Metoder for å utvikle og validere en kvantitativ fluorescens analysen for å måle aktiviteten til indre likeretter kalium (Kir) kanaler for high-throughput sammensatte screening er presentert.
Bestemte medlemmer av den innovervendte likeretter kalium (KIR) kanal familie er postulert stoffet mål for en rekke lidelser, inkludert hypertensjon, atrieflimmer, og smerte 1,2. For det meste har imidlertid fremgang mot å forstå deres terapeutiske potensialet eller selv grunnleggende fysiologiske funksjoner blitt bremset av mangel på gode farmakologiske verktøy. Faktisk har den molekylære farmakologien innover likeretter familien ligget langt bak at av S4 superfamily av spenningsstyrte kaliumkanaler (Kv) kanaler, som en rekke nanomolar affinitet og svært selektive peptid toksin modulatorer har blitt oppdaget tre. Bee venom toxin tertiapin og dets derivater er potente inhibitorer av Kir1.1 og Kir3 kanaler 4,5, men peptider er av begrenset bruk terapeutisk samt eksperimentelt grunnet deres antigene egenskaper og dårlig biotilgjengelighet, metabolsk stabilitet og vev penetrans. Utviklingen av potenteog selektive små-molekyl sonder med forbedrede farmakologiske egenskaper vil være en nøkkel til fullt ut å forstå fysiologi og terapeutiske potensialet i Kir-kanaler.
Molecular Libraries Sonder produksjon sentrum Network (MLPCN) støttet av National Institutes of Health (NIH) felles fond har skapt muligheter for faglig forskere å starte probe discovery kampanjer for molekylære mål og signalveier som har behov for bedre farmakologi 6. Den MLPCN gir forskerne tilgang til industri-skala screening sentre og medisinsk kjemi og informatikk støtte for å utvikle små-molekyl sonder for å belyse genenes funksjoner og gen nettverk. Det kritiske i å få adgang til MLPCN er utviklingen av en robust mål-eller sti-spesifikk metode som er mottagelig for high-throughput screening (HTS).
Her beskriver vi hvordan du kan utvikle en fluorescens-basert thallium (Tl +) flux assay av Kir kanalfunksjon for high-throughput screening sammensatte 7,8,9,10. Forsøket er basert på permeabiliteten av K + kanal pore til K + kongenerprofil Tl +. En kommersielt tilgjengelig fluorescerende Tl + reporter fargestoff brukes til å oppdage transmembrane fluks av Tl + gjennom pore. Det er minst tre kommersielt tilgjengelige fargestoffer som er egnet for Tl + flux analyser: BTC, FluoZin-2, og FluxOR 7,8. Denne protokollen beskriver analysen utvikling ved hjelp FluoZin-2. Selv opprinnelig utviklet og markedsført som en sink indikator, FluoZin-2 viser en robust og doseavhengig økning i fluorescensemisjon på Tl + binding. Vi begynte å jobbe med FluoZin-2 før FluxOR var tilgjengelig 7,8 og har fortsatt å gjøre det 9,10. Men trinnene i analysen utvikling er i hovedsak identisk for alle tre fargestoffer, og brukerne bør avgjøre hvilken farge er mest hensiktsmessig for deres spesifikke needs. Vi diskuterer også analysen er ytelsestester som må nås for å bli vurdert for innreise til MLPCN. Siden Tl + lett gjennomtrenger fleste K +-kanaler, bør analysen kunne tilpasses de fleste K + kanal mål.
Data behandling: Etter at data blir samlet inn, innebærer en vanlig trinn i analysen normalisere hver brønnens fluorescens respons, F, til sin opprinnelige verdi ved begynnelsen av eksperimentet, 0 F. Dette er ofte referert til som "statiske ratio" og symbolisert "F / F 0". I tilfeller der F 0 er dominert av indikatoren fargestoff den statiske ratio operasjonen vil vesentlig korrigere for mange faktorer som disuniformities i belysning, si…
The authors have nothing to disclose.
Dette arbeidet ble støttet av midler fra National Institutes of Health tilskudd 1R21NS073097-01 og 1R01DK082884 (JSD) og Stiftelsen for National Institutes tilskuddet PIER11VCTR.
Name of the reagent | Company | Catalog number | Comments |
pcDNA5/TO | Invitrogen | V1033-20 | Tetracycline-inducible expression vector |
T-REx-HEK293 cells | Invitrogen | R71007 | Tetracycline-inducible cell line |
Lipofectamine LTX/Plus Reagent | Invitrogen | 15338100 | Transfection reagent |
FBS | ATLANTA Biologicals | S11550 | Cell culture media |
DMEM | Invitrogen | 11965 | Cell culture media |
Hygromycin B | Invitrogen | 10687-010 | Cell culture media |
Blasticidin S | Invitrogen | R210-01 | Cell culture media |
Penicillin/Streptomycin | Invitrogen | 15140 | Cell culture media |
HBSS-divalent free | Mediatech | 21022CV | Cell washing |
Trypsin-0.25% | Mediatech | 25053CI | Cell dissociation |
Tetracycline-HCl | Sigma | T9823 | Induction reagent |
Dialyzed FBS | ATLANTA Biologicals | S12650 | Plating media |
FluoZin-2 | Invitrogen | F24189 | Fluorescent dye |
Pluronic F-127 | Invitrogen | P-3000MP | Dye loading |
HBSS | Invitrogen | 14175 | Assay buffer |
HEPES | Invitrogen | 15630 | Assay buffer |
NaHCO3 | Sigma | S6297 | Tl+ stimulus buffer |
MgSO4 | Sigma | M2643 | Tl+ stimulus buffer |
CaSO4•2H2O | Sigma | C3771 | Tl+ stimulus buffer |
D-Glucose | Sigma | G7528 | Tl+ stimulus buffer |
Thallium sulfate | Aldrich | 204625 | Tl+ stimulus buffer |
HEPES | Sigma | H4034 | Tl+ stimulus buffer |
DMSO | Sigma | D4540 | Solvent |
Eight-channel electronic pipettor | Biohit | E300 | Cell plating in 384-well plates |
BD PureCoat amine-coated 384-well plates | BD Biosciences | 356719 | Assay microplates |
Echo qualified 384-Well polypropylene microplate (384PP) | Labcyte | P-05525 | Compound source microplates |
384-well polypropylene microplates | Greiner Bio-One | 781280 | |
Multidrop Combi reagent dispenser | Thermo Scientific | 5840300 | |
ELx405 microplate washer | BioTek | ELx405HT | Automated cell washing |
Echo liquid handler | Labcyte | Labcyte Echo 550 | |
Bravo automated liquid handling platform | Agilent Technologies | Standard model | |
Hamamatsu FDSS 6000 | Hamamatsu | Kinetic imaging plate reader |
Table 1. List of Materials and Reagents.