Ett analysverktyg som kvantifierar cellulär morfologi Ändringar från Tredimensionella fluorescensbilder
Summary
Vi utvecklade en mjukvaruplattform som använder Imaris neurovetenskap, ImarisXT och MATLAB för att mäta förändringar i morfologi ett odefinierat form tas från tredimensionell konfokal fluorescens av enstaka celler. Denna nya metod kan användas för att kvantifiera förändringar i cellernas form efter receptoraktivering och därför representerar en möjlig ytterligare verktyg för läkemedelsutveckling.
Abstract
De vanligaste programvara analysverktyg tillgängliga för mätning av fluorescens bilder är för tvådimensionella (2D) data som är beroende av manuella inställningar för inkludering och exkludering av datapunkter och datorstödd mönsterigenkänning för att stödja tolkningen och slutsatserna av analysen. Det har blivit allt viktigare att kunna mäta fluorescensbilder konstruerade från tredimensionella (3D) datamängder för att kunna fånga komplexiteten i cellulära dynamik och förstå grunden för cellulära plasticitet i biologiska system. Sofistikerade mikroskopi instrument har gjort det möjligt att visualisering av 3D fluorescens bilder genom förvärv av multispektrala fluorescens bilder och kraftfulla analytiska programvara som rekonstruerar bilderna från konfokala stackar som sedan ger en 3D-representation av de insamlade 2D-bilder. Advanced Design-baserade Stereology metoder har utvecklats av tillnärmningen och antaganden av OriginaL modellbaserad Stereology 1 även i komplexa vävnadssnitt 2. Trots dessa vetenskapliga framsteg inom mikroskopi, kvarstår ett behov av en automatiserad analytisk metod som till fullo utnyttjar de inneboende 3D-data för att möjliggöra analys och kvantifiering av komplexa förändringar i cellmorfologi, protein lokalisering och receptor människohandel.
Aktuella tekniker som är tillgängliga för att kvantifiera fluorescensbilder inkluderar Meta-Morph (Molecular Devices, Sunnyvale, CA) och Image J (NIH) som ger manuell analys. Imaris (Andor Technology, Belfast, Nordirland) programvara ger funktionen MeasurementPro som gör den manuella skapandet av mätpunkter som kan placeras i en volym bild eller dras på en serie av 2D skivor för att skapa en 3D-objekt. Denna metod är användbar för enda klick punkt mätningar för att mäta en linje avståndet mellan två objekt eller för att skapa en polygon som omsluter ett område av intresse, men det är svårt att tillämpa komplex mobiltelenätet strukturer. Filament Tracer (Andor) medger automatisk detektering av 3D neuronala trådliknande har dock denna modul har utvecklats för att mäta definierade strukturer som nervceller, som består av dendriter, axoner och ryggar (trädliknande struktur). Denna modul genialt har använts för att göra morfologiska mätningar till icke-neuronala celler 3, men utdata ger information av en förlängd mobiltelefonnät genom att använda en programvara som är beroende av en definierad cellform snarare än en amorf formad cellulär modell. För att övervinna problemet att analysera amorf-formade celler och göra programvaran mer lämplig för en biologisk applikation, utvecklade Imaris Imaris Cell. Detta var ett vetenskapligt projekt med Eidgenössische Technische Hochschule, som har utvecklats för att beräkna förhållandet mellan celler och organeller. Medan mjukvaran möjliggör detektering av biologiska begränsningar, genom att tvinga en kärna per celloch använder cellmembran till segmentet celler, kan det inte användas för att analysera fluorescensdata som inte fortlöpande eftersom idealt det bygger cellytan utan tomrum. Såvitt vi vet, för närvarande inget användaren modifierbar automatiserad metod som ger morfometrisk information från 3D fluorescensbilder har utvecklats som uppnår cellulär geografisk information i en odefinierad form (figur 1).
Vi har utvecklat en analytisk plattform med Imaris modulen kärnan programvara och Imaris XT gränssnitt till MATLAB (Mat Works, Inc.). Dessa verktyg tillåter 3D-mätning av celler utan en fördefinierad form och med inkonsekventa fluorescens nätverkskomponenter. Dessutom kommer denna metod att forskare som har utökat kompetens inom biologiska system, men inte förtrogenhet med datortillämpningar, att utföra kvantifiering av morfologiska förändringar i celler dynamik.
Protocol
Discussion
Vi visade att CRF behandling inducerade en signifikant förändring i morfologi och lokalisering av CRF-R2. Förändringen i CRF-R2 inhiberades genom selektiv antagonist behandling. Vi visade att receptor ändringar inte upptäcktes och kan inte mätas med de vanliga 2D multispektrala tekniker. Förmågan att studera komplexa 3D-bilder är avgörande att införliva komplicerade biologiska parametrar för morfometrisk analys. Vi skulle kunna göra 3D mätningar av celler utan en fördefinierad form med inkonsekventa fluo…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi tackar biologisk avbildning Development Center (BIDC) University of California, San Francisco för användning av Imaris, Imaris XT och Matlab. Vi tackar V. Kharazia för tekniskt bistånd och på Henry, LK Floren, L. Daitch för deras bidrag till redigering av manuskriptet. Detta arbete stöddes av medel från staten Kalifornien medicinsk forskning på alkohol och missbruk genom UCSF till SEB, National Institutes of Health: 1R21DA029966-01 och NIH Fast Track utmärkelse att screena MLSMR samlingen till SEB, UCSF School of Pharmacy ( Dean kansli och klinisk farmaci) och School of Medicine (Clinical Pharmacology & Experimental Therapeutics) i CLHK.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| Human Embryonic Kidney (HEK293) | American Type Culture Collection | CRL-1573 | |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) | Invitrogen | 11965118 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Invitrogen | SH30070.03 | |
| AlexaFluor-488 (IgG2b) | Invitrogen | A-11001 | |
| monoclonal anti-HA.11 (IgG1) | Covance | 16B12 | |
| DAPI | Vector Laboratories | H-1200 | |
| CRF | Sigma | C2917 | |
| Antisauvagine-30 (AS-30) | Sigma | A4727 |
References
- West, M. J. Design-based stereological methods for counting neurons. Prog, Brain Res. 135, 43-51 (2002).
- Burke, M., Zangenehpour, S., Mouton, P. R., Ptito, M. Knowing what counts: unbiased stereology in the non-human primate brain. J. Vis. Exp. (27), e1262 (2009).
- Sugawara, Y., Ando, R., Kamioka, H., Ishihara, Y., Honjo, T., Kawanabe, N., Kurosaka, H., Takano-Yamamoto, T., Yamashiro, T. The three-dimensional morphometry and cell-cell communication of the osteocyte network in chick and mouse embryonic calvaria. Calcif. Tissue Int. 88, 416-424 (2011).
- Vickery, R. G., von Zastrow, M. Distinct dynamin-dependent and -independent mechanisms target structurally homologous dopamine receptors to different endocytic membranes. J. Cell Biol. 144, 31-43 (1999).
- Bartlett, S. E., Enquist, J., Hopf, F. W., Lee, J. H., Gladher, F., Kharazia, V., Waldhoer, M., Mailliard, W. S., Armstrong, R., Bonci, A. Dopamine responsiveness is regulated by targeted sorting of D2 receptors. Pro.c Natl. Acad. Sci. U.S.A. 102, 11521-11526 (2005).
- Gordon, A., Colman-Lerner, A., Chin, T. E., Benjamin, K. R., Yu, R. C., Brent, R. Single-cell quantification of molecules and rates using open-source microscope-based cytometry. Nat. Methods. 4, 175-181 (2007).
- Schock, F., Perrimon, N. Molecular mechanisms of epithelial morphogenesis. Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 18, 463-493 (2002).
- Pincus, Z., Theriot, J. A. Comparison of quantitative methods for cell-shape analysis. J. Microsc. 227, 140-156 (2007).
- Spiller, D. G., Wood, C. D., Rand, D. A., White, M. R. Measurement of single-cell dynamics. Nature. 465, 736-745 (2010).
- Loo, L. H., Wu, L. F., Altschuler, S. J. Image-based multivariate profiling of drug responses from single cells. Nat Methods. 4, 445-453 (2007).
- Yarrow, J. C., Totsukawa, G., Charras, G. T., Mitchison, T. J. Screening for cell migration inhibitors via automated microscopy reveals a Rho-kinase inhibitor. Chem. Biol. 12, 385-395 (2005).
