الفرز الفائق الإنتاجية الصغيرة للجزيء المغيرون من الداخل قنوات البوتاسيوم المعدل

Summary

يتم تقديم أساليب لتطوير والتحقق من صحة مقايسة الكمية مضان لقياس نشاط البوتاسيوم المعدل الداخل (قير) قنوات لفحص المجمع الإنتاجية العالية.

Abstract

وافترض أعضاء معينة من البوتاسيوم المعدل الداخل الأسرة قناة (قير) أهداف المخدرات لمجموعة متنوعة من الاضطرابات، بما في ذلك ارتفاع ضغط الدم، الرجفان الأذيني، ^و1،2 الألم. بالنسبة للجزء الأكبر، ومع ذلك، فقد تم التقدم تباطأ نحو فهم إمكاناتها العلاجية أو الوظائف الفسيولوجية الأساسية حتى لعدم وجود أدوات الدوائية جيدة. في الواقع، وتأخر في علم الصيدلة الجزيئية الأسرة المعدل الداخل بعيدا وراء ذلك من الفصيلة S4 من الجهد بوابات قنوات (كيلو فولت) البوتاسيوم، والتي تم اكتشافها في عدد من تقارب-nanomolar وانتقائية للغاية جهري السم الببتيد ^3. السم سم النحل tertiapin ومشتقاته ومثبطات قوية من Kir1.1 وKir3 قنوات ^4،5، ولكن الببتيدات ذات الاستخدام المحدود علاجية وكذلك تجريبيا نظرا لخصائص المستضدية والتوافر البيولوجي الفقراء والاستقرار الأيضية وانتفاذ الأنسجة. تطوير قويةوسوف انتقائية الصغيرة جزيء تحقيقات مع تحسين الخصائص الدوائية تكون مفتاحا لفهم علم وظائف الأعضاء بشكل كامل والإمكانات العلاجية من القنوات قير.

الجزيئية إنتاج مجسات مكتبات مركز شبكة (MLPCN) بدعم من المعاهد الوطنية للصحة (NIH) قد خلق فرص الصندوق المشترك للعلماء الأكاديمية لبدء التحقيق حملات اكتشاف الجزيئية للأهداف ومسارات الإشارات في حاجة إلى أفضل الصيدلة ^6. ويقدم الباحثون MLPCN الوصول إلى مراكز الفرز الصناعة على نطاق والكيمياء الطبية والمعلوماتية دعم لتطوير جزيء صغير تحقيقات لتوضيح وظيفة الجينات وشبكات الجينات. الخطوة الحاسمة في كسب الدخول إلى MLPCN هو وضع مقايسة المستهدفة أو مسار محدد، قوية قابلة للالفرز الفائق الإنتاجية (HTS).

هنا، نحن تصف كيفية تطوير مضان القائم على الثاليوم (TL ⁺⁾ تدفق أساذ وظيفة قناة قير للفحص مجمع عالية الإنتاجية ^7،8،9،10. ويستند الفحص على نفاذية K ⁺ قناة المسام ليرة تركية K ^{+ +} متجانس. ويستخدم الفلورسنت المتاحة تجاريا ثاليوم ⁺ مراسل صبغ للكشف عن تدفق عبر الغشاء من ثاليوم ⁺ من خلال المسام. هناك على الأقل ثلاثة الأصباغ المتاحة تجاريا التي هي مناسبة لفحوصات ⁺ ثاليوم تدفق: BTC، FluoZin-2، ^7،8 وFluxOR. يصف هذا البروتوكول باستخدام مقايسة التنمية FluoZin-2. على الرغم من أن وضعت أصلا وتسويقها كمؤشر الزنك، FluoZin-2 المعروضات زيادة جرعة قوية وتعتمد على الانبعاثات في مضان على ثاليوم ⁺ ملزمة. بدأنا العمل مع FluoZin-2 قبل FluxOR كانت متاحة ^7،8 واستمرت في القيام بذلك ^9،10. ومع ذلك، فإن الخطوات في تطوير الفحص متطابقة أساسا لجميع الأصباغ الثلاثة، ويجب على المستخدمين تحديد أي صبغة هي الأنسب لن الخاصةeeds. نناقش أيضا مقاييس أداء الفحص أنه يجب التوصل للنظر في الدخول إلى MLPCN. منذ ثاليوم ⁺ يتخلل بسهولة أكثر K ⁺ قنوات، ينبغي أن تكون قابلة للتكيف مع مقايسة الأهداف الأكثر K ⁺ القناة.

Protocol

1. جيل من خطوط الخلايا مستقرة بولكلونل

1. إنشاء خط جودة عالية معربا عن الخلية مستقرة قناة قير للاهتمام هو خطوة أولى هامة نحو تطوير قوية مقايسة الفرز الفائق الإنتاجية. يمكن التأسيسي K ⁺ قناة overexpression تؤدي إلى تفعيل مسارات موت الخلايا ومستقرة تنكس خط الخلية وفقدان أداء الفحص. لتجنب هذه المشاكل المحتملة وتوفير عنصر تحكم مريحة الداخلية من أجل التنمية مقايسة (انظر أدناه)، فمن المستحسن نظام التعبير التتراسيكلين-محرض ^8.
2. الثقافة الأبوية T-REX-HEK293 الخلايا باستخدام التقنيات القياسية في B-المتوسطة (متوسطة النمو DMEM تحتوي على 10٪ FBS، 50 U / مل البنسلين، 50 ميكروغرام / مل الستربتوميسين و 5 ميكروغرام / مل Blasticidin S). استخدام الخلايا مرور وقت مبكر (على سبيل المثال مقاطع 3-4 الذوبان منذ التخزين من النيتروجين السائل) لترنسفكأيشن ومستقرة اختيار استنساخ.
3. لوحة 4000000 T-REX-HEK293 الخلايا في75 سم ² قارورة بحيث القارورة هو ما يقرب من 80٪ متموجة في اليوم التالي. بين عشية وضحاها في حاضنة CO ₂ 5٪ في الثقافة 37 ° C.
4. بالنقل باستخدام الخلايا 10-15 ميكروغرام من الحمض النووي pcDNA5/TO-Kir وLipofectamine كاشف LTX / زائد وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة. بعد 5 ساعات، استبدال المتوسطة ترنسفكأيشن المتوسطة مع-B.
5. 24 ساعة بعد ترنسفكأيشن، استبدال B-B-المتوسطة مع المتوسطة تحتوي على 250 ميكروغرام / مل هيغروميسين (BH-المتوسطة) للبدء في اختيار استنساخ مستقرة. تغذية الخلايا كل 2-3 أيام مع الطازجة BH-المتوسطة.
6. ينبغي أكبر من 90٪ من الخلايا تموت خلال 7 ايام القادمة، تاركة وراءها مستعمرات صغيرة من الخلايا ستابلي. السماح للمستعمرات أن ينمو لأيام إضافية قبل تقسيم 10-14 إلى 175 ² سم قارورة للتوسع.
7. لحفظ البرودة، وتجميد 3 × 10 ⁶ خلية / مل في وسائل الإعلام التي تحتوي على 45٪ مشروطة BH-المتوسطة، و 45٪ للمضادات الحيوية الحرة، التي تحتوي على مصل DMEM وDMSO 10٪. تجمدالخلايا بين عشية وضحاها في -80 درجة مئوية في حاويات تجميد خلية ومن ثم الانتقال إلى النيتروجين السائل لتخزين على المدى الطويل. ذوبان الجليد من الخلايا باستخدام النيتروجين السائل لبروتوكول إينفيتروجن الموصى بها. نلاحظ أن قابلية الخلايا سيكون أقل إذا كانت مجمدة من قارورة أكبر من 75٪ متموجة في وقت المعالجة.

2. جيل من الخلايا وحيدة النسيلة خطوط مستقرة

1. غسل فرعي متموجة 75 سم ² قارورة من الخلايا بولكلونل مستقرة مع ثنائي التكافؤ خالية HBSS. إضافة 1 مل من التربسين واحتضان لمدة 3-5 دقيقة في حاضنة CO ₂ 5٪ عند 37 ° C. إضافة 5 مل من المتوسط ​​إلى BH-القارورة لمنع النشاط التربسين ويسحن مرارا وتكرارا (على سبيل المثال، 5 مرات) لفصل الخلايا بالكامل. تفتيش دقيق الخلايا تحت المجهر للتأكد من وقف يتكون بالكامل تقريبا من الخلايا واحدة. وهذا يزيد من احتمال الحصول على خطوط الخلايا وحيدة النسيلة.
2. تحديد كثافة الخلايا وتخفيفتعليق لتركيز قدره 0.7 في خلايا 20 ميكرولتر. باستخدام pipettor متعدد القنوات، ماصة 20 ميكرولتر من تعليق الخلية في كل بئر من PureCoat أمين المغلفة لوحات BD 384 جيدا (أو ما يعادلها بولي يسين D-مغلفة). من حيث المبدأ، ينبغي أن 70٪ من آبار تتلقى خلية واحدة مع هذه الظروف الطلاء. وبالتالي، ينبغي لوحة تحتوي على 384 بئر أكثر من 200 استنساخ لتحليل. مواصلة زراعة الخلايا في الحاضنة CO ₂ 5٪ عند 37 ° C.
3. بعد أسبوع، وفحص لوحات تحت المجهر للآبار التي تحتوي على المستعمرات واحد. ملاحظة موقفهم من الغطاء مع علامة دائمة للرجوع إليها مستقبلا. لا شك أن نلاحظ أيضا وشاملة تحتوي على آبار المستعمرات متعددة. هي الأكثر بسهولة المعترف بها من قبل هذه ظهور المستعمرات متزايدة من الجانبين متعددة من البئر. تكون على علم بأن التبخر يميل إلى أن يحدث بسرعة أكبر من الآبار بالقرب من حافة اللوحة. إضافة BH-المتوسطة والآبار حيث التبخر حدث كبير. خلاف ذلك، فمن غير الضروري رس تغذية الخلايا.
4. رصد الآبار على نحو أكثر تواترا خلال الأيام القادمة 7-10. وسوف يكون جاهزا الخلايا لتقسيم عندما الآبار التي تهم ما لا يقل عن 50٪ متموجة.
5. تقسيم الخلايا لتكرار لوحات 384 جيد؛ لوحة واحدة لمعايرة مع ثاليوم ⁺ تدفق والآخر لمواصلة خطوط وحيدة النسيلة في الثقافة. نضح المتوسطة من الآبار التي تحتوي على خطوط الخلايا ذات الاهتمام. غسل الخلايا مع ثنائي التكافؤ خالية HBSS، إضافة 20 ميكرولتر من التربسين إلى كل بئر ونقل لوحة إلى حاضنة 37 درجة مئوية لمدة 15-20 دقيقة. بعد انتقاله لوحة العودة إلى الخلية هود والثقافة، وإضافة 20 ميكرولتر من BH-المتوسطة إلى كل بئر ويسحن عدة مرات لفصل الخلايا. تفقد الآبار تحت المجهر للتأكد من الخلايا يتم فصلها بشكل كامل. وهذا قد يتطلب جولات متعددة من pipetting، والخلايا ستكون ملتصقة بإحكام. مرة واحدة في فصل الخلايا، ونقل 10 ميكرولتر من كل خلية لتكرار التعليق الآبار من 38 جديدة BD PureCoat أمين المغلفة4-وحة جيدا. لا شك أن نلاحظ العلاقة بين مصدر مطلع وتكرارا الآبار الوجهة بحيث يمكن تتبع الحيوانات المستنسخة واظهار قوة النشاط قناة قير (انظر أدناه) العودة إلى البئر الأصلية. إضافة 20 ميكرولتر من BH-المتوسطة إلى المصدر الأصلي بشكل جيد لتغذية الخلايا المتبقية ومواصلة لهم في الثقافة في 5٪ CO ₂ حاضنة في 37 ° C.
6. السماح للخلايا في لوحة وجهة الالتزام وتنمو لمدة تصل إلى أسبوع. مرة واحدة أكثر من الحيوانات المستنسخة تصل التقاء ما لا يقل عن 50٪، ويمكن تقييمها للنشاط قناة قير باستخدام ثاليوم ⁺ تدفق الفحص هو موضح أدناه.
7. في اليوم السابق للفحص، نضح ثقافة المتوسط ​​واستبدالها المتوسطة BH تحتوي على 10٪ FBS مدال. هذا يمنع التعبير غير مقصود القناة التي يمكن أن تنشأ من التتراسيكلين المصل الملوثة. حمل قير التعبير في قناة واحدة فقط من الآبار مكررة لكل من استنساخ بما في ذلك 1 ميكروغرام / مل التتراسيكلين. فإن تكرار uninduced جيدا بمثابة"الخلفية" السيطرة. أداء ثاليوم ⁺ فحوصات تدفق كما هو موضح المقبل.

3. ثاليوم العامة ⁺ الجريان الداخلي الفحص

1. قبل يوم واحد ثاليوم ⁺ تدفق التجربة، فصل الخلايا وquantitate كثافة التعليق الخلية كما هو موضح في الأقسام 2.1 و 2.2. لوحة الخلايا وحيدة النسيلة 20000 ستابلي مع الجين قناة قير من الاهتمام في كل بئر من لوحة PureCoat BD 384 المغلفة جيدا أمين باستخدام كومبي الحرارية Multidrop أو pipettor متعدد القنوات. استخدام BH المتوسطة تحتوي على 10٪ FBS لمدال الطلاء. علما أنه سيتم تربيتها بين عشية وضحاها مع بعض الخلايا 1 ميكروغرام / مل التتراسيكلين للحث على قناة قير التعبير، في حين أن الآخرين لن. وموقع الخلايا التي يسببها وuninduced تختلف عن كل نوع من التجربة وتظهر في الشكل 1.
2. في اليوم التالي، وفحص لوحات تحت المجهر للتأكد من أن الخلايا هي ملتصقة وموزعة بالتساوي عبر قاعمن الآبار. يجب أن تكون الآبار متموجة 80-90٪.
3. استخدام غسالة صفيحة ميكروسكوبية ELx405 لتحل محل ثقافة المتوسط ​​الخلية مع 20 ميكرولتر لكل بئر من HBSS العازلة التي تحتوي على الفحص HEPES ملي 20 و تخزينها مؤقتا لدرجة الحموضة 7،3 مع هيدروكسيد الصوديوم. بدلا من ذلك، يمكن للمرء أن استخدام "نفض الغبار والبطولات الاربع" طريقة، حيث يتم عكس لوحة وقطعت تراجعا حادا لإخراج المتوسطة في وعاء النفايات، ويربت على مناشف ورقية ثم مكدسة لإزالة وسائل الإعلام المتبقية. إضافة العودة فورا HBSS العازلة الفحص على لوحة لمنع الخلايا من التجفيف.
4. إعداد FluoZin-2، ص صبغة حل تحميل. بعد الطرد المركزي لفترة وجيزة الأنبوب، ويحل 50 ميكروغرام من مسحوق 2-FluoZin في 100 ميكرولتر من DMSO اللامائية. عند هذه النقطة، يمكن تخزين مأخوذة من الحل الأسهم X 1000 في -20 ° C لاستخدامها لاحقا. عندما جاهزة للاستخدام، إضافة 50 ميكرولتر من وزنها بنسبة 20٪ في حجم بلورونيك F-127/DMSO حل للصبغ وتخلط مع pipetting لطيف. لا تجميد الصبغة مرة واحدة تمت إضافة بلورونيك F-127، كماقد تتسبب في درجات الحرارة المنخفضة بالسطح لتترسب من الحل. إضافة المجلد 150 ميكرولتر من FluoZin-2، AM/Pluronic-F127 إلى 100 مل من العازلة مقايسة HBSS ومزيج بلطف لجعل العازلة تحميل صباغة. باستخدام كومبي Multidrop أو pipettor متعدد القنوات، إضافة 20 ميكرولتر من العازلة التحميل لكل ميكرولتر صبغة جيدا تحتوي على 20 بالفعل من فحص HBSS العازلة. احتضان الخلايا في درجة حرارة الغرفة لحوالي 1 ساعة (عادة الحضانة تم القيام به في الظلام، رغم عدم وجود دليل مباشر على أن من الضروري).
5. في حين أن الخلايا تقوم بتحميل مع الصبغة، وإعداد حافزا لوحة ⁺ ثاليوم. حل طازجة 0.5 غرام من بيكربونات الصوديوم في 50 مل من 5X العازلة ثاليوم التحفيز تحتوي على 1 ⁺ كبريتات المغنيسيوم ملي، 1.8 ملي مول كبريتات الكالسيوم و 5 ملي الجلوكوز، HEPES ملي 10 و 12 ملم ⁺ كبريتات الثاليوم. وبدلا من ذلك، يمكن استبدال بيكربونات الصوديوم مع جلوكونات الصوديوم إذا، على سبيل المثال، يجب أن تبقى درجة الحموضة حل ضمن نطاق ضيق جدا، وفقدان ثاني أكسيد الكربونهو مصدر قلق. سقف الأنبوب بإحكام للحد من هروب ثاني أكسيد الكربون وقلب عدة مرات حتى بيكربونات الصوديوم يذهب الى الحل. باستخدام pipettor متعدد القنوات، إضافة 50 ميكرولتر من حل كل بئر من البولي بروبلين 384 لوحة جيدا (الجدول 1).
6. بعد أن تم تحميل الخلايا مع FluoZin-2، AM، تغسل الصحون مع غسالة صفيحة ميكروسكوبية ELx405 أو باستخدام "نفض الغبار والبطولات الاربع" الأسلوب، كما هو موضح أعلاه في القسم 3.3. اعتمادا على نوع من التمويه ثاليوم ⁺ التجربة التي يتعين القيام بها، إضافة إلى الوراء 20 ميكرولتر أو 40 ميكرولتر من العازلة مقايسة HBSS إلى كل بئر. لوحات هي الآن جاهزة للتجارب.
7. الخلية، ثاليوم ⁺ لوحات وظيفية في هاماماتسو المخدرات نظام الفرز (FDSS) أو ما يعادلها لوحة التصوير الحركي القارئ مع قدرات متكاملة السائل الاستغناء. استخدام الفلاتر المناسبة لفلوريسئين / فلوريسئين المستندة إلى الأصباغ مثل فلوو-4.
8. إعداد بروتوكول واحد الإضافة بحيث ثاليوم 10 ميكرولتر من 5X ⁺يضاف إلى سلسلة الآبار المماثلة من لوحة الخلية يحتوي على 40 ميكرولتر من العازلة مقايسة HBSS. سجل مضان خط الأساس على تردد أخذ العينات هرتز 1 لما لا يقل عن 10 ثانية. ينبغي أن مضان جيدا إلى جانب أن تكون موحدة ومستقرة عبر لوحة وضعت مرة واحدة ظروف التحميل الأمثل الطلاء الخلية، وغسل وصبغ. ويستخدم متكامل 384 قناة في وقت واحد لإضافة pipettor الحافز ⁺ عازلة ليرة تركية كل بئر.
9. سجل ما لا يقل عن 2 دقيقة بحيث يتم التقاط معدل وذروة ثاليوم ⁺ الناجم عن الزيادة في مضان للخارج خط التحليل.

4. تحديد تركيز الأمثل + ثاليوم

1. TL ⁺ تتخلل بسهولة أكثر إلى الداخل المعدل K ⁺ قنوات. لضمان أن ثاليوم ⁺ تركيزات لا تتجاوز النطاق الديناميكي ليرة تركية ⁺ صبغ مراسل FluoZin-2، ينبغي للمرء تحديد تجريبيا الأمثل تركيز ⁺ ثاليوم لاستخدامها في تي عاليةhroughput الشاشة. نوصي تركيز ⁺ ثاليوم أن يستحضر 80٪ من رد مضان القصوى (EC ₈₀₎ في ظل ظروف الحد الأقصى حيث يتم تنشيط القناة.
2. لوحة، تحميل صبغ وغسل الخلايا في PureCoat لوحات BD-D-بولي يسين المغلفة المغلفة أمين أو ما يعادلها 384 جيدا كما هو موضح أعلاه في الفقرة 3، وترك 40 ميكرولتر من العازلة مقايسة HBSS في كل بئر. كما هو موضح في الخريطة وحة في الشكل 1A، العمود 1 الصفوف وA1-A23 يجب أن يحتوي على الخلايا التي لم يسببها مع التتراسيكلين وبالتالي لا تعبر عن قناة قير للاهتمام. وسوف تستخدم الإشارات FluoZin-2 مضان من الآبار uninduced لتحديد مستوى تدفق ⁺ ثاليوم من خلال مسارات داخلية، مثل نا ⁺ - K ^+-K أتباز مضخة وبوابات الجهد قنوات ^+، والتي يتم التعبير عنها عادة في HEK- 293 الخلايا.
3. استخدام السائل اجيلنت الآلي برافو منصة تداول أو دليل لإعداد pipettingأحد عشر نقطة تركيز ⁺ ثاليوم سلسلة التخفيف في المخزن المؤقت مقايسة HBSS. عادة، يتم تقييم لمدة 3 أضعاف سلسلة التخفيف المسلسل تتراوح بين 100٪ إلى 0.002٪ ⁺ ثاليوم في مقايسة. وينبغي بذل سلسلة حتى عند تركيز 5X لأنه سيتم تخفيفه ⁺ حلول ثاليوم 01:05 في مقايسة النهائي. إعداد سلسلة من تمييع تخفيف مستوى 5X ⁺ ثاليوم العازلة مبين في الفقرة 3 مع ثاليوم 5X ⁺ خالية العازلة تحتوي على 1 ملم كبريتات المغنيسيوم، 1.8 ملي مول كبريتات الكالسيوم، 5 مم والسكر ملي HEPES 10. مرة أخرى، حل طازجة 0.5 غرام من بيكربونات الصوديوم في 50 مل من المخزن المؤقت النهائي ⁺ ثاليوم مباشرة قبل الطلاء البولي بروبلين في 384 لوحة جيدا وفقا لخريطة موضح في لوحة 2A الشكل.
4. تحميل لوحات الخلايا وتحفيز ⁺ ثاليوم في FDSS. إعداد بروتوكول واحد الإضافة بحيث يتم إضافة 10 ميكرولتر من ثاليوم 5X ⁺ سلسلة لآبار المقابلة من لوحة الخلية يحتوي على 40 ميكرولتر من HBSS مقايسة العازلة. سجل خط الأساس FluoZin-2 مضان لمدة 10 ثانية قبل إضافة ثاليوم ⁺ لوحة. تكرار التجربة في 3 أيام منفصلة لإنشاء استنساخ النتائج.

5. تحديد حساسية الفحص لDMSO

1. وحل الجزيئات الصغيرة في استجواب شاشة عالية الإنتاجية في سلفوكسيد ثنائي ميثيل المذيبات العضوية (DMSO)، والتي يمكن أن تؤثر على نفسها أداء الفحص. لذلك يجب أولا فحص حساسية لDMSO أن تدرس إنشاء لأعلى تركيز المسموح به في DMSO الشاشة.
2. لوحة، تحميل صبغ وغسل الخلايا في لوحات PureCoat أمين المغلفة جيدا BD 384 كما هو موضح أعلاه في الباب 3، تاركين 20 ميكرولتر من العازلة مقايسة HBSS في كل بئر. وينبغي لوحة تحتوي على خلايا بأكملها التي تم يسببها مع التتراسيكلين (الشكل 3A).
3. استخدام مناولة السائل برافو الآلي أو اليدوي pipetting منهاج لإعداد أحد عشر نقطة DMSO سلسلة تخفيف تركيز في المخزن المؤقت مقايسة HBSS. عادة، يتم تقييم سلسلة التخفيف 2-أضعاف تتراوح بين 10٪ إلى DMSO ت / ت 0.01٪ للنشاط في مقايسة. وينبغي بذل سلسلة حتى عند تركيز 2X لأنه سيتم تخفيفه الحلول DMSO إلى النصف النهائي في مقايسة. وينبغي مطلي سلسلة التخفيف في البولي بروبلين 384 لوحة جيدا، وفقا لخريطة موضح في لوحة 3A الشكل.
4. إعداد 5X ثاليوم وحة التحفيز ⁺ على أساس EC ₈₀ أو ثاليوم الأمثل ⁺ تركيز المحددة في الفقرة 4.
5. تحميل الخلية، DMSO، ثاليوم ⁺ لوحات التحفيز في FDSS. إعداد بروتوكول ثنائي الوظيفة بحيث يتم إضافة 20 ميكرولتر من سلسلة تركيز DMSO 2X إلى الآبار المماثلة من لوحة خلية تحتوي على 20 ميكرولتر من العازلة مقايسة HBSS. ترك DMSO على الخلايا لنفس المقدار من الوقت سوف يتعرض الخلايا المركبة جزيء صغير خلال الشاشة. سجل خط الأساس FluoZin-2 مضان لفيلا يقل عن 10 ثانية قبل إضافة 10 ميكرولتر من العازلة 5X ⁺ ثاليوم إلى كل بئر من لوحة الخلية. تكرار التجربة في 3 أيام منفصلة لإنشاء استنساخ النتائج.
6. يجب أن نكون متسامحين لفحص تركيزات DMSO ما لا يقل عن 0.1٪ V / V للشاشة عالية الإنتاجية النموذجية التي يتم اختبار المركبات عند تركيز من 10 ميكرومتر.

6. تحديد حساسية الفحص لالمغيرون الدوائية المعروفة

1. بعد تحديد الأمثل ثاليوم التسامح وتركيز DMSO ⁺ من الفحص، وآثار معروفة دواء بشكل وكلاء على قناة بوساطة قير ⁺ تدفق ثاليوم ينبغي أن تدرس. وهذه السلسلة من التجارب تقييم الفحص والحساسية، والقدرة على رتبة ترتيب المركبات على أساس قدرتهم، رجولية لتصنيف المركبات يعتمد على طريقتهم في فعالية (مثل المنشط، المانع)، وتحديد المركبات السيطرة حسن تصرف لاستخدامها في وقت لاحق الفحص دوevelopment الشاشة.
2. لوحة، تحميل صبغ وغسل الخلايا في لوحات PureCoat أمين المغلفة جيدا BD 384 كما هو موضح أعلاه في الباب 3، تاركين 20 ميكرولتر من العازلة مقايسة HBSS في كل بئر. ينبغي العمود 1 و A1-A23 صفوف تحتوي على خلايا التي لم يتم يسببها مع التتراسيكلين (الشكل 4A).
3. استخدام مناولة السائل برافو الآلي أو اليدوي pipetting منهاج لإعداد تخفيف تركيز أحد عشر نقطة سلسلة من جهري المعروفة في الفحص HBSS العازلة. عادة، يتم تقييم سلسلة التخفيف 3-أضعاف تتراوح بين 100 ميكرومتر إلى 2 نانومتر للنشاط في مقايسة. وينبغي بذل سلسلة حتى عند تركيز 2X لأنه سيتم تخفيفه الحلول DMSO إلى النصف النهائي في مقايسة. وينبغي مطلي سلسلة التخفيف من ثلاث نسخ في البولي بروبلين 384 لوحة جيدا، وفقا لخريطة وحة هو موضح في الشكل 4A. تأكد من أن يتم إجراء مثل هذه التخفيفات أن تركيزات النهائي DMSO هي نفسها بين العلاج بالعقاقير وثا أقل ن أو يساوي تركيز DMSO الأقصى المسموح به المحدد في المادة 5.
4. إعداد 5X ثاليوم وحة التحفيز ⁺ يعتمد على تركيز الأمثل ⁺ ثاليوم المحددة في الفقرة 4.
5. تحميل الخلية، ومجمع لوحات ثاليوم التحفيز ⁺ في FDSS. إعداد بروتوكول ثنائي الوظيفة بحيث يتم إضافة 20 ميكرولتر مجمع تركيز 2X سلسلة الآبار إلى المقابلة من لوحة خلية تحتوي على 20 ميكرولتر من العازلة مقايسة HBSS. إضافة إلى لوحة مركبات الخلية واحتضان لمدة تصل إلى 20 دقيقة. لاحظ أنه يمكن تحديد فترة حضانة الأمثل للمركبات للكشف عن أفضل إشارة إلى نسبة الخلفية عن طريق تشغيل سلسلة من التجارب حيث يتم اختيار زوجين مرات الحضانة مختلفة. سجل خط الأساس FluoZin-2 مضان مدة لا تقل عن 10 ثانية قبل إضافة 10 ميكرولتر من العازلة 5X ⁺ ثاليوم إلى كل بئر من لوحة الخلية. تكرار التجربة في 3 أيام منفصلة لإنشاء استنساخ النتائج.

_title "> 7. رقعة الداما تحليل

1. في سلسلة من التجارب التالية، سيتم تقييم التوحيد واستنساخ للفحص باستخدام "الشطرنج" التحليل. عادة، يتم التحكم مطلي المانع في كل جانب الآخر من كل الأعمدة والصفوف من لوحة 384 أيضا، كما هو مبين في الشكل 5A. لتقييم دقيق ضجيج في مقايسة، ينبغي استخدام من ₈₀ EC تركيز مثبط. يضاف إلى الآبار DMSO أخرى على أنها السيطرة على السيارة. TL ⁺ تدفق في DMSO ويتم استخدام المخدرات المعالجة الخلايا لحساب قيمة Z للرئيس، وهو مقياس إحصائي من جانب إلى جانب التباين بين السكان اثنين من الآبار. ويحسب رئيس Z باستخدام الصيغة:
   Z رئيس = 1 - _(P + 3SD 3SD _ن) / | + _P يعني يعني _ن |
   حيث هو الانحراف المعياري SD، ص هو غير مأهولة تماما، وتدفق ن تحول دون تدفق القيم. يعتبر الفحص مع القيم Z 'أكبر من أو يساوي إلى 0.5 في 3 ايام منفصلة قuitable لالفرز الفائق الإنتاجية.
2. لوحة، تحميل صبغ وغسل الخلايا في لوحات PureCoat أمين المغلفة جيدا BD 384 كما هو موضح أعلاه في الباب 3، تاركين 20 ميكرولتر من العازلة مقايسة HBSS في كل بئر. لاحظ أن يجب أن تحاسب لوحة كامل مع التتراسيكلين.
3. جعل لوحة المركبة / DMSO بواسطة pipetting إلى لوحة البولي بروبلين 384 جيدا باستخدام pipettor متعدد القنوات، و 80 ميكرولتر / جيد من المانع المعروفة للهدف قناة قير في تحديد تركيز في القسم 6.5، و 0.1٪ V / V DMSO السيارة كما هو موضح في الشكل 5A. إضافة مثبط المعروفة ابتداء من A1 جيدا باستخدام قناة متعددة وبديلة لpipettor B2 بشكل جيد وذلك على ما يصل إلى B24 أيضا. كرر هذا الإجراء مع DMSO ابتداء من عام B1 جيدا وهكذا حتى A24 أيضا. وينبغي التخطيط النهائي للوحة المباراة التي من الشطرنج.
4. إعداد 5X التحفيز ⁺ لوحة ثاليوم استنادا إلى ثاليوم الأمثل ⁺ مصممة في القسم 4.
5. تحميل الخلية، ومجمع T⁺ L لوحات التحفيز في FDSS. إعداد بروتوكول ثنائي الوظيفة بحيث يتم إضافة 20 ميكرولتر مجمع تركيز 2X سلسلة الآبار إلى المقابلة من لوحة خلية تحتوي على 20 ميكرولتر من العازلة مقايسة HBSS. إضافة إلى لوحة مركبات الخلية واحتضان لمدة تصل إلى 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. سجل خط الأساس FluoZin-2 مضان مدة لا تقل عن 10 ثانية قبل إضافة 10 ميكرولتر من العازلة 5X ⁺ ثاليوم إلى كل بئر من لوحة الخلية. تكرار التجربة في 3 أيام منفصلة لإنشاء استنساخ النتائج.

8. الطيار الشاشة

1. في المرحلة النهائية من تطوير فحص، نفذ شاشة رائدة لبضعة آلاف المركبات لتقييم أداء الفحص في ظل ظروف التي سيتم استخدامها في نهاية المطاف في شاشة عالية الإنتاجية على نطاق واسع.
2. لوحة، تحميل صبغ وغسل الخلايا في لوحات BD أمين المغلفة جيدا PureCoat 384 كما هو موضح أعلاه في القسم 3)، تاركين 20 ميكرولتر من العازلة مقايسة HBSS في كل بئر.لاحظ أنه يجب مثقف لوحة كاملة بين عشية وضحاها مع التتراسيكلين للحث على قناة قير التعبير.
3. حدد حوالي 2،000 إلى 3،000 مركبات متنوعة هيكليا لفحصها. غالبا ما يكون من المناسب ومريحة للاستخدام المركبات مجموعات مع أنشطة التخصيب المعروفة المحتمل لقناة ايون جهري. وتشمل هذه المجموعات مجموعة الطيف (MicroSource) وجمع LOPAC (سيغما). وبالإضافة إلى ذلك، فإنه من الحكمة أن تدرج جهري المعروفة للقير التاريخية في الشاشة التجريبية. سوف مثالي تضاف هذه المركبات إلى الآبار بطريقة أعمى من أجل السماح لاختبار موضوعية حول أساليب قطف ضرب وصفها لاحقا. إعداد لوحات مركبات البولي بروبلين في 384 أيضا (لوحات جهة) باستخدام السائل صدى Labcyte معالج أو أداة مناسبة لنقل دبوس وحدة تخزين مناسبة من المركبات المحددة في DMSO من مجموعة MLPCN (لوحات المصدر) إلى لوحات المركبات لاحظ أن الوجهة هي اختبار فقط في الأعمدة 3-22؛في كل جانب من الأعمدة الأخرى 1 و 2 و 23 و 24 إضافة مثبط المعروفة عند تركيز معروفة لكبح تماما كما هو محدد في قير الباب 7. في الآبار المتبقية من الأعمدة 1 و 2 و 23 و 24 إضافة حجم مناسب من DMSO ضوابط لإنتاج السيارة DMSO تركيز المطابقة. تمييع جميع الآبار مع العازلة الفحص باستخدام كومبي Multidrop. وعادة ما يكون اختبار المركبات 20 ميكرون، 2 أضعاف فوق المستهدف تركيز الفرز.
4. جعل لوحات ثاليوم التحفيز ⁺ يعتمد على تركيز الأمثل ⁺ ثاليوم المحددة في الفقرة 4.
5. تنفيذ الشاشة التجريبية. أن تحرص على ارباك خطوات التنفيذ الواردة في البروتوكول للحفاظ على توقيت متناسقة بين لوحات في المدى التجريبي الفرز.
6. بمجرد الانتهاء من الشاشة التجريبية، وتحليل الآبار الشطرنج من أعمدة 1، 2، 23، و 24 باستخدام المعادلة Z-الوزراء. تفقد لوحات تظهر Z-الوزراء القيم أقل من 0.5 لتحديد مصدر فصل السكان الفقراء السيطرة. يمكن مشاهدة باختيار البريد باستخدام عدد من الأساليب. لشاشات الطيار أنه من الشائع لحساب المتوسط ​​والانحراف المعياري للسيارة التحكم واختيار السكان على أساس الفعالية الآبار المنتجة للقيم> / = 3 انحرافات معيارية عن المتوسط ​​للضوابط السيارة.
7. بعد قطف ضرب، يضرب إعادة اختبار مختارة من نسختين في 2 مجموعات من لوحات. مجموعة واحدة من لوحات يحتوي على الخلية قير مستقرة في غياب التتراسيكلين والآخر يحتوي على الخلية قير مستقرة الخط في وجود التتراسيكلين. مشاهدات التي قد تعتبر إيجابية في إعادة اختبار واحد على الأقل من اثنين من اللوحات وإعادة اختبار تفشل لإظهار نشاط كبير في لوحات uninduced التحقق مشاهدات. دراسة قائمة المستهدفين التحقق لتحديد عدد من "الخفية" عينات تم الكشف عن السيطرة. الفشل في الكشف عن عناصر التحكم في الشاشة التجريبية يشير إلى الحاجة إلى مزيد من التحسين من المعلمات الفرز أو ضرب قطف.

Representative Results

استخدام نظام التعبير التتراسيكلين-محرض يوفر عنصر تحكم مريحة الداخلية للتمييز ثاليوم ⁺ تدفق من خلال مسارات الذاتية وقناة قير للاهتمام. الشكل 1 يبين بعض الأمثلة من الخرائط المستخدمة في الطلاء الخلية أنواع مختلفة من التجارب. يشار إلى مواقف الآبار التي تحتوي على الخلايا أو التتراسيكلين uninduced صنع بألوان مختلفة. 2A الشكل يبين خريطة لوحة مصدر المستخدمة لتحديد تركيز الأمثل ⁺ ثاليوم للتنمية والفحص فحص المركبة. التدرج لون يمثل سلسلة التخفيف 3-أضعاف تتراوح بين 100٪ إلى 0.002٪ ⁺ ثاليوم. ويرد ممثل الخريطة كثافة مضان في الشكل 2B، مع بارد إلى حار الألوان تشير منخفضة إلى عالية ثاليوم ⁺ تدفق القيم، على التوالي. تم استخدام خريطة الطلاء الخلية هو مبين في الشكل 1C لهذه التجربة. نوبة من وظيفة لوجستية 4-المعلمة لرانه يستخدم يرة تركية ⁺ CRC (الشكل 2C) لتحديد من ₈₀ EC بقيمة 15٪ ثاليوم ^+. الشكل 3A يظهر خريطة لوحة مصدر المستخدمة لتحديد التسامح DMSO من الفحص. العمودين 1 و 24 تحتوي على المخزن المؤقت الفحص فقط، في حين أن التدرج لون يشير إلى سلسلة التخفيف 2-أضعاف تتراوح بين 10٪ إلى 0.01٪ DMSO. ويرد ممثل الخريطة كثافة مضان في الشكل 3B، مع انخفاض قيم ثاليوم تدفق ⁺ أشار مع قتامة اللون الأزرق. تم استخدام خريطة الطلاء الخلية هو مبين في الشكل 1B في هذه التجربة. ولخص ثاليوم متوسط ^​​+ القيم تدفق سجلت من الآبار التي تحتوي على تركيزات المشار إليه من DMSO في الشكل 3C. يتم رسم البيانات كما النسبة المئوية للثاليوم ⁺ تدفق المسجلة في غياب DMSO. لهذه القناة قير وجه الخصوص، كان تركيز DMSO تصل إلى 2.5٪ أي تأثير على تدفق ثاليوم ⁺ وبالتالي يمكن استخدامها في التجارب. الشكللدى عودتهم 4A يبين خريطة لوحة المصدر المستخدمة لإنشاء منحنيات التركيز والاستجابة لمثبطات معروفة لقناة قير. يشار إلى كل مجمع مع لون مختلف ويتم عادة مطلي على شكل سلسلة التخفيف 3-أضعاف. ويرد ممثل الخريطة كثافة مضان في الشكل 4B. تم استخدام خريطة الطلاء الخلية هو مبين في الشكل 1C لهذه التجربة. ويرد ممثل التجربة تظهر تعتمد على الجرعة تثبيط ثاليوم ⁺ تدفق بواسطة المانع في الشكل 4C. يتم تحديد مدى متانة مقايسة في ما يسمى المقايسات "الشطرنج"، وتتلخص في الشكل 5. في مصدر خريطة لوحة معروضة في الشكل 5A، وهو الحد الأقصى من التركيز الفعال المانع أو 0.1٪ DMSO بمثابة السيطرة على السيارة ومطلي بالتناوب في الآبار. يوضح الشكل 5B ممثل الخريطة كثافة مضان. A مؤامرة مبعثر من تدفق الذروة ⁺ في ثاليوم سجلت من األفراديتم رسم آل الآبار في الشكل 5C. يشار إلى القيم يعني مضان مع خط متصل، في حين يشار إلى 3 انحرافات قياسية مع خط منقط. رئيس الوزراء Z قيمة، وهو مقياس لكيفية فصل الإحصائية جيدا يتم فصل السكان الخلية اثنين، يحسب لهذا هو لوحة 0.75، وهو أعلى بكثير من الحد الأدنى المطلوب ل0،5 الفرز الفائق الإنتاجية.

الشكل 1. خرائط الطلاء الخلية المستخدمة ليرة تركية ⁺ تدفق التنمية مقايسة. (A) الخليوي خريطة الطلاء استخدامها لتحديد الفحص الأمثل ثاليوم ⁺ التركيز. الآبار في العمود 1، الصفوف A1-23، K1-12، F13-23، و23-P13 تحتوي على خلايا uninduced (-تيت). الآبار المتبقية تحتوي على خلايا التي كانت تعامل مع التتراسيكلين (+ تيت) للحث على قناة قير التعبير. (B) خلية جيش التحرير الشعبى الصينىالشركة المصرية للاتصالات خريطة استخدامها لتحديد التسامح DMSO فحص وإجراء تحليل الشطرنج. لاحظ أن يتم التعامل مع جميع الآبار التتراسيكلين (+ تيت). (C) الخليوي خريطة لوحة المستخدمة لتحديد حساسية الفحص لجهري الدوائية المعروفة. الآبار في العمود 1 والصف A1-23 تحتوي على خلايا uninduced (-تيت). الآبار المتبقية تحتوي على خلايا التي كانت تعامل مع التتراسيكلين (+ تيت). اضغط هنا لمشاهدتها بشكل اكبر شخصية .

الشكل 2. تحديد الفحص الأمثل ثاليوم ⁺ التركيز. (A) المصدر خريطة لوحة المستخدمة لتحديد تركيز ⁺ ثاليوم أن يستحضر ما يقرب من 80٪ من الزيادة FluoZin-2 مضان القصوى (EC _80). صف وكولومNS 1 و 24 (أصفر) تحتوي على نسبة من 5X ثاليوم 12 ملم ₂ SO _4. الصفوف المتبقية تحتوي على سلسلة التخفيف 3-أضعاف تتراوح بين 12 ملم (100٪) ل0،024 ملم (0.002٪) ثاليوم ₂ SO _4. يتم تكرار سلسلة في أعمدة 2-12 و13-23. (B) الإسفار خريطة كثافة تدفق تصور ثاليوم ⁺ لكل ما يقرب من 1 دقيقة جيدا بعد إضافة ⁺ TL. شريط الزائفة اللون على اليمين يشير إلى مدى ثاليوم ⁺ حالة تغير مستمر، مع برودة وسخونة الألوان تمثل القيم تدفق المنخفضة والعالية، على التوالي. لاحظ أن برودة الألوان في العمود 1، الصفوف A1-23، K1-12، F13-23، و23-P13 ومن المقرر أن انخفاض تدفق ⁺ ثاليوم في الخلايا uninduced. الآبار المتبقية، بما في ذلك تلك الموجودة في العمود 24، تحتوي على خلايا التي كانت تعامل مع التتراسيكلين للحث على قناة قير التعبير (انظر الخريطة خلية الطلاء في الشكل 1A). (C) يعني ± SEM CRC للتغييرات التي تعتمد ⁺ ثاليوم في مضان (ن = 3). تركيب وظائفه اللوجستية أربع المعلمةأسفرت نشوئها إلى البيانات وIC ₈₀ ⁺ قيمة ثاليوم 15٪. اضغط هنا لمشاهدتها بشكل اكبر شخصية .

الشكل 3. التسامح مقايسة لDMSO. (A) المصدر خريطة لوحة المستخدمة لتحديد التسامح مقايسة لDMSO. العمودين 1 و 24 تحتوي على HBSS العازلة الفحص. الصفوف تحتوي على تركيز 2X من سلسلة 2-أضعاف تخفيف DMSO تتراوح بين 10٪ إلى 0.01٪ V / V. (B) الممثل خريطة كثافة مضان تصور تدفق ثاليوم ⁺ في كل دقيقة تقريبا 1 سجلت جيدا بعد إضافة ⁺ TL. شريط الزائفة اللون على اليمين يشير إلى مدى ثاليوم ⁺ حالة تغير مستمر، مع برودة وسخونة الألوان تمثل القيم تدفق المنخفضة والعالية، على التوالي. (C) يعني ±؛ SEM (ن = 9) ⁺ ثاليوم تدفق تطبيع لتلك المسجلة في وجود مخزن مؤقت مقايسة HBSS وحدها. اضغط هنا لمشاهدتها بشكل اكبر شخصية .

الشكل 4. حساسية الفحص لتعرف المركبات النشطة عقاقيري. (A) المصدر خريطة لوحة المستخدمة لتقييم نشاط المعروف المركبات النشطة عقاقيري في ثاليوم ⁺ فحص تدفق. صف والأعمدة 1 و 24 تحتوي على 0.1٪ V / V DMSO. تخطيط لوحة يسمح للاختبار من 10 مركبات في ثلاث نسخ في الأعمدة 2-23. الصفوف تحتوي على تركيز 2X من سلسلة 3-أضعاف تخفيف مسلسل من المركبات تتراوح بين 100 ميكرومتر إلى 2 نانومتر (B) الإسفار خريطة كثافة تدفق تصور ثاليوم ⁺ لكل approximatel جيداذ 1 دقيقة بعد ثاليوم ⁺ بالإضافة. شريط الزائفة اللون على اليمين يشير إلى مدى ثاليوم ⁺ حالة تغير مستمر، مع برودة وسخونة الألوان تمثل القيم تدفق المنخفضة والعالية، على التوالي. لاحظ أن الآبار في العمود 1 والصف A1-23 تحتوي على خلايا uninduced. الآبار المتبقية تحتوي على الخلايا التي يسببها التتراسيكلين معربا عن قناة قير المصالح (انظر الخريطة وحة الخلية في الشكل 1C). (C) ⁺ الممثل ثاليوم الناجم عن التغيرات في FluoZin 2-مضان في الآبار قبل تعامل مع التركيز المانع المشار إليه من قناة قير. اضغط هنا لمشاهدتها بشكل اكبر شخصية .

الشكل 5. تحديد مدى ملاءمتها للمقايسة HTS. (A) لوحة المصدراستخدام الخريطة لتقييم تقلب جيدا إلى جانب الآبار التي تحتوي على 0،1 بين DMSO٪ (مركبة) أو التركيز الفعال الحد الأقصى من المعروف المانع. (B) الإسفار خريطة كثافة تدفق تصور ثاليوم ⁺ في كل دقيقة تقريبا 1 جيدا بعد إضافة ⁺ TL. لاحظ أن جميع الآبار تحتوي على الخلايا التي يسببها التتراسيكلين معربا عن قناة قير المصالح (انظر الخريطة وحة الخلية في الشكل 1B). (C) الممثل مؤامرة مبعثر من القيم مضان ثابتة للدولة التي تم الحصول عليها من الآبار أو مركبات مثبطات المعاملة. يشار إلى السعة يعني مضان كل عينة السكان مع خط متصل، يظهر 3 انحرافات قياسية من الوسط مع خط متقطع، وعينات بالتناوب لسيارة (VHL) والمانع (INH) ورسوم بيانية كنقاط الفردية. اضغط هنا ل مشاهدتها بشكل اكبر شخصية .

Discussion

بيانات العلاج: حالما يتم جمع البيانات، وهي خطوة مشتركة في التحليل ينطوي على تطبيع استجابة كل بئر في مضان، F، إلى قيمته الأولية في بداية التجربة، F _0. ويشار إلى هذه على أنها "نسبة ثابتة" ويرمز "F / F ^_0". وفي الحالات التي يهيمن F ₀ من الصبغة العملية مؤشر نسبة ثابتة إلى حد كبير سوف تصحيح لعوامل كثيرة مثل disuniformities في الإضاءة، وجمع الإشارة، والخلية رقم. في الحالات التي يكون فيها إشارة ضعيفة أو صبغ مضان الخلفية أو تأملات في النظام مرتفعة، فإن نسبة ثابتة لا تكون فعالة إلا إذا أمكن التعامل بشكل مناسب الخلفية قبل مع حساب نسبة ثابتة. بعد تطبيع البيانات، انه يعتبر نموذجا للحد من مضان الموجي قيمة واحدة التي سيتم استخدامها لتحديد واختيار النشاط مشاهدات. والأكثر شيوعا أن يتم ذلك عن طريق تركيب البياناتالنقاط في 10 ثانية بعد إضافة ثاليوم ⁺ للحصول على منحدر الأولي من الزيادة أثار مضان. لقطف ضرب، نهج شعبية هو أن نفترض أن الغالبية العظمى من السكان في مركبات غير نشطة اختبار (فرضية العدم هو في القوة). يتم احتساب المتوسط ​​والانحراف المعياري للسكان الاختبار ويتم اختيار عدد الزيارات التي هي ثلاثة انحرافات معيارية عن المتوسط.

تقسيم البروتوكول للحضانات مجمع طويلة: مثبطات قناة للكشف عن قير، ولا سيما أولئك الذين يعملون في مواقع الربط بين الخلايا، وقد يكون من المفيد لاحتضان الخلايا مع مركبات الاختبار لفترة طويلة من الزمن (مثلا 20 دقيقة) قبل إضافة ثاليوم ^+. إذا تم إضافة مركبات "غير متصل" قبل عرض مقايسة للقارئ لوحة، قد لا الخصائص البصرية للمركبات اختبار (مثل مضان) يتم الاعتراف بسهولة ويمكن أن يؤثر سلبا استخدامابيانات تطبيع الطرق مثل "نسبة ثابتة" F / F ₀ الموصوفة أعلاه مما أدى إلى ايجابيات كاذبة و / أو السلبيات كاذبة. لتجنب هذه المشكلة في وقت واحد مع تجنب الحاجة إلى الحفاظ على لوحة فحص في القارئ لحضانة طويلة، حل واحد هو استخدام "اثنين قراءة" البروتوكول. للقراءة الأولى هي قصيرة (مثل 30 ثانية) التجربة حيث يتم إضافة 10 ثانية بعد مجمع للسماح القبض على إضافة ما قبل مجمع F ₀ و لتقييم آثار المركبات 'البصرية على النظام. ثم تتم إزالة لوحة من القارئ وحضنت للفترة المطلوبة، وعاد إلى القارئ لإضافة الثاليوم. بعد الانتهاء من قراءة كل من، أول قراءة ويمكن استخدام F ₀ لتطبيع البيانات من الثانية كما يلي وبالتالي تجنب الكثير من القضايا المرتبطة مضيفا المركبات "غير متصل" في الوقت الذي تسمح الفرصة للحفاظ على القارئ مشغول جمع البيانات وبالتالي تحسين الإنتاجية الفرز. النهج هو الأكثر قراءة وثيقتين بسهولة implemented عند استخدام نظام الفرز الآلي. من المهم أن نلاحظ أن النهج قراءة وثيقتين لن تقضي المشاكل التي تسببها مركبات الفلورسنت التي تشبع كشف و / أو يسبب للقراءة من القطع الأثرية في الكاميرا CCD.

تكوين لتفعيل مقايسة: يتم تنشيط الحد الأقصى ليست كل القنوات قير في ظل ظروف الراحة، وبالتالي قد يكون من الممكن لتصميم الفحص التي يمكن الكشف عن جزيء صغير تفعيل. في هذه الحالات، واختيار من ₈₀ EC تركيز ثاليوم قد لا توفر ما يكفي ⁺ "الإرتفاع" لفحص للكشف عن المنشطات موثوق. وهكذا، يمكن للمرء أن يختار لاستخدام أقل تركيز ثاليوم ⁺ (مثل EC ₂₀₎ المنشط في المقايسات. في بعض الحالات، قد يظهر الفحص تقلب منخفضة بما فيه الكفاية للسماح للاستخدام تركيز ₅₀ ⁺ EC من ثاليوم والقرار لا تزال توفر مناسبة لكلا تنشيط وتثبيط قناة السكان. في هذه الحالة، مقايسة مإجراء AY في وضع المنشط / المانع المزدوج. عندما تكون متاحة، ويمكن استخدام منشط المعروفة للمساعدة في تحديد المناسب ليرة تركية ⁺ تركيز تعظيم فرص اكتشاف تفعيل القناة.

القيود: هناك بعض القيود التي ينبغي النظر فيها خلال وضع وتنفيذ ليرة تركية ⁺ تدفق عالية الإنتاجية القائمة على الشاشة. على سبيل المثال، تعتمد على الفحص تدبيرا غير المباشرة للنشاط قناة قير باستخدام مسبار الفلورسنت التي البصرية خصائص يمكن أن تتأثر بشكل مباشر من قبل المركبات في الشاشة. ولذلك، لا بد من الملاحظات الهامة من أكد ثاليوم ⁺ التجارب باستخدام تدفق الجهد الكهربية المشبك، الذي يعتبر "المعيار الذهبي" لطريقة الصيدلة قناة أيون. وعلاوة على ذلك، قد الجزيئات الصغيرة لها تأثير مباشر على تدفق الذاتية مسارات ثاليوم ⁺ أعرب في الخلايا HEK-293، مما أدى إلى تحديد إيجابية كاذبة الزيارات. وتتراسايكلينالبريد محرض النظام هو مفيدة بشكل خاص للتمييز إيجابية كاذبة من مشاهدة قناة قير الموجهة جهري لأنه يمكن فحص يضرب بسرعة في الخلايا uninduced للآثار على المسارات الداخلية. وأخيرا، فإن ذوبان منخفضة من ثاليوم ⁺ في كلوريد المحتوية على مخازن يحد من تركيز ثاليوم ⁺ التي يمكن استخدامها في فحص، الأمر الذي يتطلب استخدام منطقة عازلة ثاليوم غير الفسيولوجية التي قد التحفيز ⁺ زيادة الصيدلة من الهدف ^11. وينبغي أن توافق مخازن مختلفة مع الهدف من خلال تقييم دقيق الفائدة التنمية مقايسة. ويمكن أن يتم ذلك عن طريق إنشاء مراكز التأهيل المجتمعي للجهري المعروفة باستخدام مختلف الحوافز ⁺ مخازن ثاليوم واختيار الظروف التي والصيدلة الأكثر تطابقا يطابق تلك التي لوحظت باستخدام مخازن الفسيولوجية.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
pcDNA5/TO	Invitrogen	V1033-20	Tetracycline-inducible expression vector
T-REx-HEK293 cells	Invitrogen	R71007	Tetracycline-inducible cell line
Lipofectamine LTX/Plus Reagent	Invitrogen	15338100	Transfection reagent
FBS	ATLANTA Biologicals	S11550	Cell culture media
DMEM	Invitrogen	11965	Cell culture media
Hygromycin B	Invitrogen	10687-010	Cell culture media
Blasticidin S	Invitrogen	R210-01	Cell culture media
Penicillin/Streptomycin	Invitrogen	15140	Cell culture media
HBSS-divalent free	Mediatech	21022CV	Cell washing
Trypsin-0.25%	Mediatech	25053CI	Cell dissociation
Tetracycline-HCl	Sigma	T9823	Induction reagent
Dialyzed FBS	ATLANTA Biologicals	S12650	Plating media
FluoZin-2	Invitrogen	F24189	Fluorescent dye
Pluronic F-127	Invitrogen	P-3000MP	Dye loading
HBSS	Invitrogen	14175	Assay buffer
HEPES	Invitrogen	15630	Assay buffer
NaHCO3	Sigma	S6297	Tl+ stimulus buffer
MgSO4	Sigma	M2643	Tl+ stimulus buffer
CaSO4∙2H2O	Sigma	C3771	Tl+ stimulus buffer
D-Glucose	Sigma	G7528	Tl+ stimulus buffer
Thallium sulfate	Aldrich	204625	Tl+ stimulus buffer
HEPES	Sigma	H4034	Tl+ stimulus buffer
DMSO	Sigma	D4540	Solvent
Eight-channel electronic pipettor	Biohit	E300	Cell plating in 384-well plates
BD PureCoat amine-coated 384-well plates	BD Biosciences	356719	Assay microplates
Echo qualified 384-Well polypropylene microplate (384PP)	Labcyte	P-05525	Compound source microplates
384-well polypropylene microplates	Greiner Bio-One	781280
Multidrop Combi reagent dispenser	Thermo Scientific	5840300
ELx405 microplate washer	BioTek	ELx405HT	Automated cell washing
Echo liquid handler	Labcyte	Labcyte Echo 550
Bravo automated liquid handling platform	Agilent Technologies	Standard model
Hamamatsu FDSS 6000	Hamamatsu		Kinetic imaging plate reader
Table 1. List of Materials and Reagents.