Summary
פתחנו פלטפורמת תוכנה שמנצלת Imaris Neuroscience, ImarisXT וMATLAB כדי למדוד את השינויים במורפולוגיה של צורה מוגדרת נלקחה מפלואורסצנטי confocal תלת ממדי של תאים בודדים. זו גישה חדשנית יכולה לשמש כדי לכמת את השינויים בצורת התא בא הפעלה קולטנית ולכן מייצגת כלי נוסף אפשרי לגילוי סמים.
Protocol
1. ניתוח מורפומטריות תלת ממדי של שינויים פנוטיפי תא בודד
- (HEK293) תאי כליה עובריים אנושיים היו transfected עם hemagglutinin (HA) מתויג-corticotropin משחרר factor receptor-2 (CRF-R2), הקולטן G-חלבון בשילוב (GPCR) כפי שתואר לעיל 4, 5.
- התאים היו מטופלת כראוי (ללא טיפול, NT), מגורה עם ליגנד CRF-R2 אנדוגני, גורם משחרר corticotropin, CRF (1 מיקרומטר, 30 דקות), או pretreated עם אנטגוניסט CRF-R2 סלקטיבית, 30 נגד sauvagine (AS -30, 1 מיקרומטר, 30 דקות) לפני טיפול אגוניסט.
- התאים אז היו נעוצים, permeabilized וטופלו באנטי HA. CRF-R2 היה דמיין באמצעות Alexa 594 ננומטר המצומד נגד עכבר (1 IgG) נוגדנים. DAPI שמש כדי להמחיש את השלב המיטוטי גרעינים.
- כדי להגביל את הסובייקטיביות הנסיין, את תנאי הניסוי לא היו ידועים עד לאחר התמונות נרכשו ונותחו.
- אנו רכשנו תמונהשל מHEK293 תאים קבועים באמצעות מיקרוסקופ Zeiss LSM 510 META confocal מטרת תכנית-apochromat 63x/1.4 שמן דסק"ש ומחובר למערכת קוהרנטית משולבת שני פוטוני ליזר המורכבת מורדים-V5 ליזר ומירה 900-F מערכת ליזר.
- במהלך תהליך רכישת הנתונים, התאים היו ממודרים הוא על ידי חתך multispectral, 488 ננומטר, ו790 ננומטר (ננומטר ~ Ex 350 2ph.) ומחיצות z (0.5 מרווחי מיקרומטר) כדי לכלול נתונים מקרום הגרעין לרצפטור התאי החיצוני גפיים.
- נתוני הקרינה עובדו ראשונים באמצעות Imaris, המאפשר הדמיה והפילוח של בסיס נתוני מיקרוסקופיה 3D, ומודל 3D המורכב מvoxels מעוקבים נוצר עבור ניתוח מורפומטריות.
ואז, Imaris XT מודול נוצל לImaris ממשק עם שפת תוכנת מחשב MATLAB כדי לקבוע את נקודת ציון של רחבות GPCR.
לקחת בחשבון השתנות סלולרית, השיג ונתחתי פלואורסצנטי תמונות takבדרכו מ22 תאים: ללא טיפול (NT) (n = 7), אגוניסט טיפול (CRF) (n = 8) וטיפול מראש עם יריב (AS-30) לפני טיפול אגוניסט (n = 7) (איור 2) .- האזור של עניין (ROI) צריך לכלול תא אחד שהוא לא בשלב המיטוטי פעיל ולא לסגור לתאים אחרים. באופן זה, הניתוח יכלול תאים בעלי גרעין אחד בלבד ושלוחות הקולטן אינם מוטרדים קרבה של תאים אחרים.
- המבנה שוחזר 3D הסלולרי ראשון מנתוני קרינת multispectral באמצעות Imaris (v.7.1.1).
- בעקבות האלגוריתם שתוכנן על ידי Imaris, 1 עיבוד פני השטח נוצל כדי לייצג את קרום הגרעין. Imaris יקבע אם יש יותר מגרעין אחד בהחזר על ההשקעה.
- אז אלגוריתם כתמי יצירה נוצל כדי לאתר את סיומת CRF-R2. זיהוי כתמים נוצל כי זה מפצה על רעשי רקע ועצמה חריגה שלרשת מורכבת של תאי אמורפי בצורה.
- כדי למקסם את ההכללה של כל יחידת איתור קרינה של CRF-R2, בקוטר של הכתמים נקבע ל 0.2 מיקרומטר, המהווה את היחידה הקטנה ביותר בתוך התמונה על מנת להסיק מידע ייחודי בצורה של עצמה נמדדת באמצעות גאוסי מסנן. סינון ספוט התאגד בתהליך יצירת הנקודות האוטומטיות. התוכנה, לעומת זאת, נותנת למשתמש את הגמישות להשתמש במסננים כדי להגדיר את הפרמטרים.
- כדי להימנע מחיתוך נתונים, ערכת הנתונים הוסבה מ8-bit (לא חתום) נקודה קבועה, לעשרוני 32-bit.
- נתוני עוצמות voxel הוחלפו לזהות נתוני קואורדינטות באמצעות מודול Imaris XT interfaced עם MATLAB ואת המיקום המרחבי המדויק של כל נקודה נקבע על ידי ביצוע שינוי מרחק באמצעות קרום הגרעין כנקודת התייחסות (איור 3).
- הנתונים שיתקבלו ניתן לכמת ומוצגים בפורמט גרפי ליםניתוח tatistical. השוואות בין קבוצות בוצעו באמצעות דו כיוונית ANOVA וBonferroni posttest. נתונים מוצגים כממוצע ± SD. הבדלים נחשבים משמעותי ב* p <0.05. חישובים נעשו עם פריזמה GraphPad 5.02 (איור 4).
2. נציג תוצאות
כדי להדגים את כוחה של הגישה שלנו, לכמת את השינויים התאיים הנובע מהאינטראקציה של קולטני G חלבון מצמידים (GPCRs) וגורם משחרר corticotropin הקולטן-2 (CRF-R2) עם CRF יגנד אנדוגני בHEK293 תאי transfected.
אנו מראים כי רצפטורים CRF-R2 ממוקמים בקרום הפלזמה ופרויקט מאזורים סופיים של הקרום של התאים (האיור 2A וסרט 1). באמצעות ניתוח 2D קונבנציונלי, ניתן לזהות קבוצת משנה של קולטני תאי CRF-R2 רק אם אנו מנתחים את הקולטן הידבקות points על הזכוכית הקדמית. כתוצאה מכך אנו מאבדים את כל מידע אחר הנגזר מZ-נערמו נתוני multispectral (איור 5).
כאשר תאי מטופלים עם CRF, הקולטנים התאיים מופחתים מאוד, כפי שמוצגים על ידי הירידה במרחק של כתמים מקרום הפלזמה. הם גם מחולקים מחדש ממקומות בעיקר סופיים למספר המקומות נפרדים (2B איור וסרט 2).
ההשפעה של CRF על חלוקת קרום קולט נמנעת על ידי טיפול מקדים באנטגוניסט CRF-R2 הספציפי, 30 antisavagine (AS-30) ואנו מוצאים כי הרחבות CRF-R2 לא משתנות (האיור 2C וסרט 3).
ההפצה הדיסטלי של כתמים, זממה ב 5 המרווחים המקודדים ספקטרום צבעי מיקרומטר, מנוצלת כדי להמחיש את המרחק מvoxels מקרום הגרעין. לא pretreatm טיפול ואנטגוניסטאף אוזן גרון (AS-30, 1 מיקרומטר, 30 דקות) לפני טיפול אגוניסט (CRF, 1 מיקרומטר, 30 דקות) לא הראה הבדל משמעותי (NS) בהתכווצות GPCR. טיפול בתאים עם אגוניסט (CRF, 1 מיקרומטר, 30 דקות) בהדרגה מפחית את מספר voxels-R2 המכיל CRF בהשוואה לכל טיפול, 0-5 מיקרומטר (NS), 6-15 מיקרומטר (** p < 0.01) ו> 15 מיקרומטר (*** p <0.005), או בהשוואה לכמות ש- 30 לטיפול, 0-10 מיקרומטר (NS), 11-15 מיקרומטר (** p <0.01) ו> 15 מיקרומטר (*** p <0.005) (איור 4).
איור 1. תרשים של טכניקות הזמינות הנוכחיות והגבלתם לנתח תמונות פלואורסצנציה. לחץ כאן לצפייה בדמות גדולה.
איור 3. מודל 3D של HEK293 תאי transfected עם HA-CRF-R2 שחזר מתמונות CLS באמצעות תוכנת Imaris. עיבוד פני שטח של הגרעין ויצירת כתמים מתאר רחבות GPCR הומרו לשלפוחית קטנה. נתוני הקרינה עובדו ראשון באמצעות Imaris המאפשר הדמיה והפילוח של נתונים להגדיר מיקרוסקופיה 3D. ואז, Imaris XT נוצל לImaris ממשק עם MATLAB. עוצמות voxel הוחלפו לתוךנקודת המרכזת. כתמי צבע קשת מקודד (0-5 מיקרומטר הכחול, ירוק, 6-10 מיקרומטר, מיקרומטר 11-15 צהוב והאדום> 15 מיקרומטר) מייצגים את צורת מרחק קרום הגרעין. הסולם של 5 מיקרומטר.
האיור 4. ייצוג גרפי של ההפצה הדיסטלי של כתמים זמם בספקטרום הצבעים המקודדים ב 5 מרווחי מיקרומטר מנוצל כדי להמחיש את המרחק מvoxels מקרום הגרעין. אין טיפול וטיפול מקדים ביריב (AS-30, 1 מיקרומטר, 30 דקות) לפני טיפול אגוניסט (CRF, 1 מיקרומטר, 30 דקות) לא הראה הבדל משמעותי (NS) בהתכווצות GPCR. טיפול בתאים עם אגוניסט (CRF, 1 מיקרומטר, 30 דקות) מפחית בהדרגה את המרחק של מספר voxels-R2 המכיל CRF בהשוואה לשום טיפול 0-5 מיקרומטר (NS), 6-15 מיקרומטר (עמ ** <0.01) ו> 15 מיקרומטר (*** p <0.005); או 0-10 מיקרומטר הטיפול AS-30 (NS), 11-15 מיקרומטר (** p <0.01) ו> 15 מיקרומטר (*** p <0.005).
איור 5. הגבלת ניתוח מורפומטריות 2D של 293 תאי transfected HEK עם HA-CRF-R2. סעיף מטוס האמצע של תאים (3-4μm מעל זכוכית coverslip) מראה את מרכז הגרעינים דמיין בDAPI וHA-CRF-R2 חקר באמצעות אנטי HA ו דמיין באמצעות Alexa 488nm מצומדת אנטי עכבר (1 IgG) משני נוגדנים ורכש עם CLS מראים שום הבדל בין () ללא טיפול (NT) ו (ב) אגוניסט (CRF, 1 מיקרומטר, 30 דקות), ואילו את נקודתי ההדבקה הקולטן הן שונות באופן דרמטי.
סרט 1. הסתובב בחופשיות, מודל 3D במצב "לעלות" לHEK 293 תאי transfected עם HA-CRF-R2, ללא טיפול, כדי להעריך את ההבדלים בין פנוטיפ סלולריים חלבוני הקולטן. סרגל קנה מידה 5-20 מיקרומטר."Target =" / files/ftp_upload/4233/4233movie1.avi _blank "> לחץ כאן לצפייה בסרט.
סרט 2. הסתובב בחופשיות, מודל 3D במצב "לעלות" לHEK 293 תאי transfected עם HA-CRF-R2, טיפול אגוניסט, CRF (CRF, 1 מיקרומטר, 30 דקות) כדי להעריך הבדלי פנוטיפ סלולריים בין חלבוני הקולטן. סרגל קנה מידה 5-20 מיקרומטר. לחץ כאן לצפייה בסרט.
סרט 3. הסתובב בחופשיות במצב 3D "לעלות" לHEK 293 תאי transfected עם HA-CRF-R2, טיפול מקדים ביריב (AS-30, 1 מיקרומטר, 30 דקות) לפני טיפול אגוניסט (CRF, 1 מיקרומטר, 30 דקות ') כדי להעריך הבדלי פנוטיפ סלולריים בקרב חלבוני הקולטן. סרגל קנה מידה 5-20 מיקרומטר. לחץ כאן לצפייה בסרט.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
אנחנו הראינו כי טיפול CRF מושרה שינוי משמעותי במורפולוגיה ומיקום של CRF-R2. השינוי בCRF-R2 נבלם על ידי טיפול אנטגוניסט סלקטיבי. אנחנו הראינו כי שינויי הקולטן הם לא אותרו ולא ניתן למדוד באמצעות טכניקות multispectral 2D הסטנדרטיות. היכולת ללמוד תמונות 3D מורכבות היא קריטית כדי לשלב את המורכבות של פרמטרים ביולוגיים לצורך ניתוח מורפומטריות. היינו מסוגלים לבצע מדידות 3D של תאים ללא צורה מוגדרת מראש עם רכיבי רשת קרינה הבלתי עקביים. החבילה של שיטות המשתמש modifiable האוטומטי שלנו מאפשרת לנו לכמת דינמיקה מולקולרית בתאים בודדים אמורפי דמויים בסביבתם במטרה לחלץ מידע אודות דינמיקה סלולרית. כלי זה יכול לעזור להפוך את התחזיות לגבי ההשפעות של מתחם תרופתי על מסלולים סלולריים ושינויי מורפולוגיה תאיים בנוכחות מעכבים ולספק מידע על הישרדות תא.
יתרונה של שיטת כימות 3D שלנו הוא שהיא מאפשרת לחוקרים עם מומחיות רבה במנגנוני ביולוגיה, אבל לא מכיר את קודי מחשב, לשיטות מיקרוסקופיה ממשק עם יישומי מחשב. אנחנו עשינו מדידות תא בודד כדי לחשוף מידע המשקף אוכלוסייה של תאים 6. מדידה מתא בודד מספקת לנו אנליזה של תאים בצורה מורכבת ואינם נרתעים מקירבה עם תאים אחרים. שיטה זו תסייע למדענים בחקר שינויים בצורת תא ואת המיקום של חלבוני קרום בכריכה לאחר stimualtion הכימי 7, 8. הניתוח של תא צריך לכלול נתונים מתאי הליבה הפנימיים הסלולריים לגפיים התאיים שלה. הכללת הנתונים המרבית שניתן להשיג מתמונת 2D היא מעבר לאמצע המטוס של תא, אולם הגרעין והמיקום החיצוני של קרום הפלזמה ממוקמים על מטוסי z שונים; הדמית 2D חותכתתמונה. כגרעין ממוקם בין 3 ל 4 מיקרומטר מעל נקודתי ההידבקות הסלולר, אשר ממוקמות על coverslip הזכוכית, כמות מוגדלת של נתונים הולכים לאיבוד. הארגון מחדש מרחבית הקולטן הזה ניתן לראות רק בתמונות 3D, והוא לא מסוגל לכימות ללא ניתוח. כלי זה מספק גישה חדשנית כדי לחזות ולמדוד את שינויים תאיים שלא התגלו תוך שימוש בטכניקות אנליטיות 2D מסורתיות, מתן מידע המתייחס למערכת התאית בכללות במקום מקוטעת על ידי נתוני 2D. גישה זו למדידת תאים בודדים יחד, עם טכנולוגיות שתוארו אחרות 9, מאפשרת לנו לחקור את המורכבות של דינמיקה הסלולר ובסיס הפלסטיות סלולרית.
שיטה זו אינה מוגבלת לImaris ויכולה להיות מיושמת על כל תוכנת הדמית נתוני ממשק עם תוכנת שפת מחשוב. שיפורים עתידיים במערכת יכללו ניתוח מורפומטריות של 3D תאים שנלקחו מהחייםתאים למאפשרים בחינה של כל התא במצבו הטבעי, ללא קיבעון כימי או צביעה כימית. רכישת תמונות של תאי חיים יהיה גם לחסל שונות בין תאית, מאז שאנחנו יכולים לכמת מדידות פנוטיפי באותו התא לאורך זמן.
אנו מאמינים שטכנולוגית הפלטפורמה שלנו, בפוטנציאל שלה כדי למדוד את המבנים של תאים בצורה בלתי מוגדרים, יסייעו למדענים אחרים כדי למלא את פער בשיטות הדמית כימות. גישה חדשנית זו ישימה לאפיון של שינויים בתא בודדים רבים פנוטיפי, מה שהופך assay המבוסס תא זה, כאפיון אחר תא בודד 10, כלי נוסף לתהליך גילוי התרופות. מאז מורפולוגיה תא כבר מנוצל בתפוקה גבוהה הקרנה לזיהוי מעכבי מולקולה קטנה 11, כפלטפורמה זו מתפתחת, אנו מצפים בשיטה זו כדי להיות שימושית לקביעת עקומת מנת תגובה מתאים בודדים המשפיעים על אותו pharmacologiיעד קלוריות אבל עם מנגנוני פעולה שונים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
אין ניגודי האינטרסים הכריזו.
Acknowledgments
אנו מודים הביולוגית הדמית מרכז הפיתוח (BIDC) מאוניברסיטת קליפורניה, סן פרנסיסקו לשימוש בImaris, Imaris XT ו Matlab. אנו מודים V. Kharazia לסיוע הטכני ועל הנרי, LK פלורן, L. ךייטש על תרומתם לעריכה של כתב היד. עבודה זו נתמכה על ידי מימון ממדינת קליפורניה מחקר רפואי על אלכוהול התעללות וסמים דרך קליפורניה בסן פרנסיסקו לSEB, המכונים הלאומיים לבריאות: 1R21DA029966-01 ופרס NIH מסלול המהיר להקרין את אוסף MLSMR לSEB, קליפורניה בסן פרנסיסקו בית הספר לרוקחות ( משרד הדיקן ורוקחות קליניות) ובית הספר לרפואה (פרמקולוגיה קלינית & Therapeutics ניסיוני) לCLHK.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Human Embryonic Kidney (HEK293) | American Type Culture Collection | CRL-1573 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Invitrogen | 11965118 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Invitrogen | SH30070.03 | |
| AlexaFluor-488 (IgG2b) | Invitrogen | A-11001 | |
| monoclonal anti-HA.11 (IgG1) | Covance | 16B12 | |
| DAPI | Vector Laboratories | H-1200 | |
| CRF | Sigma | C2917 | |
| Antisauvagine-30 (AS-30) | Sigma | A4727 |
References
- West, M. J. Design-based stereological methods for counting neurons. Prog, Brain Res. 135, 43-51 (2002).
- Burke, M., Zangenehpour, S., Mouton, P. R., Ptito, M. Knowing what counts: unbiased stereology in the non-human primate brain. J. Vis. Exp. (27), e1262 (2009).
- Sugawara, Y., Ando, R., Kamioka, H., Ishihara, Y., Honjo, T., Kawanabe, N., Kurosaka, H., Takano-Yamamoto, T., Yamashiro, T. The three-dimensional morphometry and cell-cell communication of the osteocyte network in chick and mouse embryonic calvaria. Calcif. Tissue Int. 88, 416-424 (2011).
- Vickery, R. G., von Zastrow, M. Distinct dynamin-dependent and -independent mechanisms target structurally homologous dopamine receptors to different endocytic membranes. J. Cell Biol. 144, 31-43 (1999).
- Bartlett, S. E., Enquist, J., Hopf, F. W., Lee, J. H., Gladher, F., Kharazia, V., Waldhoer, M., Mailliard, W. S., Armstrong, R., Bonci, A. Dopamine responsiveness is regulated by targeted sorting of D2 receptors. Pro.c Natl. Acad. Sci. U.S.A. 102, 11521-11526 (2005).
- Gordon, A., Colman-Lerner, A., Chin, T. E., Benjamin, K. R., Yu, R. C., Brent, R. Single-cell quantification of molecules and rates using open-source microscope-based cytometry. Nat. Methods. 4, 175-181 (2007).
- Schock, F., Perrimon, N. Molecular mechanisms of epithelial morphogenesis. Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 18, 463-493 (2002).
- Pincus, Z., Theriot, J. A. Comparison of quantitative methods for cell-shape analysis. J. Microsc. 227, 140-156 (2007).
- Spiller, D. G., Wood, C. D., Rand, D. A., White, M. R. Measurement of single-cell dynamics. Nature. 465, 736-745 (2010).
- Loo, L. H., Wu, L. F., Altschuler, S. J. Image-based multivariate profiling of drug responses from single cells. Nat Methods. 4, 445-453 (2007).
- Yarrow, J. C., Totsukawa, G., Charras, G. T., Mitchison, T. J. Screening for cell migration inhibitors via automated microscopy reveals a Rho-kinase inhibitor. Chem. Biol. 12, 385-395 (2005).
