Metoder til udvikling og validering af en kvantitativ fluorescens assay til måling af aktiviteten af indadgående ensretter kalium (Kir) kanaler til high-throughput sammensatte screening er præsenteret.
Specifikke medlemmer af aktiv ensretter kalium (Kir) kanal familien postuleres lægemiddelmål for en række lidelser, herunder hypertension, atrieflimren, og smerte 1,2. For det meste er der dog fremskridt i retning af at forstå deres terapeutiske potentiale eller endda basale fysiologiske funktioner er blevet bremset på grund af manglen på gode farmakologiske værktøjer. Faktisk har den molekylære farmakologi indad ensretter familien haltet langt bagefter S4 superfamilie af spændingsstyrede kalium (KV) kanaler, hvor en række nanomolær affinitet og højselektive peptid toxin modulatorer er blevet opdaget 3. The bigift toksin tertiapin og dets derivater er kraftige inhibitorer af Kir1.1 og Kir3 kanaler 4,5, men peptider er af begrænset nytte terapeutisk såvel som eksperimentelt på grund af deres antigene egenskaber og ringe biotilgængelighed, metaboliske stabilitet og væv penetrans. Udviklingen af potenteog selektive små molekyler prober med forbedrede farmakologiske egenskaber vil være en nøgle til fuldt ud at forstå fysiologi og terapeutiske potentiale af Kir-kanaler.
The Molecular Biblioteker Probes Production Center Network (MLPCN) støttet af National Institutes of Health (NIH) fælles fond har skabt muligheder for akademiske forskere at indlede probe opdagelse kampagner for molekylære mål og signalveje, der har behov for bedre farmakologi 6. Den MLPCN giver forskere adgang til industri-skala screening centre og medicinsk kemi og informatik støtte til at udvikle små molekyler sonder at belyse funktionen af gener og gen netværk. Det kritiske trin i at få adgang til MLPCN er udviklingen af en robust mål-eller pathwaygen-specifikke assay, der er modtagelig for high-throughput screening (HTS).
Her beskriver vi hvordan man udvikler en fluorescens-baseret thallium (Tl +) flux ASSAy af Kir kanalfunktion til high-throughput screening forbindelse 7,8,9,10. Assayet er baseret på permeabiliteten af K +-kanal pore til K + congener Tl +. Et kommercielt tilgængeligt fluorescerende Tl + rapportør-farvestof anvendes til påvisning transmembrane flux af Tl + gennem poren. Der er mindst tre kommercielt tilgængelige farvestoffer, som er egnede til Tl + flux assays: BTC, FluoZin-2, og FluxOR 7,8. Denne protokol beskriver assay udvikling ved hjælp FluoZin-2. Selvom oprindeligt udviklet og markedsført som en zink-indikator, FluoZin-2 udviser en robust og dosisafhængig stigning i fluorescensemission ved Tl + binding. Vi begyndte at arbejde med FluoZin-2 før FluxOR var tilgængelig 7,8 og har fortsat med at gøre det 9,10. Men trinene i assay udvikling er det væsentlige identiske for alle tre farvestoffer, og brugerne bør afgøre, hvilke farve der er mest hensigtsmæssig for deres specifikke needs. Vi diskuterer også assayet s benchmarks, som skal opfyldes for at komme i betragtning til optagelse i MLPCN. Da Tl + let gennemtrænger fleste K +-kanaler, bør assayet kunne tilpasses til de fleste K +-kanal mål.
Databehandling: Når data indsamles, indbefatter et almindeligt trin i analysen normalisere hver brønd er fluorescensresponset, F, til den oprindelige værdi ved begyndelsen af eksperimentet, F 0. Dette omtales ofte som "statisk forholdet" og symboliseret "F / F 0". Hvis F 0 domineres af indikatorfarvestoffet den statiske forhold operation vil det væsentlige korrigere for mange faktorer såsom disuniformities i belysningen, signal samling…
The authors have nothing to disclose.
Dette arbejde blev støttet af midler fra National Institutes of Health tilskud 1R21NS073097-01 og 1R01DK082884 (JSD) og Institut for National Institutes tilskuddet PIER11VCTR.
Name of the reagent | Company | Catalog number | Comments |
pcDNA5/TO | Invitrogen | V1033-20 | Tetracycline-inducible expression vector |
T-REx-HEK293 cells | Invitrogen | R71007 | Tetracycline-inducible cell line |
Lipofectamine LTX/Plus Reagent | Invitrogen | 15338100 | Transfection reagent |
FBS | ATLANTA Biologicals | S11550 | Cell culture media |
DMEM | Invitrogen | 11965 | Cell culture media |
Hygromycin B | Invitrogen | 10687-010 | Cell culture media |
Blasticidin S | Invitrogen | R210-01 | Cell culture media |
Penicillin/Streptomycin | Invitrogen | 15140 | Cell culture media |
HBSS-divalent free | Mediatech | 21022CV | Cell washing |
Trypsin-0.25% | Mediatech | 25053CI | Cell dissociation |
Tetracycline-HCl | Sigma | T9823 | Induction reagent |
Dialyzed FBS | ATLANTA Biologicals | S12650 | Plating media |
FluoZin-2 | Invitrogen | F24189 | Fluorescent dye |
Pluronic F-127 | Invitrogen | P-3000MP | Dye loading |
HBSS | Invitrogen | 14175 | Assay buffer |
HEPES | Invitrogen | 15630 | Assay buffer |
NaHCO3 | Sigma | S6297 | Tl+ stimulus buffer |
MgSO4 | Sigma | M2643 | Tl+ stimulus buffer |
CaSO4•2H2O | Sigma | C3771 | Tl+ stimulus buffer |
D-Glucose | Sigma | G7528 | Tl+ stimulus buffer |
Thallium sulfate | Aldrich | 204625 | Tl+ stimulus buffer |
HEPES | Sigma | H4034 | Tl+ stimulus buffer |
DMSO | Sigma | D4540 | Solvent |
Eight-channel electronic pipettor | Biohit | E300 | Cell plating in 384-well plates |
BD PureCoat amine-coated 384-well plates | BD Biosciences | 356719 | Assay microplates |
Echo qualified 384-Well polypropylene microplate (384PP) | Labcyte | P-05525 | Compound source microplates |
384-well polypropylene microplates | Greiner Bio-One | 781280 | |
Multidrop Combi reagent dispenser | Thermo Scientific | 5840300 | |
ELx405 microplate washer | BioTek | ELx405HT | Automated cell washing |
Echo liquid handler | Labcyte | Labcyte Echo 550 | |
Bravo automated liquid handling platform | Agilent Technologies | Standard model | |
Hamamatsu FDSS 6000 | Hamamatsu | Kinetic imaging plate reader |
Table 1. List of Materials and Reagents.