Summary
Abbiamo sviluppato un nuovo approccio chirurgico per somministrazione endotracheale di agenti bioattivi nel feto mouse. Il percorso di consegna è più efficiente in termini di orientamento dei polmoni fetali del mouse rispetto al comunemente usato intra-amniotico iniezione. Questa procedura deve momento non è stata descritta in un modello murino.
Abstract
Prenatale somministrazione polmonare di cellule, geni o agenti farmacologici potrebbe fornire la base per nuove strategie terapeutiche per una varietà di malattie genetiche e acquisite. Oltre anomalie congenite o ereditaria con il requisito di lungo termine espressione del gene espresso, parecchi non-ereditate condizioni perinatali, dove a breve termine espressione genica o intervento farmacologico è sufficiente per ottenere effetti terapeutici, sono considerati potenziali indicazioni future per questo tipo di approccio. Malattie candidati per l'applicazione della terapia a breve termine prenatale potrebbe essere la carenza transitoria neonatale di B surfattante neonatale proteina che causa la sindrome da distress respiratorio 1,2 o lesioni hyperoxic del polmone neonatale 3. Malattie candidati per la correzione permanente terapeutica sono la fibrosi cistica (CF) 4, varianti genetiche di carenze tensioattivi 5 e α1-antitripsina 6.
<p class = "jove_content"> In generale, un importante vantaggio della terapia genica prenatale è la capacità di avviare l'intervento terapeutico precoce in sviluppo, o addirittura a prima manifestazioni cliniche della paziente, evitando così danni irreparabili alla persona. Inoltre, gli organi fetali hanno un aumentato tasso di proliferazione cellulare rispetto ad organi adulti, che potrebbe consentire un gene più efficiente o cellule staminali trasferimento nel feto. Inoltre, in gene delivery utero viene eseguita quando il sistema immunitario dell'individuo non è completamente maturo. Pertanto, il trapianto di cellule eterologhe o integrazione di una proteina non funzionale o assente con una versione corretta non dovrebbe causare sensibilizzazione immune alla cella, vettore o prodotto transgene, che è stato recentemente dimostrato di essere il caso con terapie sia cellulari e genetici 7 .In questo studio, abbiamo studiato la possibilità di indirizzare direttamente la trachea fetale in un m topoodello. Questa procedura è in uso in modelli animali più grandi come conigli e pecore e 8, anche in un ambiente clinico 9, ma ha per il momento non sono state realizzate prima in un modello murino. Quando si studia il potenziale della terapia genica fetale per malattie genetiche come la fibrosi cistica, il modello di mouse è molto utile come primo proof-of-concept per l'ampia disponibilità di diversi ceppi di topi transgenici, l'embriogenesi ben documentato e lo sviluppo del feto, meno rigorosi norme etiche, gestazione breve e la prole di grandi dimensioni.
Diverse vie di accesso sono stati descritti per indirizzare il polmone fetale roditore, anche intra-amniotico iniezione 10-12, (eco-guidata) intrapolmonare iniezione 13,14 e somministrazione per via endovenosa nei vasi sacco vitellino 15,16 o vena ombelicale 17. La nostra nuova procedura chirurgica consente ai ricercatori di iniettare il farmaco di scelta direttamente nella trachea del mouse fetale che consenteper una consegna più efficiente per le vie respiratorie rispetto alle tecniche esistenti 18.
Protocol
1. Accoppiamento di topi ottenere stage gravidanza desiderata
Tempo compagno femmine di topo gravide NMRI in modo che siano 18 giorni (E18) in stato di gravidanza (totale gestazione E19.5) al momento della chirurgia. Prima e dopo l'intervento chirurgico sono alloggiati in gabbie di filtri migliori a temperatura ambiente normale e normale luce diurna con libero accesso ad acqua e cibo.
2. Fetale intratracheale (IT) Injection (Figura 1)
- Sottoporre il topo incinta NMRI ad anestesia generale con 1,5% isoflurano in una miscela di O 2 a 1,5 L / min. Il livello di isoflurano dipende dall'età e ceppo del topo, ma in generale isoflurano dovrebbe essere ad un livello che mette animali in stato anestetico. Poi mettere il mouse incinta su un rilievo di riscaldamento (37 ° C) per mantenere la temperatura corporea durante chirurgia.
- L'intera procedura chirurgica viene eseguita da due chirurghi. Un chirurgo eseguirà la dissezione del mouse in stato di gravidanza e la successiva esposizione di secolofeto e per l'iniezione intratracheale. Il chirurgo secondo esegue l'iniezione intratracheale fetale stessa. La procedura chirurgica viene eseguita con uno strumento sterile e una tecnica asettica.
- Disinfettare l'addome con ioduro di povidone ed eseguire una laparotomia mediana per esporre l'utero gravido. Esteriorizzare un corno uterino alla volta e contare il numero di sacche gestazionali. Un feto per corno è operato e scelto in base alla posizione ottimale per esteriorizzazione della testa fetale nei passaggi successivi. Il feto più adatto viene selezionato tramite visualizzazione attraverso la parete uterina. Il naso della testa fetale deve essere rivolto verso il chirurgo che inietterà nella trachea dopo l'esposizione della testa fetale e la fissazione all'indietro (come spiegato nel passaggio successivo 2.5).
- In primo luogo passare un polipropilene 6-0 (Prolene) sutura stringa di borsa di circa 1 cm di diametro attraverso la parete uterina e le membrane fetali (amniotico Membrane parietale e sacco vitellino) sopra l'area dove più tardi sulla testa fetale saranno esposte attraverso. Questa sutura mantiene il feto fissato all'interno dell'utero partire dal spalle. Successivamente, fare un'incisione in utero all'interno della stringa borsa di circa 0,8 cm usando forbici affilate.
- Premere delicatamente la testa e il collo del feto attraverso il isterotomia. Tirare la sutura stringa borsa delicatamente stretta intorno al collo e fissarlo in posizione con 2 micro-Mosquito pinza. La testa fetale è tenuto in iperestensione da un poliglattina 5-0 910 (Vicryl) sutura su due pinze poste nella bocca intorno alla mascella superiore.
- In microscopia stereoscopica zoom (ingrandimento x10) la trachea fetale viene visualizzato facendo una incisione verticale collo con dissezione tagliente e schietto. L'incisione nella regione del collo è circa 5 mm di lunghezza. Si tratta di una incisione superficiale, come il tessuto sottostante è ulteriormente sezionato utilizzando smussa per raggiungere la trachea.
- Per sostituire la testa in utero, applicare una leggera pressione sul naso. Il collo va prima torna in utero, seguita dalla testa. Il naso va per ultimo. Quindi, chiudere il isterotomia serrando la stringa borsa. Iniettare un totale di circa 0,5 ml di soluzione fisiologica nella cavità amniotica per evitare oligoidramnios. Per fare ciò, inserire un ago nel incisione all'interno della stringa borsa. Quindi, chiudere la sutura intorno all'ago, dopo di che viene iniettato salina. In un ultimo passaggio, ritrarre l'ago, seguita da chiudere completamente le pUrse stringa.
- Chiudere la parete addominale materna (peritoneo e strato muscolare interno ed esterno) e pelle con una sutura 5-0 Vicryl esecuzione in due strati separati. Successivamente, infiltrare l'incisione con il 0,2% xylocaina per il post-operatorio del dolore. Si raccomanda di utilizzare buprenorfina (0,05 - 0,1 mg / kg SC o IP) per il post-operatorio del dolore. Né tocolitici profilassi né antibiotici vengono utilizzati. I topi sono tenuti su una piastra elettrica (37 ° C) fino a quando non sono completamente recuperati (circa 1 ora).
3. Fetale intra-amniotico (IA) Iniezione
- Vedi 2.1
- Disinfettare l'addome con ioduro di povidone ed eseguire una laparotomia mediana per esporre l'utero gravido. Esteriorizzare un corno uterino alla volta e contare il numero di sacche gestazionali.
- IA iniezione può essere eseguita su tutti i feti come richiede meno tempo per eseguire. Inoltre, la posizione del feto non è criticacal rispetto a iniezione intratracheale. Poiché la parete uterina è semi-trasparente, le strutture fetali, come la testa, gli arti e la posizione della coda e della placenta sono ben visibili.
- Utilizzando lo stesso ago e la siringa come sopra (2,7), iniettare 30 ml di sostanza in prossimità della bocca fetale. Questo può essere fatto più facilmente sia tra la testa fetale e arti anteriori, o tra gli arti inferiori e la coda. L'iniezione viene eseguita solo dopo attento esame della posizione dell'ago per garantire che non strutture fetali sono in contatto con la punta al momento dell'iniezione.
- L'utero viene riposizionata nell'addome e la parete addominale e la pelle chiuso come descritto sopra (2,9).
4. Valutazione dei feti ad iniezione e Cross-promozione
- Uccidete la diga utilizzando un metodo approvato eutanasia 36 ore dopo l'intervento fetale (a E19.5). Dislocazione cervicale senza ulteriorianestesia sarebbe il metodo migliore, come tutte le altre forme di eutanasia che includono l'anestesia (ad esempio isoflurano, pentobarbital) si anestetizzare o addirittura uccidere i feti, che si vorrebbe evitare a tutti i tempi. Consegnare i azionamento-on feti con taglio cesareo. I feti azionamento sono identificati in utero dalla loro posizione. Cavità amniotiche sono numerati a partire dalla fine ovarica dell'utero bicorne.
- Dopo il parto, i seguenti criteri sono utilizzati per valutare la vitalità dei feti: la presenza di (1) un battito del cuore, (2) il colore della pelle rosa (contro cianotico) e (3) i movimenti spontanei. Posizionare cuccioli solo che soddisfano questi criteri nella lettiera di una madre adottiva, contenente cuccioli vecchi di un giorno. Per esperienza sappiamo che i cuccioli con un debole battito cardiaco, il colore della pelle cianotica e / o minimi movimenti spontanei spesso non sopravvivono a causa di rifiuto della cucciolata la madre adottiva o da cannibalismo materno.
- Dopo la consegna odye fa visibile tramite IT o iniezione IA (ad esempio molecole fluorescenti rossi), è possibile assicurare una corretta iniezione dalla presenza del colorante (colore rosa dalle fluospheres iniettati rosso) nella toracica (per iniezione diretta nei polmoni dopo IT iniezione, o per inalazione nei polmoni dopo iniezione IA) o cavità addominale (per ingestione). Ciò è possibile grazie al fatto che topi neonati sono semi-trasparenti consentendo valutazione in vivo dei polmoni e stomaco.
- Segna i cuccioli correttamente iniettati con inchiostro cinese per via sottocutanea al di sopra della base della coda. Mettere tutti i cuccioli, che soddisfano i requisiti di cui al punto 4.2 nella lettiera la madre adottiva di.
- Per assicurare la massima accettazione e la sopravvivenza dei cuccioli operati-on, non lasciano più di 10 cuccioli in totale nella lettiera la madre adottiva (entrambi i suoi propri cuccioli 1 giorno di vita, così come i cuccioli cross-promosse). Prima di posizionare il operato-on pups nella lettiera la madre adottiva, la loro copertura in lettiera dalla madre adottiva, che contiene sia le sue feci e urine per mascherare eventuali odori non familiari.
- Mettere la gabbia in un ambiente tranquillo e non disturbare la lettiera per almeno 12 ore (durante la notte).
- Il giorno seguente, valutare attentamente il tasso di sopravvivenza di favorire contando tutti i cuccioli, facendo la distinzione tra cuccioli della madre adottiva e le operati-on cuccioli (contrassegnate con inchiostro cinese e, in media, più piccolo degli altri cuccioli). Ridurre al minimo il tempo di manipolazione di questi cuccioli per evitare il rigetto da parte della madre e per evitare l'ipotermia. In generale, se i cuccioli non hanno il latte nello stomaco (che è visibile a causa della semi-trasparente natura di cuccioli appena nati), la prognosi è molto scarsa per la sopravvivenza ulteriore di questi animali.
5. Risultati rappresentativi
Lo schema generale di questo esperimento è rappresentato in Figure 2.
Determinazione del volume ottimale per l'iniezione intratracheale
Per determinare il volume ottimale per IT iniezione, abbiamo scelto empiricamente volumi diversi da 10, da 20 a 30 microlitri (n = 3/volume). Per il rilevamento facile, abbiamo scelto di iniettare rossi molecole fluorescenti (fluospheres, sonde molecolari, Leiden, Paesi Bassi) di dimensioni 100 nm. Dopo l'iniezione in IT E18 feti vecchi, i polmoni sono state raccolte 24 ore dopo, fissati in paraformaldeide al 4% a 4 ° C e 6 um sezioni congelate sono state effettuate. Filamenti di actina e nuclei sono stati colorati con Hoechst 33258 (Sigma-Aldrich, Bornem, Belgio) e Alexa Fluor 488 phalloidin (Invitrogen, Merelbeke, Belgio) rispettivamente per 20 min a temperatura ambiente. Immagini confocale sono state effettuate utilizzando un Biorad Radiance 2100 microscopio confocale con LaserSharp2000.6 software di Carl Zeiss. La fluorescenza relativa (rapporto tra rosso al blu fluospheres fluorescenza rappresentano e stainin nucleareg, rispettivamente) è stata quantificata mediante ImageJ online software (Figura 3). Anche se al momento della chirurgia fetale, un riflusso venne rilevata solo dopo l'iniezione di 30 microlitri, indicando un eccesso di fluidi iniettati, 30 microlitri dato la massima quantità di segnale fluorescente nel parenchima polmonare come quantificato misurando la fluorescenza relativa (analisi della varianza , confronti per ogni coppia di Student t-test, p <0.05, *** p <0,001).
Valutazione quantitativa fluospheres in tessuto polmonare e biodistribuzione alla gastro-intestinale
Successivamente, abbiamo voluto confrontare l'efficienza di mira il polmone fetale mouse dopo l'iniezione rispetto IT IA. A tale scopo, il 30 pl di fluospheres sono stati consegnati al polmone fetale del mouse dopo il trattamento individuale o di iniezione in IA E18 topi gravidi NMRI (n = 5 per gruppo). IT iniezione comportato una consegna significativamente maggiore di fluospheres al polmone fetale rispetto alla IA. percorso (1,43 ± 0,56 e 0,05 ± 0,02 fluorescenza relativa (rapporto tra fluospheres a Hoechst rispettivamente, analisi della varianza, Student t-test, *** p <0,001) (figure 4 ac). feti di controllo non trattate sono state utilizzate per la normalizzazione della fluorescenza sfondo segnale. Il tratto gastrointestinale è stato positivo sia per l'IT e gli animali iniettati IA (Figura 4 d). n fluorescenza rossa è stata osservata in altri tessuti da feti trattati o negli animali di controllo negativo (dati non mostrati).
Confronto tra iniezione intratracheale e intra-amniotico dopo rAAV2/6.2 consegna del gene mediato nel polmone fetale
Dopo aver confrontato i due metodi di consegna iniettando molecole fluorescenti, abbiamo voluto valutare l'efficienza di trasduzione virale e l'espressione del gene successivo dopo che l'iniezione e IA utilizzando vettori rAAV. rAAV2/6.2 codifica lucciola luciferasi (fluttuazioni) (3x10 10 GC / feto)sotto il controllo del pollo-β-actina (CBA) promotore è stato iniettato IT (n = 8) o IA (n = 6) in topi NMRI fetali a E18. Dopo il taglio cesareo e la promozione, sopravvivendo cuccioli sono stati seguiti da non invasiva di imaging bioluminescenza (BLI) e monitorati per attività Fluc (fotoni / secondo, p / s) a 1 settimana di età (Figura 5). Il flusso di fotoni totale per il gruppo IT era significativamente più alta di quella del gruppo IA e il controllo negativo (analisi della varianza, confronti per ogni coppia di Student t-test, * p <0,05). Il segnale medio BLI nel gruppo IA non era significativamente superiore rispetto a quella del gruppo di controllo negativo.
Distinzione tra una corretta e una errata iniezione fetale intratracheale
Distinzione tra una corretta e un incorrectI.T. iniezione può essere valutata a diversi livelli. Al punto momento dell'intervento, durante l'iniezione nella trachea fetale, nessuna resistenza sarà notato quando il needle viene posizionato nella trachea. Tuttavia, una resistenza maggiore sarà notato quando si inietta nello spazio paratracheale. Secondo, con taglio cesareo il feto è semi-trasparente, è possibile vedere i polmoni e successivamente la presenza di un colorante visibile (per esempio inchiostro cinese, molecole fluorescenti). Come ultima possibilità, per valutare una iniezione corretta è di imaging ottico e più in particolare di imaging bioluminescenza. BLI è un elegante sistema in modo non invasivo genica follow-up della luciferasi di lucciola gene reporter, ma la risoluzione spaziale e informazioni anatomiche sono limitate. La risonanza magnetica (MRI) offre alta risoluzione, immagini tomografiche contenenti dettagliate informazioni anatomiche. Quindi abbiamo studiato la combinazione di BLI con la risonanza magnetica per ottenere una immagine di sovrapposizione, che combina il segnale superficie BLI con una visualizzazione delle strutture anatomiche più profonde (organi interni). Il nostro obiettivo era quello di ottenere informazioni più dettagliate in vivo del localezione di espressione genica di essere in grado di distinguere un corretto da un errato IT iniezione.
Combinato BL-MR immagini sono state acquisite in diversi animali iniettati IT con rAAV2/6.2 CBA-Fluc e CBA-LacZnls (3x10 10 GC / feto per ogni vettore, n = 10) ad una settimana di vita (Figura 6). BL immagini rivelato un segnale proveniente dal collo e la regione toracica. Co-registrazione di MRI con espressione BLI trova gene della luciferasi nella regione polmonare dopo una iniezione corretta (Figura 6 a), ma nel collo e zona addominale dopo l'iniezione errata (Figura 6 b). L'analisi istologica di X-gal colorazione in vivo hanno confermato la co-registrazione.
La sopravvivenza dopo l'iniezione intratracheale e intra-amniotico
- Fluorospheres
La sopravvivenza alla consegna della E18 feti vecchi NMRI iniettato IT o IA con 30 microlitri 100 nm rosso FLUORESCENTEmolecole t era 100% in entrambi i gruppi ed è stato definito come il numero di feti iniettati vivi al momento del raccolto, 24 ore dopo la procedura chirurgica fetale (Tabella 1). - rAAV vettore
La sopravvivenza di consegna di feti iniettato IT IA o con rAAV2/6.2, che è definito come il numero di feti vivi al momento del punto cesareo 36h dopo l'iniezione fetale, era 85,3% e 86,3%, rispettivamente (Tabella 1). Il tasso di sopravvivenza neonatale precoce era 53,3% (IT) e 74,5% (IA), rispettivamente, ed è stata calcolata correlando il numero di cuccioli vivi 1 giorno dopo favorendo con il numero iniziale di feti iniettati. Per ottenere questi tassi di sopravvivenza finali, abbiamo ottimizzato la chirurgico perioperatorio protocollo procedura utilizzando (1) come anestesia inalatoria isoflurano anziché la somministrazione di una miscela di ketamina (75 mg / kg IP) e medetomidina (1 mg / kg IP) , (2) una piastra elettrica per prevenire l'ipotermia durante un intervento chirurgico, (3),un microscopio stereoscopico zoom e (4) gli operatori sempre più esperto con la procedura chirurgica.
Figura 1. Iniezione intratracheale in E18 topi fetali. In questa figura le fasi principali della procedura chirurgica per l'iniezione IT fetale sono raffigurati. In una prima fase un corno uterino viene esteriorizzato. In una fase successiva, una sutura stringa borsa viene fatta passare attraverso la parete uterina e delle membrane fetali (membrana amniotica e parietale sacco vitellino) oltre la zona dove poi sulla testa fetale sarà esposto tramite. Successivamente, la testa e il collo del feto sono esteriorizzato attraverso il isterotomia, dopo di che la testa fetale è mantenuto in iperestensione da un poliglattina 910 5-0 sutura su due pinze tra le ganasce. In microscopia stereoscopica zoom (ingrandimento x10) la trachea fetale viene visualizzato facendo un Incis collo verticaleionico usando dissezione tagliente e schietto. In un ultimo passo, un volume totale di 30 microlitri di sostanza viene iniettata nella trachea sotto visione diretta attraverso il microscopio stereoscopico zoom.
Figura 2. Panoramica generale dell'esperimento.
Figura 3. Determinazione del volume ottimale per l'iniezione intratracheale. Per determinare il volume ottimale per IT iniezione, 10, 20 o 30 microlitri (n = 3/volume) di fluospheres rosso graduato 100 nm sono stati somministrati in E18 feti vecchi e polmoni sono state raccolte 24 hr successivamente. Filamenti di actina e Nuclei sono stati colorati con Hoechst 33258 e Alexa Fluor 488 falloidina rispettivamente. La fluorescenza relativa (rapporto tra rosso per fluorescenza blu che rappresenta fluosphEres e la colorazione nucleare, rispettivamente) è stata quantificata utilizzando ImageJ software online. Media ± SD, analisi della varianza, confronti per ogni coppia di Student t-test, p <0.05, *** p <0,001.
Figura 4. Valutazione quantitativa del fluospheres nel tessuto polmonare e biodistribuzione al tratto gastro-intestinale. 30 pl di fluospheres rossi sono stati consegnati al polmone fetale del mouse dopo (a) IT o (b) iniezione IA E18 in femmine di topo gravide NMRI per confrontare l'efficienza di targeting polmone fetale topo. Feti di controllo non trattati sono stati utilizzati per la normalizzazione del segnale di fondo fluorescente. Filamenti di actina e Nuclei sono stati colorati con Hoechst 33258 e Alexa Fluor 488 falloidina, rispettivamente. (C) La fluorescenza relativa (rapporto tra rosso per fluorescenza blu che rappresenta fluospheres e la colorazione nucleare, rispettivamente) è stata quantificata utilizzando ImageJ software online. (d) Il tratto gastro-intestinale è stato positivo sia per l'IT e gli animali iniettati IA. Media ± SD, analisi della varianza, Student t-test, *** p <0,001. Clicca qui per ingrandire la figura .
Figura 5. Confronto tra iniezione intratracheale e intra-amniotico dopo rAAV2/6.2 consegna del gene mediato nel polmone fetale. Segnale BLI a 1 settimana dopo l'iniezione di rAAV2/6.2 (3 × 10 10 GC / feto CBA-Fluc) con corrispondente quantificazione del totale flusso di fotoni . Tutti gli animali sono stati sottoposti a scansione, separati da pareti nere, per evitare la dispersione di fotoni da animali vicini. La scala pseudocolore raffigura il flusso di fotoni al secondo, Per centimetro quadrato per steradiante (p / s / cm 2 / sr). Misurazioni sono state ottenute in un centimetro 4,3 2 regione rettangolare di interesse. Media ± SD, analisi della varianza, confronti per ogni coppia di Student t-test, * p <0,05. Figura adattata da Carlon et al., 2010. Ristampato con il permesso da Macmillan Publishers Ltd: [Terapia molecolare] (doi: 10.1038/mt.2010.153), diritto d'autore (2010). Clicca qui per ingrandire la figura .
Figura 6. Distinzione tra una corretta e una errata iniezione fetale intratracheale rAAV2/6.2 dopo la consegna del gene mediato nel polmone fetale. Combinato BL-MR immagini sono state acquisite su animali diversi iniettato IT con rAAV2/6.2 CBA-Fluc e CBA-LacZnls (3x10 10 GC / feto per ogni vector) dopo una settimana di età. BL immagini rivelato un segnale proveniente dal collo e la regione toracica. Co-registrazione di MRI con espressione BLI trova gene della luciferasi nella regione polmonare dopo una iniezione corretta (a), ma nel collo e zona addominale dopo l'iniezione errata (b). L'analisi istologica ha confermato in vivo co-registrazione. Barra di scala = 100 micron. Cifra adattato da Carlon et al., 2010. Clicca qui per ingrandire la figura .
| Iniezione sostanza | Metodo di iniezione | Sopravvivenza alla consegna di un | Tasso di sopravvivenza di promuovere b | Primo tasso di sopravvivenza neonatale c |
| fluospheres | IT | 100 (8/8) </ Td> | na | na |
| IA | 100 (5/5) | na | na | |
| rAAV2/6.2 | IT | 85,3 (64/75) | 62,5 | 53,3 (40/75) |
| IA | 86,3 (44/51) | 86,4 | 74,5 (38/51) |
Tabella 1. La sopravvivenza dopo l'iniezione intratracheale FETALE E intra-amniotico. Una sopravvivenza alla consegna, vale a dire dopo chirurgia fetale e al taglio cesareo, prima di promuovere. Pups b erano solo favorito se fossero rosa, muoversi e respirare normalmente. C Il tasso di sopravvivenza neonatale precoce si esprime in funzione del numero iniziale di cuccioli iniettati. Abbreviazioni: IT Intratracheale iniezione; IA intra-amniotico iniezione; na non applicabile.
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Discussion
Passaggi critici
- Il ceppo di topi che abbiamo scelto di lavorare con i topi è NMRI perché hanno un numero abbondante di cuccioli (dimensione della cucciolata media 14,4 ± 1,8, dati personali), tollerano bene gli interventi e hanno buone caratteristiche materne.
- Posizionare la stringa borsa attraverso la parete uterina e delle membrane fetali è un passaggio fondamentale, come si desidera solo esporre la testa fetale e non le spalle, altrimenti riposizionamento è quasi impossibile senza causare traumi.
- Una posizione ottimale della testa fetale è allungato all'indietro essenziale per effettuare l'incisione esattamente sopra la trachea in modo da evitare i grossi vasi sanguigni (vene giugulari) parallelo con la trachea.
- È importante seguire visivamente l'inserimento dell'ago nella trachea fetale al microscopio chirurgico per evitare iniezioni errati.
- Sostituzione della testa fetale nel sacco uterina senza causare traumi è fondamentale, come sivuole evitare di ferire la testa del feto, che aumenterebbe la mortalità intra-uterina o post-natale.
- La madre viene uccisa da dislocazione cervicale solo al punto di tempo di taglio cesareo, non con l'iniziale di CO 2 asfissia, in quanto ciò avrebbe un impatto negativo la vitalità dei feti.
- Cross-promozione porta a una sopravvivenza più elevato di feti trattati come naturale parto vaginale di feti azionati solo portato a un tasso di sopravvivenza del 18,6 ± 16,9% rispetto a 62 ± 14% per non iniettati cuccioli, nelle nostre mani.
Limitazioni
- Un fetale IT iniezione è più tempo per eseguire rispetto ad un'iniezione IA. In base all'esperienza del chirurgo, 2-4 feti per topo in stato di gravidanza può essere operato per evitare che i topi madre di essere anestetizzati per più di un'ora.
- Un volume di 30 microlitri è un massimo di iniettare nella trachea del mouse fetale. Anche se alcuni di dispersione può essere rilevato immediatamente dopo l'iniezione, il segnale fluorescente nel polmone è massima, dopo iniezione di 30 pl molecole fluorescenti come mostrato in figura 3.
- Il tasso di sopravvivenza finale dopo che l'iniezione è inferiore dopo l'iniezione di IA (53,3% e 74,5%), ma ciò è dovuto principalmente ad una perdita aumentata dopo cross-promozione. Il tasso di sopravvivenza prima indica che la procedura chirurgica del feto è ben tollerato per entrambi i percorsi di consegna (85,3% e 86,3%).
Eventuali modifiche e la risoluzione dei problemi
- Potrebbe essere possibile eseguire fetali IT iniezioni ad intervalli di tempo precedenti a E18. Esecuzione di chirurgia fetale a tempi precedenti potrebbe essere vantaggioso in quanto il sistema immunitario del feto potrebbe essere meno maturo, che promuove la tolleranza immunitaria nei confronti virali vettore, proteine terapeutiche, ecc Inoltre, l'espansione delle cellule staminali e progenitrici potrebbero essere più facilmente accessibili. Targeting queste cellule potrebbe dar luogopermanente per la correzione genetica. Tuttavia, l'esecuzione chirurgia fetale a tempi precedenti potrebbe aumentare il rischio di aberrazioni di sviluppo, che deve essere monitorato per.
- Post-operatorio di cuccioli che hanno subito l'iniezione IT come un feto, potrebbe essere ottimizzato ancora di più per ridurre le perdite di animali a causa di cannibalismo dopo la messa in un nido di Foster. Modifica del ceppo di topi della madre adottiva potrebbe aiutare. Abbiamo scelto NMRI per le loro buone qualità materne, ma altri ceppi di topi, come i topi svizzeri potrebbe svolgere ancora meglio per favorire scopi.
Le future applicazioni
- La nuova procedura chirurgica per indirizzare il polmone fetale mouse IT iniezione può essere utilizzato per la terapia genica di patologie monogeniche fetali letali come la fibrosi cistica, la carenza di tensioattivo e α-1-antitripsina. La terapia prenatale sarebbe utile in questi casi, perché il trattamento è iniziatoprima dell'insorgenza della malattia e può prevenire danni irreversibili. Inoltre, se le cellule staminali o progenitrici possono essere mirati, una correzione permanente potrebbe teoricamente essere ottenuta, in quanto queste cellule potrebbe fornire costantemente progenie esprimere la proteina difetto.
- Oltre a malattie genetiche che richiedono una correzione permanente, interventi fetali a favore di un effetto transitorio terapeutico potrebbe essere utile per studiare le possibili opzioni di trattamento per prematurità quando i polmoni sottosviluppati richiedono l'espressione genica temporanea di tensioattivo, VEGF (per la maturazione polmonare e neo-vascolarizzazione), o anti-ossidanti proteine ad esempio superossido dismutasi.
- Questa procedura può inoltre essere usati per fornire composti o tossine in utero per la generazione di modelli di malattia. Per esempio, il trattamento lipopolisaccaride, imitando infezione intrauterina, può essere somministrato in utero ad interferire con lo sviluppo fetale polmone, portando ad una diminuzione posfunzione polmonare tnatal dovuto alla persistente infiammazione cronica e anomalie strutturali 19.
Significatività della tecnica rispetto ai metodi esistenti
- Causa il targeting specifico delle vie aeree fetale, una maggiore efficienza di trasduzione delle vie aeree e alveoli può essere ottenuta dopo iniezione di vettori virali, rispetto al metodo di iniezione IA esistente. Quando titoli vettori virali sono limitanti (ad esempio con vettori lentivirali), IT iniezione impedirà diluizione del vettore iniettato nel liquido amniotico per massimizzare la quantità di particelle vettore nei polmoni.
- Evitando diluizione dopo la consegna fetale è anche vantaggioso per altri agenti bioattivi come proteina ricombinante o cellule staminali come costi possono essere ridotti a causa della minore quantità di sostanza bioattiva necessario per IT iniezione rispetto alla IA iniezione.
- Fetale IT injection è indipendente dai movimenti respiratori fetali, che iniziano a verificarsi in E14, ma sono variabili tra i singoli animali 20. Ciò dà luogo a un sacco di variazione captazione tra i feti IA iniettato, che può essere ridotto IT iniezione.
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Disclosures
Nessun conflitto di interessi dichiarati.
Acknowledgments
MC e avdp dottorandi sono supportati da finanziamenti dell'Istituto per la promozione dell'innovazione attraverso la scienza e la tecnologia nelle Fiandre (IWT-Vlaanderen). JT ha una part-time Clinical Research Fellowship (KOOR) da UZ Leuven. DV è un collega di dottorato sostenuto da una borsa di KU Leuven, DBOF/10/062. MMDC è un collega di dottorato sostenuto da una borsa di studio Conselho Nacional de Pesquisa e Desenvolvimento (CNPq) ed Erasmus Mundus. La ricerca è stata finanziata da IWT-Vlaanderen, tramite la concessione CE DIMI (LSHB-CT-2005-512146) e dal vivo in Molecular Imaging Research Group (IMIR) dalla KU Leuven. Vorremmo riconoscere il Nucleo UPenn Vector fondata da James M. Wilson per la loro gentile dono della confezione AAV6.2 plasmide per la produzione di vettori rAAV.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| NMRI mice | Janvier, Le Genest St Isle, France | ||
| Isoflurane | Isoba, Intervet / Schering-Plough Animal Health, Milton Keynes, UK | ||
| Prolene 6-0 | Ethicon, Groot Bijgaarden, Belgium | ||
| Vicryl 5-0 | Ethicon, Groot Bijgaarden, Belgium | ||
| 50 μl Hamilton Glass Syringe, Model 1710.5 TLLX SYR | Hamilton, Reno, NV, USA | 5495-20 | |
| 30G sharp needle | Hamilton, Reno, NV, USA | 7762-03 | |
| 2% xylocaine | AstraZeneca, Zoetermeer, The Netherlands |
References
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