Metoder för att utveckla och validera en kvantitativ fluorescens analys för att mäta aktiviteten av inre likriktare kalium (KIR) kanaler för high-throughput förening screening presenteras.
Specifika medlemmar av inre likriktare kalium (KIR) kanal familj postulerade läkemedelsmål för olika sjukdomar, inklusive högt blodtryck, förmaksflimmer, och smärta 1,2. För det mesta har dock framsteg mot att förstå deras terapeutiska potential eller ens grundläggande fysiologiska funktioner har bromsats av bristen på goda farmakologiska verktyg. I själva verket har den molekylära farmakologi för aktiv likriktare familjen släpat långt efter S4 superfamiljen av spänningskänsliga kalium (kV) kanaler, där ett antal nanomolar affinitet och mycket selektiva peptid modulatorer toxin har upptäckts 3. Den bigift toxin tertiapin och dess derivat är potenta hämmare av Kir1.1 och Kir3 kanaler 4,5, men peptiderna är av begränsad användning terapeutiskt liksom experimentellt på grund av deras antigena egenskaper och dålig biotillgänglighet, metaboliska stabilitet och vävnad penetrans. Utvecklingen av potentaoch selektiva små molekyler sonder med förbättrade farmakologiska egenskaper kommer att vara en nyckel till fullo förstå fysiologi och terapeutiska potentialen hos Kir-kanaler.
Den molekylära bibliotek Sonder Production Center Network (MLPCN) som stöds av National Institutes of Health (NIH) gemensamma fonden har skapat möjligheter för akademiska forskare att inleda sond upptäckt kampanjer för molekylära mål och signalvägar i behov av bättre farmakologi 6. Den MLPCN ger forskare tillgång till industri-screening centra och läkemedelskemi och informatik stöd för att utveckla små molekyler sonder att belysa funktionen hos gener och nätverk gen. Det kritiska steget i att få inträde till MLPCN är utvecklingen av en robust mål-eller vägen-specifik analys som är mottaglig för high-throughput screening (HTS).
Här beskriver vi hur man kan utveckla en fluorescens-baserad tallium (Tl +) flux assay Kir kanalens funktion för high-throughput screening förening 7,8,9,10. Analysen är baserad på permeabiliteten hos K + kanalen por till K + kongenen Tl +. En kommersiellt tillgänglig fluorescerande Tl + reporterfärgämnet används för att detektera transmembranflödet av Tl + genom poren. Det finns åtminstone tre kommersiellt tillgängliga färgämnen som är lämpliga för TL + flux analyser: BTC, FluoZin-2 och FluxOR 7,8. Detta protokoll beskriver analys utveckling med FluoZin-2. Även ursprungligen utvecklades och marknadsförs som en zink indikator, FluoZin-2 uppvisar en robust och dosberoende ökning av fluorescensemission på Tl + bindning. Vi började arbeta med FluoZin-2 innan FluxOR fanns 7,8 och har fortsatt att göra det 9,10. Men stegen i analysen utveckling är i huvudsak identiska för alla tre färger, och användarna bör avgöra vilken färg som är mest lämplig för deras specifika NEEDS. Vi diskuterar också analysens prestandatester som måste nås för att komma i fråga för tillträde till MLPCN. Eftersom Tl + lätt genomsyrar de flesta K +-kanaler, bör analysen kunna anpassas till de flesta K + kanaler mål.
Data behandling: När data samlas in, innebär en gemensam steg i analysen normalisera varje brunn är fluorescens svar, F, till sitt ursprungliga värde vid början av experimentet, F 0. Detta brukar kallas "statiska förhållandet" och symboliserade "F / F 0". I de fall där F 0 domineras av indikatorfärgämnet den statiska förhållandet operationen väsentligt kommer att korrigera för många faktorer som disuniformities i belysning, s…
The authors have nothing to disclose.
Detta arbete stöddes av medel från National Institutes of Health bidrag 1R21NS073097-01 och 1R01DK082884 (JSD) och fonden för National Institutes bidraget PIER11VCTR.
Name of the reagent | Company | Catalog number | Comments |
pcDNA5/TO | Invitrogen | V1033-20 | Tetracycline-inducible expression vector |
T-REx-HEK293 cells | Invitrogen | R71007 | Tetracycline-inducible cell line |
Lipofectamine LTX/Plus Reagent | Invitrogen | 15338100 | Transfection reagent |
FBS | ATLANTA Biologicals | S11550 | Cell culture media |
DMEM | Invitrogen | 11965 | Cell culture media |
Hygromycin B | Invitrogen | 10687-010 | Cell culture media |
Blasticidin S | Invitrogen | R210-01 | Cell culture media |
Penicillin/Streptomycin | Invitrogen | 15140 | Cell culture media |
HBSS-divalent free | Mediatech | 21022CV | Cell washing |
Trypsin-0.25% | Mediatech | 25053CI | Cell dissociation |
Tetracycline-HCl | Sigma | T9823 | Induction reagent |
Dialyzed FBS | ATLANTA Biologicals | S12650 | Plating media |
FluoZin-2 | Invitrogen | F24189 | Fluorescent dye |
Pluronic F-127 | Invitrogen | P-3000MP | Dye loading |
HBSS | Invitrogen | 14175 | Assay buffer |
HEPES | Invitrogen | 15630 | Assay buffer |
NaHCO3 | Sigma | S6297 | Tl+ stimulus buffer |
MgSO4 | Sigma | M2643 | Tl+ stimulus buffer |
CaSO4•2H2O | Sigma | C3771 | Tl+ stimulus buffer |
D-Glucose | Sigma | G7528 | Tl+ stimulus buffer |
Thallium sulfate | Aldrich | 204625 | Tl+ stimulus buffer |
HEPES | Sigma | H4034 | Tl+ stimulus buffer |
DMSO | Sigma | D4540 | Solvent |
Eight-channel electronic pipettor | Biohit | E300 | Cell plating in 384-well plates |
BD PureCoat amine-coated 384-well plates | BD Biosciences | 356719 | Assay microplates |
Echo qualified 384-Well polypropylene microplate (384PP) | Labcyte | P-05525 | Compound source microplates |
384-well polypropylene microplates | Greiner Bio-One | 781280 | |
Multidrop Combi reagent dispenser | Thermo Scientific | 5840300 | |
ELx405 microplate washer | BioTek | ELx405HT | Automated cell washing |
Echo liquid handler | Labcyte | Labcyte Echo 550 | |
Bravo automated liquid handling platform | Agilent Technologies | Standard model | |
Hamamatsu FDSS 6000 | Hamamatsu | Kinetic imaging plate reader |
Table 1. List of Materials and Reagents.