Summary
Мы разработали программную платформу, которая использует Imaris Neuroscience, ImarisXT и MATLAB для измерения изменений в морфологии неопределенная форма взята из трехмерного конфокальной флуоресцентной отдельных клеток. Этот новый подход может быть использован для количественной оценки изменений формы клеток после активации рецепторов и, следовательно, представляет собой возможный дополнительный инструмент для обнаружения наркотиков.
Protocol
1. Трехмерная морфометрического анализа одной ячейке фенотипические изменения
- Эмбриональной почки человека (HEK293) клетки трансфицировали гемагглютинина (HA)-отмеченном кортикотропин рилизинг-фактор рецептора-2 (CRF-R2), G-белком рецептор (GPCR), как описано ранее 4, 5.
- Клетки лечить (без лечения, NT), стимулировали CRF-R2 эндогенных лигандов, кортикотропин рилизинг-фактор, CRF (1 мкМ, 30 мин), или предварительно с селективным CRF-R2 антагониста, анти-саувагин 30 (AS -30, 1 мкМ, 30 мин) до агонистов.
- Затем клетки фиксированы, проницаемость и обрабатывали анти-HA. CRF-R2 были визуализированы с помощью Alexa 594 нм сопряженных анти-мышиных (IgG 1) антител. DAPI был использован для визуализации сцены ядер митотической.
- Чтобы ограничить экспериментатор субъективности, условия эксперимента не были известны только после Изображения были получены и проанализированы.
- Мы приобрели изображенияа с фиксированной НЕК293 помощью план-апохромат 63x/1.4 масла ДВС объективных и Zeiss LSM 510 META конфокальной микроскопии связан с когерентной интегрированной двухфотонной лазерной системы, состоящей из Верди-V5 лазерных и Мира, 900-F лазерной системы.
- В процессе сбора данных, клетки были разграничены как по мультиспектральных срезов, 488 нм и 790 нм (~ 350 нм 2ph Ex.), Г-разбиения (0,5 мкм шагом), чтобы включить данные из ядерной мембраны к внешнему внеклеточных рецепторов конечностях.
- Флуоресценции данные впервые были обработаны с помощью Imaris, которая позволяет визуализировать и сегментации 3D наборов данных микроскопии и 3D-модели состоят из кубического вокселей был создан для морфометрического анализа.
Тогда, Imaris XT модуль был использован для интерфейса Imaris с MATLAB язык компьютерную программу для определения координат места GPCR расширения.
Для того чтобы учесть сотовой изменчивости, мы получили и проанализировали флуоресцентных изображений Takан из 22 клеток: отсутствие лечения (NT) (п = 7), агонистов (CRF) лечение (n = 8) и предварительной обработки с антагонистом (AS-30) до агонистов (п = 7) (рис. 2) .- Область интереса (ROI) должна включать в себя одну ячейку, которая не находится в активной стадии митотического и не близко к другим клеткам. Таким образом, анализ будет включать в себя клетки с одним ядром и рецепторов расширения не возмущенной близости от других клеток.
- Ячеистая структура 3D впервые был реконструирован из мультиспектральных флуоресценции данных с использованием Imaris (v.7.1.1).
- Следуя алгоритму разработана Imaris, в первую поверхность рендеринга была использована для представления ядерной мембраны. Imaris будет определить, есть ли более одного ядра в ROI.
- Тогда пятна создания алгоритма была использована, чтобы найти CRF-R2 расширения. Места обнаружения была использована, поскольку она компенсирует фоновый шум и нерегулярные интенсивностисложная сеть аморфной формы клеток.
- Для максимального включения каждого блока флуоресценции обнаружения CRF-R2, диаметр пятна "был установлен до 0,2 мкм, что является наименьшей единицей в пределах изображения для различных экстраполировать информацию в форме измеряются интенсивности с использованием фильтра Гаусса. Пятно фильтрация была включена в местах автоматизированный процесс создания. Программное обеспечение, однако, дает пользователю возможность использовать фильтры, чтобы определить параметры.
- Чтобы избежать усечения данных, набор данных был преобразован из 8-битных (без знака) неподвижная точка, в 32-разрядные десятичные.
- Воксела данных интенсивности были обменены определить координаты данных с использованием Imaris XT модуля сопряжена с MATLAB и точное пространственное расположение каждого места была определена путем проведения расстояние преобразование с использованием ядерной мембраны в качестве точки отсчета (рис. 3).
- Полученные данные могут быть определены и представлены в графическом формате сТАТИСТИЧЕСКИЕ анализа. Сравнения между группами проводили с использованием двустороннего ANOVA и Bonferroni посттестовых. Данные представлены как среднее значение ± SD. Различия являются значительными в * р <0,05. Расчеты были сделаны с GraphPad Prism 5.02 (рис. 4).
2. Представитель Результаты
Чтобы продемонстрировать силу нашего подхода, мы количественно клеточные изменения, которые возникают в результате взаимодействия G-белком рецепторы (GPCRs) и кортикотропин рилизинг-фактор рецептора-2 (CRF-R2) с эндогенным лигандом CRF в трансфицированных НЕК293.
Мы показываем, что CRF-R2 рецепторы расположены в мембране плазмы и проект из конечных областей мембраны клетки (рис. 2A и кино 1). Использование обычных 2D анализ, можно обнаружить это подмножество внеклеточной CRF-R2 рецепторы только тогда, когда мы анализируем рецепторы адгезии роИнтс на стекло крышки. Следовательно, мы теряем любую другую информацию, полученную от г-уложены мультиспектральных данных (рис. 5).
Когда клетки обрабатывают с ХПН, внеклеточный рецепторов значительно снижается, как показано уменьшение расстояния пятна от плазматической мембраны. Они также перераспределяется преимущественно из конечных местах в ряде отдельных местах (2B рисунок и кино 2).
Эффект CRF на рецепторы мембраны распределения препятствует предварительной обработки с CRF-R2 специфического антагониста, antisavagine 30 (AS-30), и мы обнаружили, что CRF-R2 расширения не изменится (рис. 2C и кино 3).
Дистального распределения пятен, построенная в 5 мкм спектра цветом интервалов, используется для визуализации расстояния вокселей от ядерной мембраны. Никакого лечения и антагониста pretreatmЛОР (AS-30, 1 мкМ, 30 мин) до агонистов (CRF, 1 мкМ, 30 мин) не показывают значительное (нс) разница в GPCR сокращения. Лечение клеток с агонистом (CRF, 1 мкМ, 30 мин) постепенно уменьшается количество CRF-R2-содержащих вокселов по сравнению с отсутствием лечения, 0-5 мкм (нс), 6-15 мкм (** р < 0,01) и> 15 мкм (*** р <0,005), или по сравнению с AS-30 лечения, 0-10 мкм (нс), 11-15 мкм (** р <0,01) и> 15 мкм (*** р <0,005) (рис. 4).
Рисунок 1. Схема имеющихся в настоящее время методов и их ограничений для анализа флуоресцентных изображений. Нажмите, чтобы увеличить показатель .
Рисунок 3. 3D-модель HEK293 трансфицированных клеток с HA-CRF-R2 восстанавливается CLS изображения с помощью Imaris программного обеспечения. Поверхность оказания ядра и места создания описания GPCR расширения превращается в мелкие пузырьки. Флуоресценции данные впервые были обработаны с помощью Imaris которая позволяет визуализировать и сегментации 3D набор данных микроскопии. Тогда, Imaris XT был использован для интерфейса Imaris с MATLAB. Воксела интенсивности были обменены наКоординаты места. Пятна спектр кодированием цвета (синий 0-5 мкм, зеленый, 6-10 мкм, желтый 11-15 мкм и красный> 15 мкм) представляют собой дистанционную форму ядерной мембраны. Масштаб 5 мкм.
Рисунок 4. Графическое представление дистального распределения пятен построены в спектре цветов кодируется в 5 мкм интервалов используется для визуализации расстояния вокселей от ядерной мембраны. Никакого лечения и предварительной обработки с антагонистом (AS-30, 1 мкМ, 30 мин) до агонистов (CRF, 1 мкМ, 30 мин) не показывают значительное (нс) разница в GPCR сокращения. Лечение клеток с агонистом (CRF, 1 мкМ, 30 мин) постепенно сокращает расстояние число CRF-R2-содержащих вокселов по сравнению с отсутствием лечения 0-5 мкм (нс), 6-15 мкм (** р <0,01) и> 15 мкм (*** р <0,005), или AS-30 лечения 0-10 мкм (нс), 11-15 мкм (** р <0,01) и> 15 мкм (*** р <0,005).
Рисунок 5. Ограничение 2D морфометрического анализа НЕК 293 трансфицированных клеток с HA-CRF-R2. В середине плоского сечения клеток (3-4 мкм над стеклом покровное), показывающий центре ядра визуализируются с DAPI и HA-CRF-R2 исследовали с использованием анти-HA и визуализированы с помощью Alexa 488nm сопряженных анти-мышь (IgG 1) вторичный антитело и полученные с CLS показывает никакой разницы между (A) без лечения (NT) и (B) агонисты (CRF, 1 мкМ, 30 мин), а точки рецепторов адгезии значительно отличаются.
Фильм 1. Свободно вращающаяся 3D-модель в "превзойти" режим НЕК 293 трансфицированных клеток с HA-CRF-R2, никакого лечения, для оценки сотовой различия между фенотипом рецепторных белков. Шкала бар от 5 до 20 мкм./ Files/ftp_upload/4233/4233movie1.avi "целевых =" _blank "> Щелкните здесь для просмотра фильмов.
Фильм 2. Свободно вращающаяся 3D-модель в "превзойти" режим НЕК 293 трансфицированных клеток с HA-CRF-R2, агонистов, ХПН (CRF, 1 мкМ, 30 мин), чтобы оценить сотовой различия между фенотипом рецепторных белков. Шкала бар от 5 до 20 мкм. Щелкните здесь для просмотра фильмов.
Фильм 3. Свободно вращающаяся 3D в "превзойти" режим НЕК 293 трансфицированных клеток с HA-CRF-R2, предварительная обработка с антагонистом (AS-30, 1 мкМ, 30 мин) до агонистов (CRF, 1 мкМ, 30 мин ), чтобы оценить сотовой различия между фенотипом рецепторных белков. Шкала бар от 5 до 20 мкм. Щелкните здесь для просмотра фильмов.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Мы показали, что CRF лечении индуцированных значительные изменения в морфологии и расположение CRF-R2. Изменения в CRF-R2 ингибируется селективной очистки антагониста. Мы показали, что рецепторы изменений обнаружено не было и не может быть измерена с помощью стандартного 2D мультиспектральных методов. Возможность для изучения сложных 3D-изображения является критическим для включения сложности биологических параметров для морфометрического анализа. Мы смогли сделать 3D-измерений клетки без заранее определенной формы с несовместимыми флуоресценции компонент сети. Наш набор пользовательских модифицируемые методов автоматизированного позволяет количественно молекулярной динамики в отдельных аморфной формы клеток в среде с целью получения информации о ячейке динамику. Этот инструмент может помочь сделать предсказания о влиянии фармакологических соединений на сотовые пути и клеточные изменения морфологии в присутствии ингибиторов и предоставить информацию о выживаемости клеток.
Преимущество нашего метода количественной 3D том, что она позволяет исследователям с обширными знаниями в области биологии механизмы, но не знакомы с компьютером коды, интерфейс микроскопии с компьютерными приложениями. Мы сделали одноклеточных измерений в целях выявления информации, которая отражает популяцию клеток 6. Single-измерительной ячейки дает нам анализ сложной формы ячейки невозмущенной близости с другими клетками. Этот метод поможет ученым в изучении изменения формы клеток и расположения мембран-связанных белков после химической stimualtion 7, 8. Анализ ячейка должна включать в себя данные с сотового внутренних отсеках основных своих внеклеточных конечностей. Максимальное включение данных, которые могут быть получены из 2D изображения по средней плоскости клетки, однако ядра и внешней расположение плазматической мембраны расположены на различных Z-плоскости; 2D визуализации усекаетизображение. В ядре находится между 3 и 4 мкм над сотовой точки присоединения, который находится на стекло покровное, расширенный объем данных будут потеряны. Этот рецептор пространственной реорганизации можно увидеть только в 3D-изображения, и не может быть определена количественно без анализа. Этот инструмент предлагает новый подход к визуализации и измерения клеточные изменения, которые не обнаруживаются с помощью традиционных 2D-аналитические методы, предоставляя информацию, которая обращается к сотовой системе в целом, а не фрагментированной 2D-данных. Такой подход к измерению одного клетки вместе с другими описанных технологий 9, позволяет исследовать сложности клеточной динамики и основой клеточных пластичность.
Этот метод не ограничивается Imaris и может быть применена к любым программным обеспечением визуализации данных сопряжено с вычислительным программным обеспечением языке. Будущие усовершенствования системы будет включать в себя морфометрического анализа 3D клеток, взятых у живыхклетки, чтобы позволить рассмотрение всей клетки в его естественном состоянии без фиксации химического или химического воздействия. Импорт изображений живых клеток также устранит межклеточных изменчивости, так как мы можем количественного фенотипического измерений в одной камере с течением времени.
Мы считаем, что наша технологическая платформа, с ее потенциалом для измерения структуры неопределенной формы-клеток, поможет другим ученым, чтобы заполнить пробел в методах количественного изображений. Этот новый подход применим к характеристике многочисленных одной ячейки фенотипические изменения, что делает эту ячейку на основе анализа, как и другие одноклеточные профилирования 10, дополнительный инструмент для процесса обнаружения наркотиков. Так морфологии клеток уже были использованы в высокопроизводительного скрининга для выявления низкомолекулярных ингибиторов 11, как эта платформа развивается, мы ожидаем, что этот метод, чтобы быть полезным для определения кривой доза-реакция от отдельных клеток, которые влияют на те же фармакологическиекал цели, но с разными механизмами действия.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Нет конфликта интересов объявлены.
Acknowledgments
Мы благодарим биологических изображений Центр развития (BIDC), Университет Калифорнии, Сан-Франциско для использования Imaris, Imaris XT и Matlab. Мы благодарим В. Харазия для оказания технической помощи и на Генри, LK Флорен, Л. Саундэкс Дэйча за их вклад в редактирование рукописи. Эта работа была поддержана финансирование от штата Калифорния медицинских исследований по алкоголю и наркомании через UCSF в SEB, Национальные Институты Здоровья: 1R21DA029966-01 и NIH Быстрый награду трек на экран MLSMR коллекции SEB, UCSF школы фармации ( Деканат и клинической фармации) и Школы медицины (клинической фармакологии и экспериментальной терапии), чтобы CLHK.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Human Embryonic Kidney (HEK293) | American Type Culture Collection | CRL-1573 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Invitrogen | 11965118 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Invitrogen | SH30070.03 | |
| AlexaFluor-488 (IgG2b) | Invitrogen | A-11001 | |
| monoclonal anti-HA.11 (IgG1) | Covance | 16B12 | |
| DAPI | Vector Laboratories | H-1200 | |
| CRF | Sigma | C2917 | |
| Antisauvagine-30 (AS-30) | Sigma | A4727 |
References
- West, M. J. Design-based stereological methods for counting neurons. Prog, Brain Res. 135, 43-51 (2002).
- Burke, M., Zangenehpour, S., Mouton, P. R., Ptito, M. Knowing what counts: unbiased stereology in the non-human primate brain. J. Vis. Exp. (27), e1262 (2009).
- Sugawara, Y., Ando, R., Kamioka, H., Ishihara, Y., Honjo, T., Kawanabe, N., Kurosaka, H., Takano-Yamamoto, T., Yamashiro, T. The three-dimensional morphometry and cell-cell communication of the osteocyte network in chick and mouse embryonic calvaria. Calcif. Tissue Int. 88, 416-424 (2011).
- Vickery, R. G., von Zastrow, M. Distinct dynamin-dependent and -independent mechanisms target structurally homologous dopamine receptors to different endocytic membranes. J. Cell Biol. 144, 31-43 (1999).
- Bartlett, S. E., Enquist, J., Hopf, F. W., Lee, J. H., Gladher, F., Kharazia, V., Waldhoer, M., Mailliard, W. S., Armstrong, R., Bonci, A. Dopamine responsiveness is regulated by targeted sorting of D2 receptors. Pro.c Natl. Acad. Sci. U.S.A. 102, 11521-11526 (2005).
- Gordon, A., Colman-Lerner, A., Chin, T. E., Benjamin, K. R., Yu, R. C., Brent, R. Single-cell quantification of molecules and rates using open-source microscope-based cytometry. Nat. Methods. 4, 175-181 (2007).
- Schock, F., Perrimon, N. Molecular mechanisms of epithelial morphogenesis. Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 18, 463-493 (2002).
- Pincus, Z., Theriot, J. A. Comparison of quantitative methods for cell-shape analysis. J. Microsc. 227, 140-156 (2007).
- Spiller, D. G., Wood, C. D., Rand, D. A., White, M. R. Measurement of single-cell dynamics. Nature. 465, 736-745 (2010).
- Loo, L. H., Wu, L. F., Altschuler, S. J. Image-based multivariate profiling of drug responses from single cells. Nat Methods. 4, 445-453 (2007).
- Yarrow, J. C., Totsukawa, G., Charras, G. T., Mitchison, T. J. Screening for cell migration inhibitors via automated microscopy reveals a Rho-kinase inhibitor. Chem. Biol. 12, 385-395 (2005).
