Summary
Wij ontwikkelden een software platform dat Imaris Neuroscience, ImarisXT en MATLAB om de veranderingen in morfologie van een ongedefinieerde vorm uit driedimensionale confocale fluorescentie van afzonderlijke cellen te meten gebruikt. Deze nieuwe benadering kan worden gebruikt om veranderingen in celvorm na receptor activatie kwantificeren en dus een mogelijke extra hulpmiddel voor drug discovery.
Abstract
De meest voorkomende software-analyse tools beschikbaar voor het meten van fluorescentie beelden zijn voor twee-dimensionale (2D) gegevens die afhankelijk zijn van handmatige instellingen voor in-en uitsluiting van datapunten, en computer-aided patroonherkenning om de interpretatie en bevindingen van de analyse te ondersteunen. Het is steeds belangrijker kunnen fluorescentiebeelden opgebouwd uit driedimensionale (3D) datasets meten om te kunnen de complexiteit van cellulaire dynamiek vangen en de basis van cellulaire plasticiteit in biologische systemen begrijpen. Geavanceerde microscopie instrumenten toegestaan de visualisatie van 3D-fluorescentie beelden door de overname van multispectrale fluorescentie beelden en krachtige analytische software die de beelden reconstrueert van confocale stapels die vervolgens zorgen voor een 3D-weergave van de verzamelde 2D-beelden. Geavanceerd ontwerp op basis van stereologie methoden zijn gevorderd van de harmonisatie en veronderstellingen van de oorsprongl modelmatige stereologie 1 zelfs in complexe weefselcoupes 2. Ondanks deze wetenschappelijke vooruitgang in microscopie, een behoefte bestaan aan een geautomatiseerde analytische methode die volledig gebruik van de intrinsieke 3D data, teneinde de analyse en kwantificering van de complexe veranderingen in celmorfologie, eiwit lokalisatie en receptor handel.
Huidige technieken om fluorescentie te kwantificeren beelden omvatten Meta-Morph (Molecular Devices, Sunnyvale, CA) en Image J (NIH) die handmatige analyse. Imaris (Andor Technology, Belfast, Noord-Ierland)-software biedt de functie MeasurementPro, waarin het handboek creëren van meetpunten die kunnen worden geplaatst in een volume afbeelding of getekend op een reeks van 2D plakken tot een 3D-object te maken mogelijk maakt. Deze methode is bruikbaar voor een klik puntmetingen een lijn tussen twee objecten meten of een veelhoek die een van belang omvat maken, maar het is moeilijk toepasbaar op complex mobiele netwerk structuren. Filament Tracer (Andor) maakt automatische detectie van de 3D neuronale filamentachtig echter deze module is ontwikkeld om gedefinieerde structuren zoals neuronen, die bestaan uit dendrieten, axonen en stekels (boomstructuur) te meten. Deze module ingenieuze is gebruikt om morfologische metingen niet-neuronale cellen 3 te maken, maar de uitvoergegevens informatie van een uitgebreid cellulaire netwerk via een software afhankelijk is van een bepaalde celvorm plaats van een amorfe vorm van cellulaire model. Om het probleem van het analyseren van amorf-vormige cellen en het maken van de software meer geschikt is om een biologische toepassing te overwinnen, Imaris ontwikkeld Imaris Cell. Dit een wetenschappelijke project de Eidgenössische Technische Hochschule, die is ontwikkeld om de relatie tussen cellen en organellen berekenen. Terwijl de software kan de detectie van biologische beperkingen Het dwingt een kern per celen met celmembranen segment cellen kan niet worden gebruikt om fluorescentie gegevens zijn niet permanent omdat idealiter gebaseerd celoppervlak zonder lege ruimten analyseren. Voor zover ons bekend, op dit moment geen door de gebruiker aanpasbaar geautomatiseerde aanpak die morfometrische informatie geeft van 3D fluorescentie beelden ontwikkeld die zorgt voor cellulaire ruimtelijke informatie van een ongedefinieerde vorm (figuur 1).
We hebben een analytische platform met behulp van de Imaris kern software module en Imaris XT gekoppeld aan MATLAB (Mat Works, Inc.) Deze hulpmiddelen kunnen de 3D meting van cellen zonder een vooraf gedefinieerde vorm en inconsistente fluorescentie netwerkcomponenten. Bovendien zal deze methode kunnen de onderzoekers die kennis uitgebreid in biologische systemen, maar niet vertrouwd zijn met computer-toepassingen, voor kwantificering van morfologische veranderingen uit te voeren in cel dynamiek.
Protocol
1. Drie-dimensionale Morfometrische Analyse van de Single-cell fenotypische veranderingen
- Humane embryonale nier (HEK293) cellen werden getransfecteerd met hemagglutinine (HA)-gelabeld corticotropine releasing factor receptor-2 (CRF-R2), een G-eiwit-gekoppelde receptor (GPCR) zoals eerder beschreven 4, 5.
- De cellen werden onbehandeld gelaten (geen behandeling, NT), gestimuleerd met de CRF-R2 endogene ligand, corticotropine afgevende factor, CRF (1 uM, 30 min), of voorbehandeld met een selectieve CRF-R2 antagonist, anti-Sauvagine 30 (AS -30, 1 uM, 30 min) voor agonisten.
- De cellen werden vervolgens gefixeerd, gepermeabiliseerd en behandeld met anti-HA. CRF-R2 werd gevisualiseerd met Alexa 594 nm conjugaat anti-muis (IgG 1) antilichaam. DAPI werd gebruikt om de kernen mitotische fase visualiseren.
- Om de experimentator subjectiviteit te beperken, werden de experimentele omstandigheden pas bekend nadat de beelden werden verkregen en geanalyseerd.
- We verkregen beelds van vaste HEK293 cellen met behulp van een Plan-apochromat 63x/1.4 olie DIC objectieve en Zeiss LSM 510 META confocale microscoop aangesloten op een coherente geïntegreerde twee-foton laser-systeem bestaat uit een Verdi-V5 laser en een Mira 900-F lasersysteem.
- Tijdens het data acquisitieproces werden de cellen gecompartimenteerd zowel multispectrale snijden, 488 nm en 790 nm (~ 350 nm 2PH Ex.) En z afscherming (0,5 urn stappen) om gegevens van het nucleaire membraan aan het buitenste extracellulaire receptor omvat extremiteiten.
- De fluorescentie gegevens werden eerst verwerkt volgens Imaris, die de visualisatie en segmentatie van 3D-microscopie dataset maakt, en een 3D-model bestaat uit kubieke voxels is gemaakt voor morfometrische analyse.
Vervolgens werd Imaris XT module gebruikt om te communiceren Imaris met MATLAB computerprogramma taal naar de plek coördinaten van de GPCR extensies bepalen.
Om rekening te houden met cellulaire variabiliteit, kregen we en geanalyseerd fluorescentie beelden taken van 22 cellen: geen behandeling (NT) (n = 7), agonist (CRF) behandeling (n = 8) en voorbehandeling met antagonist (AS-30) vóór agonist behandeling (n = 7) (figuur 2) .- Het gebied van belang (ROI) die van een cel die niet in actieve mitotische fase en niet dicht bij andere cellen. Op deze wijze zal de analyse omvatten cellen met slechts een kern en de receptor extensies worden niet verstoord door de nabijheid van andere cellen.
- De cellulaire 3D-structuur werd voor het eerst gereconstrueerd uit multispectrale fluorescentie gegevens met behulp van Imaris (v.7.1.1).
- Na het algoritme door Imaris, werd eerst de Surface rendering gebruikt om de kernmembraan vertegenwoordigen. Imaris zal bepalen of er meer dan een kern in de ROI.
- Dan de spots aanmaken algoritme werd gebruikt om de CRF-R2 extensie vinden. Spots detectie werd gebruikt omdat het compenseert achtergrondgeluiden en onregelmatige intensiteit van decomplex netwerk van amorf-vormige cellen.
- De opneming van elke eenheid van fluorescentiedetectie van CRF-R2 maximaliseren, werd de spots 'diameter op 0,2 urn, die de kleinste eenheid van het beeld om afzonderlijke af te leiden in de vorm van een gemeten intensiteit met een Gaussiaanse filter. Spot filtering werd opgenomen in de vlekken geautomatiseerde creatie proces. De software echter geeft de gebruiker de flexibiliteit om filters te gebruiken om de parameters te bepalen.
- Om gegevens truncatie te voorkomen, werd de dataset omgezet van 8-bit (unsigned) vast punt, met 32-bits decimaal.
- De voxel-intensiteiten gegevens werden uitgewisseld om de coördinaten gegevens met behulp van Imaris XT module gekoppeld met MATLAB en de exacte ruimtelijke locatie van elke plaats werd bepaald door het uitvoeren van een afstand transformatie met behulp van de kernmembraan als referentiepunt (figuur 3) te spotten.
- De resulterende gegevens kunnen worden gekwantificeerd en op grafische wijze weergegeven voor statistical analyse. Vergelijkingen tussen groepen werden uitgevoerd met behulp van twee-weg ANOVA en Bonferroni nameting. Gegevens worden gepresenteerd als gemiddelde ± SD. Verschillen significant beschouwd bij p <0,05. Berekeningen werden gemaakt met GraphPad Prism 5.02 (Figuur 4).
2. Representatieve resultaten
Om de kracht van onze aanpak demonstreren we gekwantificeerd de cellulaire veranderingen die het gevolg zijn van de interactie van G-proteïne gekoppelde receptoren (GPCRs) en corticotropine releasing factor receptor-2 (CRF-R2) met endogene ligand CRF in getransfecteerde HEK293 cellen.
We zien dat CRF-R2 receptoren zich bevinden in het plasmamembraan en project uit eindige gebieden van het membraan van de cellen (figuur 2A en Movie 1). Met conventionele 2D analyse is het mogelijk om deze subset extracellulaire CRF-R2 receptoren detecteren indien we analyseren receptor hechting points op het glas omvat. Dientengevolge verliezen we andere informatie uit z-gestapelde multispectrale data (Figuur 5).
Wanneer de cellen behandeld met CRF, zijn de extracellulaire receptoren sterk verminderd, zoals blijkt uit de afname in afstand tussen de spots van de plasmamembraan. Ze zijn ook gedistribueerd van hoofdzakelijk eindige bestemmingen in een aantal discrete plaatsen (Figuur 2B en Film 2).
Het effect van CRF op de receptor membraan distributie wordt voorkomen door voorbehandeling met de CRF-R2 specifieke antagonist, antisavagine 30 (AS-30) en we vinden dat de CRF-R2 extensies niet veranderen (figuur 2C en Movie 3).
De distale verdeling van vlekken, uitgezet in de 5 um-spectrum kleurcode tussenpozen wordt gebruikt om de afstand van de voxels van het kernmembraan visualiseren. Geen behandeling en antagonist pretreatment (AS-30, 1 uM, 30 min) voor agonisten (CRF, 1 uM, 30 min) vertonen geen significant (ns) verschil in krimp GPCR. Behandeling van de cellen met de agonist (CRF, 1 uM, 30 min) vermindert geleidelijk het aantal CRF-R2-bevattende voxels in vergelijking met geen behandeling, 0-5 um (ns), 6-15 micrometer (** p < 0,01) en> 15 pm (*** p <0,005), of ten opzichte van AS-30 behandeling, 0-10 urn (ns), 11-15 urn (** p <0,01) en> 15 pm (*** p <0,005) (figuur 4).
Figuur 1. Schema van de huidige beschikbare technieken en hun beperking tot fluorescentie beelden te analyseren. Klik hier om een grotere afbeelding te bekijken .
Figuur 3. 3D model van HEK293 getransfecteerde cellen met HA-CRF-R2 gereconstrueerd CLS afbeeldingen met Imaris software. Oppervlakte weergave van de kern en vlekken maken het beschrijven van GPCR extensies omgezet in kleine blaasjes. De fluorescentie gegevens werden eerst verwerkt volgens Imaris die de visualisatie en segmentatie van 3D-microscopie dataset maakt. Vervolgens werd Imaris XT gebruikt om te communiceren met Imaris MATLAB. De voxel-intensiteiten omgewisseld inspot coördineert. De vlekken spectrum-gecodeerde kleur (blauw 0 tot 5 micrometer, groen, 6-10 um, geel 11 tot 15 micrometer en rood> 15 pm) vertegenwoordigen de afstand vormen de kernmembraan. Schalen 5 micrometer.
Figuur 4. Grafische voorstelling van de verdeling van distale spots uitgezet in de spectrum-kleurcode in 5 urn intervallen wordt gebruikt om de afstand van de voxels van het kernmembraan visualiseren. Geen behandeling en voorbehandeling met een antagonist (AS-30, 1 uM, 30 min) voor agonisten (CRF, 1 uM, 30 min) vertonen geen significant (ns) verschil in krimp GPCR. Behandeling van de cellen met agonist (CRF, 1 uM, 30 min) vermindert geleidelijk de afstand van het aantal CRF-R2-bevattende voxels in vergelijking met geen behandeling 0-5 urn (ns), 6-15 micrometer (p ** <0,01) en> 15 pm (*** p <0,005), of AS-30 behandeling 0-10 urn (ns), 11-15 urn (** p <0,01) en> 15 pm (*** p <0,005).
Figuur 5. Beperking van de 2D morfometrische analyse van HEK 293 cellen getransfecteerd met HA-CRF-R2. Het middenvlak gedeelte van cellen (3-4μm boven de glazen dekglaasje) dat het midden van de kernen gevisualiseerd met DAPI en HA-CRF-R2 gesondeerd met anti-HA en gevisualiseerd met Alexa 488 nm geconjugeerd anti-muis (IgG 1) secundair antilichaam en opgedaan met CLS toont geen verschil tussen (A) geen behandeling (NT) en (B) agonist (CRF, 1 uM, 30 min), terwijl de receptor hechtpunten zijn dramatisch anders.
Film 1. Vrijdraaiend 3D model in de "overtreffen" mode van HEK 293 cellen getransfecteerd met HA-CRF-R2, geen behandeling, cellulair fenotype verschillen tussen receptoreiwitten evalueren. Schaal bar van 5 tot 20 pm./ Files/ftp_upload/4233/4233movie1.avi "target =" _blank "> Klik hier om film te bekijken.
Movie 2. Vrijdraaiend 3D model in de "overtreffen" mode van HEK 293 cellen getransfecteerd met HA-CRF-R2, agonist behandeling, CRF (CRF, 1 uM, 30 min) beoordelen cellulair fenotype verschillen tussen receptoreiwitten. Scale bar van 5 tot 20 pm. Klik hier om film te bekijken.
Film 3. Vrijdraaiend 3D in de "overtreffen" mode van HEK 293 cellen getransfecteerd met HA-CRF-R2, voorbehandeling met een antagonist (AS-30, 1 uM, 30 min) voor agonisten (CRF, 1 uM, 30 min ) om cellulaire fenotype verschillen tussen receptoreiwitten evalueren. Scale bar van 5 tot 20 pm. Klik hier om film te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
We toonden aan dat CRF behandeling een significante verandering in de morfologie en de locatie van CRF-R2 geïnduceerd. De verandering in CRF-R2 werd geremd door selectieve antagonisten. We toonden aan dat receptor wijzigingen niet werden gedetecteerd en kan worden gemeten met de standaard 2D multispectrale technieken. De mogelijkheid om complexe 3D beelden bestuderen is kritisch voor de complexiteit van biologische parameters bevatten voor morfometrische analyse. We waren in staat om 3D-metingen van cellen te maken zonder een vooraf gedefinieerde vorm met inconsistente fluorescentie netwerkcomponenten. Onze suite van door de gebruiker aanpasbare automatische methoden maakt het mogelijk om moleculaire dynamica te kwantificeren in individuele amorfe vorm van cellen in hun omgeving om informatie over celdynamiek halen. Dit hulpmiddel kan helpen om voorspellingen over de effecten van een farmacologische verbinding op cellulaire responsen en cellulaire morfologie verandering in de aanwezigheid van remmers maken en informatie over celoverleving verschaffen.
Het voordeel van onze 3D kwantificering methode is dat het onderzoekers mogelijk maakt met grote deskundigheid in biologie mechanismen, maar niet vertrouwd met computer codes, de interface microscopische technieken met computertoepassingen. We hebben eencellige metingen om informatie die een populatie van cellen 6 weerspiegelt onthullen. Single-cell meting geeft ons een analyse van een complex gevormde cel verstoord door de nabijheid met andere cellen. Deze methode zal helpen wetenschappers in onderzoek veranderingen in celvorm en de plaats van membraangebonden eiwitten na chemische stimualtion 7, 8. De analyse van een cel gegevens omvatten de cellulaire kern compartimenten zijn extracellulaire uiteinden. De maximale data opgenomen dat kan worden verkregen uit een 2D-beeld is in het middenvlak van een cel, maar de kern en de buitenste plaats van het plasmamembraan gepositioneerd op verschillende z-vlakken; 2D visualisatie kort debeeld. Als kern ligt tussen 3 en 4 urn boven de cellulaire adhesie punten die zich op de glazen dekglaasje wordt een uitgebreide hoeveelheid data verloren. Deze receptor ruimtelijke reorganisatie alleen te zien in 3D beelden en kan niet worden gekwantificeerd zonder analyse. Deze tool biedt een nieuwe benadering voor het visualiseren en meten cellulaire veranderingen die niet worden gedetecteerd met behulp van traditionele 2D analytische technieken, het verstrekken van informatie die het cellulaire systeem als geheel in plaats van versnipperd door 2D-gegevens behandelt. Deze meetmethode op enkelvoudige cellen samen met andere beschreven technologieën 9, kunnen we onderzoeken de complexiteit van cellulaire dynamiek en de basis van cellulaire plasticiteit.
Deze methode is niet beperkt tot Imaris en kan worden toegepast op elke data visualisatie software interface met computers taal-software. Toekomstige verbeteringen in het systeem omvat morfometrische analyse van 3D cellen uit levendecellen om het onderzoek van de gehele cel in zijn natuurlijke staat, zonder chemische fixatie of chemische aanslag mogelijk te maken. Verwerven van beelden van levende cellen maakt tevens een einde intercellulaire variabiliteit, aangezien we fenotypische metingen kwantificeren in dezelfde cel tijd.
Wij geloven dat ons platform technologie, met het potentieel om structuren van onbepaalde vorm-cellen te meten, zal helpen andere wetenschappers om een gat in kwantificering beeldvormende technieken te vullen. Deze nieuwe benadering geldt voor de karakterisering van talrijke cel fenotypische veranderingen, waardoor deze cellen gebaseerde assay, zoals andere eencellige profilering 10 is een extra instrument voor drug discovery proces. Aangezien celmorfologie reeds gebruikt in high-throughput screening voor het identificeren van kleinmoleculige remmers 11, aangezien dit platform ontwikkelt, verwachten we deze methode bruikbaar voor het bepalen van een dosis-respons curve van enkelvoudige cellen die dezelfde farmacologische beïnvloedencal doel, maar met verschillende werkingsmechanismen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Geen belangenconflicten verklaard.
Acknowledgments
Wij danken de Biologische Imaging Development Center (BIDC) University of California, San Francisco voor het gebruik van de Imaris, Imaris XT en Matlab. Wij danken V. Kharazia voor de technische bijstand en AT Henry, LK Floren, L. Daitch voor hun bijdragen aan de redactie van het manuscript. Dit werk werd ondersteund door financiering van de staat Californië Medical Research on Alcohol & Substance Abuse door UCSF aan SEB, de National Institutes of Health: 1R21DA029966-01 en NIH Fast Track gunning aan de MLSMR collectie screenen aan SEB, UCSF School of Pharmacy ( Decanaat en Klinische Farmacie) en de School of Medicine (Klinische Farmacologie & Experimental Therapeutics) naar CLHK.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Human Embryonic Kidney (HEK293) | American Type Culture Collection | CRL-1573 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Invitrogen | 11965118 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Invitrogen | SH30070.03 | |
| AlexaFluor-488 (IgG2b) | Invitrogen | A-11001 | |
| monoclonal anti-HA.11 (IgG1) | Covance | 16B12 | |
| DAPI | Vector Laboratories | H-1200 | |
| CRF | Sigma | C2917 | |
| Antisauvagine-30 (AS-30) | Sigma | A4727 |
References
- West, M. J. Design-based stereological methods for counting neurons. Prog, Brain Res. 135, 43-51 (2002).
- Burke, M., Zangenehpour, S., Mouton, P. R., Ptito, M. Knowing what counts: unbiased stereology in the non-human primate brain. J. Vis. Exp. (27), e1262 (2009).
- Sugawara, Y., Ando, R., Kamioka, H., Ishihara, Y., Honjo, T., Kawanabe, N., Kurosaka, H., Takano-Yamamoto, T., Yamashiro, T. The three-dimensional morphometry and cell-cell communication of the osteocyte network in chick and mouse embryonic calvaria. Calcif. Tissue Int. 88, 416-424 (2011).
- Vickery, R. G., von Zastrow, M. Distinct dynamin-dependent and -independent mechanisms target structurally homologous dopamine receptors to different endocytic membranes. J. Cell Biol. 144, 31-43 (1999).
- Bartlett, S. E., Enquist, J., Hopf, F. W., Lee, J. H., Gladher, F., Kharazia, V., Waldhoer, M., Mailliard, W. S., Armstrong, R., Bonci, A. Dopamine responsiveness is regulated by targeted sorting of D2 receptors. Pro.c Natl. Acad. Sci. U.S.A. 102, 11521-11526 (2005).
- Gordon, A., Colman-Lerner, A., Chin, T. E., Benjamin, K. R., Yu, R. C., Brent, R. Single-cell quantification of molecules and rates using open-source microscope-based cytometry. Nat. Methods. 4, 175-181 (2007).
- Schock, F., Perrimon, N. Molecular mechanisms of epithelial morphogenesis. Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 18, 463-493 (2002).
- Pincus, Z., Theriot, J. A. Comparison of quantitative methods for cell-shape analysis. J. Microsc. 227, 140-156 (2007).
- Spiller, D. G., Wood, C. D., Rand, D. A., White, M. R. Measurement of single-cell dynamics. Nature. 465, 736-745 (2010).
- Loo, L. H., Wu, L. F., Altschuler, S. J. Image-based multivariate profiling of drug responses from single cells. Nat Methods. 4, 445-453 (2007).
- Yarrow, J. C., Totsukawa, G., Charras, G. T., Mitchison, T. J. Screening for cell migration inhibitors via automated microscopy reveals a Rho-kinase inhibitor. Chem. Biol. 12, 385-395 (2005).
