnen plast ark beskytter, dekker membraner med plastfolie ta vare å forsiktig jevne ut eventuelle luftbobler. Pakk overskytende plastfolie rundt baksiden av arket, slik at beskytteren membranene og ark protector er helt innpakket.
20. Plasser membraner med identifikasjonsnumrene vender opp, i en autoradiografi film kassett som ikke brukes med radioaktiv isotop deteksjon.
21. Utsettes for Kodak BioMax Lys film for 1-10 min. Flere eksponeringer er recommavsluttet. Alternativt kan bildene bli samlet inn ved hjelp en kjemiluminescens kompatibel imager som Carestream Helse Bilde Station 4000mm PRO.

3. Dataanalyse

1. Positive signaler sett på fremkalt film kan raskt identifiseres ved å plassere gjennomsiktigheten overlegget matrisen bilde og justert med parene av referanse flekker trykt i hjørnene for dette formålet. Stemplet identifikasjonsnummer på tabellen skal plasseres på venstre hadde side. Plasseringen av kontroller og fange antistoffer er oppført i vedlegget av Human Phospho-RTK rekke dataark.
2. Pixel tetthet på fremkalt film kan samles ved hjelp av en overføring-modus skanner som Epson Perfection V750 PRO.
3. Lag en mal for å analysere pikseltetthet i hver spot av tabellen med en passende bildebehandling analyse program. Kompatible programmer inkluderer ImageQuant eller ArrayVision programvare fra GE, Western Vision SOFtware med maler som er spesifikke for proteom Profiler Arrays, BioRad One Antall, Adobe Photoshop, NIH ImageJ, og Protein Simple AlphaView.
4. Eksportere signalverdiene til et regneark for manipulasjon i et program som Microsoft Excel.
5. Bestem den gjennomsnittlige signal (pikseltetthet) av paret av dupliserte flekker som representerer hver RTK.
6. Trekk fra en gjennomsnittlig bakgrunn signal fra hver spot. Bruke et signal fra et ledig område av matrisen eller negative kontrollprøver flekker som bakgrunnsverdi.
7. Sammenligne tilsvarende signaler på forskjellige linjer for å bestemme den relative endringen i RTK fosforylering nivåer mellom prøvene.

4. Representant Resultater

Denne protokollen demonstrerer hvordan Human Phospho-RTK matrise kan brukes til å screene effektene av ligand stimulering og hemmere på RTK fosforylering. I figur 1, er data vist for MDA-MB-453 celler som var ubehandlet, behandlet med 100 ng/ Ml rhNRG-β1/HRG-β1 (HRG-β1) i 5 min, eller pre-behandlet med kjente erbB familien hemmere ^8-11 før HRGβ1 behandling. For inhibitor eksperimenter ble cellene inkubert med 1 pM 029 HDS, 200 nM PD 153035, eller 200 nM PD 158780 i SFM i tre timer. Hver matrise ble inkubert med 100 ug lysat. En økning i fosforylering er observert for ErbB2, ErbB3, og ErbB4 fangst flekker når man sammenligner ubehandlede celler med HRG-β1 behandlet MDA-MB-453 celler. Behandlingen av cellene med alle tre erbB familien selektive hemmere før HRG-β1 inkubering forårsaket reduksjoner i ErbB2, ErbB3 og ErbB4 fosforylering.

I figur 2, blir data vist for Kato III celler kjent å overuttrykker RTK FGF R2. I dette settet av eksperimenter var Kato III celler ubehandlet, behandlet med 100 ng / ml rhFGF sure (FGF) og 1 ug / ml heparin, eller forbehandlet med FGF R selektive inhibitorer ^12-15 før behandling medFGF og heparin. Inhibitorene PD173074, 161570 PD og PD 166285 ble brukt ved en konsentrasjon på 1 uM og inkubert med de Kato III celler for 3 hr i serumfritt medium. Mens det er konstitutiv fosforylering av både EGF R og FGF R2 i ubehandlede KATO III celler, en økning i FGF R2 fosforylering ble observert ved FGF behandling. Inkubere cellene med PD 173074, resulterte 161570 PD, eller PD 166285 i redusert FGF R2 og EGF R fosforylering. Selv om disse inhibitorer er kjent påvirker fosforylering av FGF R familiemedlemmer, Disse resultatene viser nytten av Human Phospho-RTK array for å overvåke effekten en spesifikk konsentrasjon av inhibitor kan ha på andre RTK, eksempel EGF R i dette tilfellet.

Figur 1. Induksjon og hemming av receptor tyrosinkinase fosforylering i brystkreft celler. Array bilder fra proteom Profiler Menneskelig Phospho-RTK arrays og de ​​tilsvarende histogram profiler vises. MDA-MB-453 celler var ubehandlet eller behandlet med RTK hemmere etterfulgt av behandling med NRG-β1/HRG-β1. Matrisen ble brukt til å overvåke effekten av inhibitorer på kinase fosforylering i MDA-MB-453 celler. Klikk her for å vise større figur .

Figur 2. Induksjon og hemming av reseptor tyrosin kinase fosforylering i mage kreftceller. Array bilder fra en Proteome Profiler Menneskelig Phospho-RTK array og de ​​tilsvarende histogrammet profiler vises. Kato III celler var untreated eller behandlet med RTK-hemmere etterfulgt av behandling med FGF syrlig og heparin. Klikk her for å se større figur .

Referanser

1. Henriksson, ML, Edin, S., Dahlin, AM, Oldenborg, PA, Oberg, A., Van Guelpen, B., Rutegard, J., Stenling, R., & Palmqvist, R. kolorektal kreft celler aktivere tilstøtende fibroblaster følge i FGF1/FGFR3 signalering og økt invasjon. Am. J. Pathol. 178, 1387-1394 (2011).
2. Morishita, A., Gong, J., Nomura, T., Yoshida, H., Izuishi, K., Suzuki, Y., Kushida, Y., Haba, R., D'Armiento, J., & Masaki, T. bruk av protein matrise å identifisere målrettbare reseptor tyrosinkinaser for behandling av human tykktarmskreft. Int.. J. Oncol. 37, 829-835 (2010).
3. Agaram, NP, Laquaglia, MP, Ustun, B., Guo, T., Wong, GC, Socci, ND, Maki, RG,DeMatteo, RP, Besmer, P., & Antonescu, CR Molecular karakterisering av pediatriske gastrointestinal stromal tumorer. Clin. Kreft Res. 14, 3204-3215 (2008).
4. Stommel, JM, Kimmelman, AC, Ying, H., Nabioullin, R., Ponugoti, AH, Wiedemeyer, R., Stegh, AH, Bradner, JE, Ligon, KL, Brennan, C., Chin, L., & DePinho, påvirker RA Coactivation av reseptor tyrosin kinaser responsen av kreftceller til målrettet terapi. Science. 318, 287-290 (2007).
5. Agarwal, S., Zerillo, C., Kolmakova, J., Christensen, JG, Harris, LN, RIMM, DL, DiGiovanna, MP, og Stern, DF Association of konstitutivt aktivert hepatocyte vekstfaktorreseptor (Met) med resistens mot et dual EGFR/Her2 hemmer i ikke-småcellet lungekreft celler. Br. J. Cancer. 100, 941-949 (2009).
6. Dewaele, BM, Floris, G., Finalet-Ferreiro, J., Fletcher, CD, Coindre, JM, Guillou, L., Hogendoorn, PC, Wozniak, A., Vanspauwen, V., Schoffski, P., MARYNEN, P., Vandenbergh, P., Sciot, R., & Debiec-Rychter, M. Co-aktivert PDGFRA og EGFR er potensielle terapeutiske mål i intimal sarkom. Cancer Res. 70, 7304-7314 (2010).
7. Yoon, YK, Kim, HP, Han, SW, Hur, HS, Oh, DY, Im, SA, Bang, YJ, og Kim, TY Kombinasjon av EGFR og MEK1 / 2 hemmer viser synergieffekter ved å undertrykke EGFR/HER3-dependent AKT aktivering i menneskelige mage kreftceller. Mol. Kreft Ther. 8, 2526-2536 (2009).
8. Fry, DW, Nelson, JM, Slintak, V., Keller, PR, Rewcastle, GW, Denny, WA, Zhou, H., & Bridges, AJ Biokjemiske og antiproliferative egenskaper 4 - [Ar (ALK) ylamino] pyridopyrimidines, en ny kjemisk klasse potent og spesifikk epidermal vekstfaktorreseptor tyrosin kinase inhibitor. Biochem. Pharmacol. 54, 877-887 (1997).
9. Bos,M., Mendelsohn, J., hindrer Kim, YM, Albanell, J., Fry, DW, & Baselga, PD153035 J., en tyrosinkinaseinhibitor, epidermal vekstfaktor reseptor aktivering og hemmer veksten av kreftceller i en reseptor nummer- avhengig måte. Clin. Kreft Res. 3, 2099-2106 (1997).
10. Stoll, SW, Kansra, S., Peshick, S., Fry, DW, Leopold, WR, Wiesen, JF, Sibilia, M., Zhang, T., Werb, Z., Derynck, R., Wagner, EF, & Elder, JT Differential utnyttelse og lokalisering av erbB reseptor tyrosin kinaser i huden sammenlignet med normale og maligne keratinocytter. Neoplasia. 3, 339-350 (2001).
11. Klutchko, SR, Zhou, H., Winters, RT, Tran, TP, Bridges, AJ, Althau, IW, Amato, DM, Elliott, WL, Meade, MA, Roberts, BJ, Fry, DW, Gonzales, AJ, Harvey , PJ, Nelson, JM, Sherwood, V., Han, HK, Pace, G., smaill, JB, Denny, WA, og Showalter, HD tyrosinkinasehemmere. 19. 6-alknyamides av 4-anilinoquinazolines og 4-anilinopyrido [3,4-d] pyrimidiner som irreversible inhibitorer av ErbB familien av tyrosin kinase reseptorer. J. Med. Chem. 49, 1475-1485 (2006).
12. Kunii, K., Davis, L., Gorenstein, J., Hatch, H., Yashiro, M., Di Bacco, A., Elbi, C., & Lutterbach, B. FGFR2-forsterkede magekreft cellelinjer krever FGFR2 og Erbb3 signalering for vekst og overlevelse. Cancer Res. 68, 2340-2348 (2008).
13. Zhou, W., Hur, W. McDermott, U., Dutt, A., Xian, W., Ficarro, SB, Zhang, J., Sharma, SV, Brugge, J., Meyerson, M., Settleman, J . & Gray, NS En struktur-guidet tilnærming til å skape kovalente FGFR hemmere. Chem. Biol. 17, 285-295 (2010).
14. Batley, BL, Doherty, AM, Hamby, JM, Lu, GH, Keller, P., Dahring, TK, Hwang, O., Crickard, K., & Panek RL Hemming av FGF-1 reseptor tyrosin kinase aktivitet ved PD 161570 , et nytt protein-Tyrosinkinasehemmer. Life Sci. 62 143-150 (1998).
15. Panek, RL, Lu GH, Klutchko, SR, Batley, BL, Darhing, TK, Hamby, JM, Hallak, H., Doherty, AM, & Keiser, JA In vitro farmakologiske karakterisering av PD 166285, en ny nanomolar potent og bredt aktivt protein tyrosin kinase inhibitor. J. Pharmacol. Exp. Ther. 283, 1433-1444 (1997).

Discussion

Human Phospho-RTK er en økonomisk og rask alternativ til tradisjonelle metoder som immunoutfelling (IP) Western for screening endringer i RTK fosforylering. Ved hjelp av denne metoden, ble de relative nivåer av 42 fosfor-RTK screenes samtidig ved hjelp av en enkelt prøve av MDA-MB-453-eller Kato III cellelysat. I tillegg kreves denne tabellen analysen 2,5 time av hands-on tid, noe som gjør denne metoden langt mer tidseffektiv enn å utføre flere IP-Westerns. Ved å ansette en kjemiluminescens deteksjonsmetode, ble ingen spesialisert utstyr utover det som vanligvis brukes til å samle vestlige data kreves. Arrays er følsomme og kan brukes til å sammenligne endringer i fosforylering som skyldes både ligand og inhibitor behandling. Denne metoden gjør det også evaluering av inhibitor selektivitet til off-target RTK. Positive treff kan videre evaluert ved hjelp av en kvantitativ analyse for eksempel en ELISA.

Å effektivt bruke arrays til skjermen for endringeri fosforylering, bør noen sentrale eksperimentelle retningslinjer følges. Først, bør eksperimenter omfatte hensiktsmessige kontrollprøver. For eksempel, i disse eksperimenter effekten av inhibitorer på MDA-MB-453-eller Kato III lysater ble målt på lysat prøver forberedt på samme dag. Kun rekke data som er samlet inn i løpet av det samme eksperimentet bør analyseres for å minimere variasjoner i signalet på grunn av forskjeller i prøvehåndtering, inkubasjonstid, pipette teknikk, eller vask teknikk. Sammenligning signal intensitet mellom to analytter på samme membran anbefales ikke, da fangst antistoffer ikke ble valgt til å ha parallelle slektskap.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Human Phospho-RTK Array Kit	R&D Sytems	ARY001
Aprotinin	Sigma	A6279
Leupeptin	Tocris	1167
Pepstatin A	Tocris	1190
MDA-MB-453 cells
Kato III cells
Recombinant Human NRG1-beta 1/HRG1-beta 1 EGF Domain	R&D Systems	396-HB-050
Recombinant Human FGF acidic (aa 16-155)	R&D Systems	232-FA-025
Heparin	Sigma	H4784
HDS 029	Tocris	2646
PD 153035	Tocris	1037
PD 158780	Tocris	2615
PD 173074	Tocris	3044
PD 161570	Tocris	3724
PD 166285	Tocris	3785
BCA assay	Pierce	23225
Phosphate-Buffer Saline (PBS)
Pipettes and pipette tips
Gloves
Deionized or distilled water
Flat-tipped tweezers
Rocking platform shaker
Microcentrifuge
Plastic containers with the capacity to hold 50 ml			For washing arrays
Plastic transparent sheet protector
Plastic wrap
Absorbent lab wipes
Paper towels
Autoradiography cassette
Film developer
Kodak BioMax Light Film	Carestream Health	178 8207
Film developer
Image Station 4000MM PRO	Carestream Health		Chemiluminescence imager compatible with collection of western data may be used instead of film and a film developer.
Epson Perfection Scanner	Epson	V750 PRO	Flatbed scanner with transparency adaptor capable of transmission mode
Image Analysis Software	GE,WesternVision, BioRad, Adobe, NIH, Protein Simple, etc		ImageQuant, ArrayVision, Western Vision, Quantity One, Photoshop, ImageJ, AlphaView, or other compatible program
Microsoft Excel	Microsoft
Computer capable of running image analysis software and Microsoft Excel.