يتم تقديم أساليب لتطوير والتحقق من صحة مقايسة الكمية مضان لقياس نشاط البوتاسيوم المعدل الداخل (قير) قنوات لفحص المجمع الإنتاجية العالية.
وافترض أعضاء معينة من البوتاسيوم المعدل الداخل الأسرة قناة (قير) أهداف المخدرات لمجموعة متنوعة من الاضطرابات، بما في ذلك ارتفاع ضغط الدم، الرجفان الأذيني، و1،2 الألم. بالنسبة للجزء الأكبر، ومع ذلك، فقد تم التقدم تباطأ نحو فهم إمكاناتها العلاجية أو الوظائف الفسيولوجية الأساسية حتى لعدم وجود أدوات الدوائية جيدة. في الواقع، وتأخر في علم الصيدلة الجزيئية الأسرة المعدل الداخل بعيدا وراء ذلك من الفصيلة S4 من الجهد بوابات قنوات (كيلو فولت) البوتاسيوم، والتي تم اكتشافها في عدد من تقارب-nanomolar وانتقائية للغاية جهري السم الببتيد 3. السم سم النحل tertiapin ومشتقاته ومثبطات قوية من Kir1.1 وKir3 قنوات 4،5، ولكن الببتيدات ذات الاستخدام المحدود علاجية وكذلك تجريبيا نظرا لخصائص المستضدية والتوافر البيولوجي الفقراء والاستقرار الأيضية وانتفاذ الأنسجة. تطوير قويةوسوف انتقائية الصغيرة جزيء تحقيقات مع تحسين الخصائص الدوائية تكون مفتاحا لفهم علم وظائف الأعضاء بشكل كامل والإمكانات العلاجية من القنوات قير.
الجزيئية إنتاج مجسات مكتبات مركز شبكة (MLPCN) بدعم من المعاهد الوطنية للصحة (NIH) قد خلق فرص الصندوق المشترك للعلماء الأكاديمية لبدء التحقيق حملات اكتشاف الجزيئية للأهداف ومسارات الإشارات في حاجة إلى أفضل الصيدلة 6. ويقدم الباحثون MLPCN الوصول إلى مراكز الفرز الصناعة على نطاق والكيمياء الطبية والمعلوماتية دعم لتطوير جزيء صغير تحقيقات لتوضيح وظيفة الجينات وشبكات الجينات. الخطوة الحاسمة في كسب الدخول إلى MLPCN هو وضع مقايسة المستهدفة أو مسار محدد، قوية قابلة للالفرز الفائق الإنتاجية (HTS).
هنا، نحن تصف كيفية تطوير مضان القائم على الثاليوم (TL +) تدفق أساذ وظيفة قناة قير للفحص مجمع عالية الإنتاجية 7،8،9،10. ويستند الفحص على نفاذية K + قناة المسام ليرة تركية K + + متجانس. ويستخدم الفلورسنت المتاحة تجاريا ثاليوم + مراسل صبغ للكشف عن تدفق عبر الغشاء من ثاليوم + من خلال المسام. هناك على الأقل ثلاثة الأصباغ المتاحة تجاريا التي هي مناسبة لفحوصات + ثاليوم تدفق: BTC، FluoZin-2، 7،8 وFluxOR. يصف هذا البروتوكول باستخدام مقايسة التنمية FluoZin-2. على الرغم من أن وضعت أصلا وتسويقها كمؤشر الزنك، FluoZin-2 المعروضات زيادة جرعة قوية وتعتمد على الانبعاثات في مضان على ثاليوم + ملزمة. بدأنا العمل مع FluoZin-2 قبل FluxOR كانت متاحة 7،8 واستمرت في القيام بذلك 9،10. ومع ذلك، فإن الخطوات في تطوير الفحص متطابقة أساسا لجميع الأصباغ الثلاثة، ويجب على المستخدمين تحديد أي صبغة هي الأنسب لن الخاصةeeds. نناقش أيضا مقاييس أداء الفحص أنه يجب التوصل للنظر في الدخول إلى MLPCN. منذ ثاليوم + يتخلل بسهولة أكثر K + قنوات، ينبغي أن تكون قابلة للتكيف مع مقايسة الأهداف الأكثر K + القناة.
بيانات العلاج: حالما يتم جمع البيانات، وهي خطوة مشتركة في التحليل ينطوي على تطبيع استجابة كل بئر في مضان، F، إلى قيمته الأولية في بداية التجربة، F 0. ويشار إلى هذه على أنها "نسبة ثابتة" ويرمز "F / F 0". وفي الحالات التي يهيمن F 0 من ?…
The authors have nothing to disclose.
وأيد هذا العمل من قبل المعاهد الوطنية بتمويل من المنح الصحة 1R21NS073097-01 و1R01DK082884 (JSD) ومؤسسة PIER11VCTR الوطنية منحة المعاهد.
Name of the reagent | Company | Catalog number | Comments |
pcDNA5/TO | Invitrogen | V1033-20 | Tetracycline-inducible expression vector |
T-REx-HEK293 cells | Invitrogen | R71007 | Tetracycline-inducible cell line |
Lipofectamine LTX/Plus Reagent | Invitrogen | 15338100 | Transfection reagent |
FBS | ATLANTA Biologicals | S11550 | Cell culture media |
DMEM | Invitrogen | 11965 | Cell culture media |
Hygromycin B | Invitrogen | 10687-010 | Cell culture media |
Blasticidin S | Invitrogen | R210-01 | Cell culture media |
Penicillin/Streptomycin | Invitrogen | 15140 | Cell culture media |
HBSS-divalent free | Mediatech | 21022CV | Cell washing |
Trypsin-0.25% | Mediatech | 25053CI | Cell dissociation |
Tetracycline-HCl | Sigma | T9823 | Induction reagent |
Dialyzed FBS | ATLANTA Biologicals | S12650 | Plating media |
FluoZin-2 | Invitrogen | F24189 | Fluorescent dye |
Pluronic F-127 | Invitrogen | P-3000MP | Dye loading |
HBSS | Invitrogen | 14175 | Assay buffer |
HEPES | Invitrogen | 15630 | Assay buffer |
NaHCO3 | Sigma | S6297 | Tl+ stimulus buffer |
MgSO4 | Sigma | M2643 | Tl+ stimulus buffer |
CaSO4•2H2O | Sigma | C3771 | Tl+ stimulus buffer |
D-Glucose | Sigma | G7528 | Tl+ stimulus buffer |
Thallium sulfate | Aldrich | 204625 | Tl+ stimulus buffer |
HEPES | Sigma | H4034 | Tl+ stimulus buffer |
DMSO | Sigma | D4540 | Solvent |
Eight-channel electronic pipettor | Biohit | E300 | Cell plating in 384-well plates |
BD PureCoat amine-coated 384-well plates | BD Biosciences | 356719 | Assay microplates |
Echo qualified 384-Well polypropylene microplate (384PP) | Labcyte | P-05525 | Compound source microplates |
384-well polypropylene microplates | Greiner Bio-One | 781280 | |
Multidrop Combi reagent dispenser | Thermo Scientific | 5840300 | |
ELx405 microplate washer | BioTek | ELx405HT | Automated cell washing |
Echo liquid handler | Labcyte | Labcyte Echo 550 | |
Bravo automated liquid handling platform | Agilent Technologies | Standard model | |
Hamamatsu FDSS 6000 | Hamamatsu | Kinetic imaging plate reader |
Table 1. List of Materials and Reagents.