Summary
وضعنا منصة البرمجيات التي تستخدم Imaris العلوم العصبية، وImarisXT MATLAB لقياس التغيرات في مورفولوجية شكل غير معروف مأخوذ من ثلاثي الأبعاد من الخلايا مبائر مضان واحد. ويمكن استخدام هذا النهج الجديد لقياس التغييرات في شكل الخلية بعد تفعيل مستقبلات وبالتالي يمثل أداة ممكنة إضافية لاكتشاف المخدرات.
Protocol
1. تحليل ثلاثي الأبعاد من المظهرية وحيدة الخلية التغييرات المظهرية
- وتقاس الكلى الجنينية البشرية (HEK293) مع خلايا هيماغلوتينين (HA)-الموسومة كورتيكوتروبين الإفراج عن عامل مستقبلات-2 (CRF-R2)، وهو بروتين G-يقترن مستقبلات (GPCR) كما هو موضح سابقا 4، 5.
- تركت دون علاج الخلايا (أي علاج، NT)، مع حفز يجند الذاتية CRF-R2، كورتيكوتروبين عامل الإفراج، CRF (1 ميكرومتر، 30 دقيقة)، أو سابقة التجهيز مع خصم CRF-R2 انتقائية، ومكافحة sauvagine 30 (AS -30، 1 ميكرومتر، 30 دقيقة) قبل العلاج ناهض.
- تم إصلاحها ثم الخلايا، وتعامل مع permeabilized HA للسامية. كان CRF-R2 تصور باستخدام اليكسا 594 نانومتر المتقارن المضادة للماوس (مفتش 1) الأجسام المضادة. وقد استخدم دابي لتصور المرحلة التفتلي نوى.
- للحد من الذاتية مجرب، لم تكن معروفة في الظروف التجريبية حتى بعد تم الحصول عليها من الصور وتحليلها.
- حصلنا على صورةS من الخلايا HEK293 الثابتة باستخدام خطة لامزيغ-63x/1.4 الهدف DIC النفط وزايس LSM المجهر متحد البؤر META 510 متصلة مترابطة متكاملة نظام ليزر ثنائي الفوتون تتكون من الليزر فيردي-V5 و900-F ميرا نظام ليزر.
- أثناء عملية الحصول على البيانات، ومجزأة الخلايا كل من باجتزاء متعددة الأطياف، NM 488، و 790 نانومتر (نانومتر ~ تحويلة 350 2ph.) وZ-تقسيم (0.5 ميكرومتر الزيادات) لتشمل البيانات من الغشاء النووي لمستقبلات للخارج الخلية الخارجي الأطراف.
- تمت معالجة البيانات أولا باستخدام مضان Imaris، والذي يسمح التصور وتجزئة بيانات المجهر 3D، وتم إنشاء نموذج 3D تتألف من voxels مكعب للتحليل المظهرية.
ثم، تم استخدام وحدة لImaris XT Imaris التفاعل مع الكمبيوتر MATLAB لغة البرنامج لتحديد إحداثيات المكان ملحقات GPCR.
على أن تأخذ في الاعتبار التباين الخلوية، وحصلنا على تحليل الصور مضان تاكEN من 22 الخلايا: يوجد علاج (NT) (ن = 7)، ناهض (CRF) العلاج (ن = 8) وقبل العلاج مع خصم (AS-30) قبل العلاج ناهض (ن = 7) (الشكل 2) .- يجب المنطقة الاهتمام (ROI) تشمل خلية واحدة غير موجود في المرحلة التفتلي بالموقع وليس على مقربة من الخلايا الأخرى. بهذه الطريقة، سوف تشمل تحليل الخلايا لا مع نواة واحدة فقط وملحقات مستقبلات مضطرب من جراء قربها من الخلايا الأخرى.
- أعيد بناؤها أولا هيكل 3D من البيانات الخلوية متعددة الأطياف باستخدام مضان Imaris (v.7.1.1).
- بعد الخوارزمية التي صممها Imaris، واستخدم لأول مرة لتمثيل تقديم السطحية الغشاء النووي. سوف Imaris تحديد إذا كان هناك أكثر من واحد في النواة ROI.
- ثم تم استخدام خوارزمية البقع-إنشاء ملحق لتحديد موقع CRF-R2. واستخدم البقع لأنه كشف يعوض عن الضوضاء الخلفية وكثافة غير النظامية للشبكة معقدة غير متبلور على شكل الخلايا.
- لتحقيق أقصى قدر من إدراج كل وحدة من كشف مضان من CRF-R2، أنشئت قطر للبقع 'إلى 0.2 ميكرون، وهو أصغر وحدة في الصورة لاستقراء المعلومات متميزة في شكل كثافة يقاس باستخدام فلتر التمويه. تأسست تصفية بقعة في إنشاء المواقع عملية آلية. البرنامج، ومع ذلك، يعطي المستخدم المرونة اللازمة لاستخدام الفلاتر لتحديد المعلمات.
- لتجنب اقتطاع البيانات، تم تحويل مجموعة من البيانات 8 بت (غير موقعة) نقطة ثابتة، إلى 32 بت عشرية.
- وتبادل البيانات فوكسل شدة على الفور باستخدام إحداثيات البيانات Imaris XT حدة تفاعل مع MATLAB والمكان المحدد المكاني للكل بقعة تم تحديد عن طريق إجراء التحول المسافة باستخدام الغشاء النووي كنقطة مرجعية (الشكل 3).
- يمكن كميا البيانات الناتجة وعرضها في شكل رسوم بيانية لياليtatistical التحليل. وأجريت مقارنات بين المجموعات باستخدام اتجاهين ANOVA والبعدي Bonferroni. يتم عرض البيانات كما يعني ± SD. وتعتبر فروق ذات دلالة إحصائية في * 0،05 <P. وأدلى حسابات مع بريزم GraphPad 5.02 (الشكل 4).
2. ممثل النتائج
للتدليل على قوة نهجنا، ونحن كميا التغيرات الخلوية التي تنتج عن التفاعل بين مستقبلات البروتين يقترن G (GPCRs) والموجهة القشرية عامل الإفراج عن مستقبلات-2 (CRF-R2) مع يجند لها CRF الذاتية في الخلايا HEK293 بالنقل.
نعرض التي تقع CRF-R2 المستقبلات في الغشاء البلازمي والمشروع من مناطق محدودة من غشاء الخلايا (الشكل 2A والفيلم 1). باستخدام التحليل التقليدي 2D، فمن الممكن الكشف عن هذه المجموعة الفرعية من مستقبلات CRF-R2 خارج الخلية إلا إذا حللنا مستقبلات الالتصاق بورجات على زجاج يغطي. وبالتالي نفقد أي معلومات أخرى مستمدة من البيانات Z-مكدسة متعددة الأطياف (الشكل 5).
عندما يتم التعامل مع الخلايا CRF، وتقلص إلى حد كبير المستقبلات خارج الخلية، ويتضح ذلك من انخفاض في المسافة من البقع من غشاء البلازما. وإعادة توزيعها أيضا أنها من مواقع محدودة في المقام الأول إلى عدد من المواقع المتميزة (2B الشكل والفيلم 2).
يتم منع تأثير على توزيع CRF الغشاء مستقبلات من المعالجة المسبقة مع خصم CRF-R2 محددة، antisavagine 30 (AS-30) ونجد أن ملحقات CRF-R2 لا تتغير (الشكل 2C والفيلم 3).
توزيع البعيدة من البقع، وتآمر في فترات 5 ميكرومتر لون الطيف مشفرة، ويستخدم لتصور المسافة بين voxels من الغشاء النووي. ويوجد علاج مضاد pretreatmالأنف والحنجرة (AS-30، 1 ميكرومتر، 30 دقيقة) قبل بدء العلاج ناهض (CRF، 1 ميكرومتر، 30 دقيقة) لا تظهر أي مهمة (م) الفرق في الانكماش GPCR. علاج الخلايا مع ناهض (CRF، 1 ميكرومتر، 30 دقيقة) يقلل تدريجيا من عدد CRF-R2 المحتوية على voxels بالمقارنة مع أي علاج، 0-5 ميكرومتر (م)، 6-15 ميكرون (** p < 0.01) و> 15 ميكرون (*** p <0.005)، أو مقارنة AS-30 معاملة، 0-10 ميكرون (NS)، 11-15 ميكرومتر (** p <0.01) و> 15 ميكرون (*** p <0.005) (الشكل 4).
الشكل 1. الرسم البياني من التقنيات المتاحة حاليا والحد من أجل تحليل الصور مضان. اضغط هنا لمشاهدتها بشكل اكبر شخصية .
الشكل 3. إعادة بناء نموذج 3D من الخلايا المصابة بالعدوى بالنقل مع HEK293 HA-CRF-CLS R2 من الصور باستخدام برامج Imaris. تقديم سطح نواة وخلق بؤر تصف ملحقات GPCR تحويلها إلى حويصلات صغيرة. تمت معالجة البيانات أولا باستخدام مضان Imaris الذي يسمح للتجزئة والتصور 3D المجهر من مجموعة البيانات. ثم، تم استخدام Imaris XT لImaris التفاعل مع MATLAB. تم تبادل شدة فوكسل فيبقعة الإحداثيات. البقع الطيف ترميز الألوان (الأزرق 0-5 ميكرون، الأخضر، 6-10 ميكرون، ميكرومتر 11-15 الأصفر والأحمر> ميكرون 15) تمثل النموذج المسافة الغشاء النووي. مقياس تقييم من 5 ميكرون.
ويستخدم الشكل 4. تمثيل بياني لتوزيع البعيدة من البقع المرسومة في لون الطيف مشفرة في 5 ميكرومتر فترات لتصور المسافة بين voxels من الغشاء النووي. يوجد علاج والمعالجة المسبقة مع خصم (AS-30، 1 ميكرومتر، 30 دقيقة) قبل بدء العلاج ناهض (CRF، 1 ميكرومتر، 30 دقيقة) لا تظهر أي مهمة (م) الفرق في الانكماش GPCR. علاج الخلايا مع ناهض (CRF، 1 ميكرومتر، 30 دقيقة) يقلل تدريجيا المسافة بين عدد من CRF-R2 المحتوية على voxels بالمقارنة مع أي علاج 0-5 ميكرون (NS)، 6-15 ميكرون (ع ** <0.01) و> 15 ميكرون (*** p <0.005)، أو AS-30 ميكرومتر العلاج 0-10 (م)، 11-15 ميكرومتر (** p <0.01) و> 15 ميكرون (*** P <0.005).
الشكل 5. الحد من تحليل المظهرية 2D من الخلايا transfected مع HEK 293 HA-CRF-R2. تصور المقطع منتصف الطائرة من الخلايا (3-4μm فوق ساترة الزجاج) تظهر وسط النوى مع دابي وHA-R2-CRF بحثها استخدام الألغام المضادة للHA وتصور باستخدام اليكسا 488nm مترافق المضادة للماوس (مفتش 1) الثانوية والأجسام المضادة المكتسبة مع CLS لا يظهر أي فرق بين عدم المعالجة (A) (NT) و (B) ناهض (CRF، 1 ميكرومتر، 30 دقيقة)، في حين أن نقطة التصاق مستقبلات مختلفة بشكل كبير.
الفيلم 1. الدورية بحرية نموذج 3D في وضع "فق" من HEK 293 الخلايا transfected مع CRF-HA-R2، أي علاج، لتقييم الاختلافات بين النمط الظاهري الخلوية البروتينات المستقبلة. مقياس بار 5 حتي 20 ميكرون./ files/ftp_upload/4233/4233movie1.avi "الهدف =" _blank "> اضغط هنا لمشاهدة الفيلم.
فيلم 2. الدورية بحرية نموذج 3D في وضع "فق" من HEK 293 الخلايا transfected مع HA-CRF-R2، والعلاج ناهض، CRF (CRF، 1 ميكرومتر، 30 دقيقة) لتقييم الاختلافات بين النمط الظاهري الخلوية البروتينات المستقبلة. شريط نطاق 5 حتي 20 ميكرون. انقر هنا لمشاهدة الفيلم.
الفيلم 3. بحرية 3D الدورية في وضع "فق" من HEK 293 الخلايا transfected مع CRF-HA-R2، المعالجة مع خصم (AS-30، 1 ميكرومتر، 30 دقيقة) قبل بدء العلاج ناهض (CRF، 1 ميكرومتر، 30 دقيقة ) لتقييم الاختلافات بين النمط الظاهري الخلوية البروتينات المستقبلة. شريط نطاق 5 حتي 20 ميكرون. انقر هنا لمشاهدة الفيلم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
أثبتنا أن يسببها العلاج CRF تغييرا كبيرا في التشكل وموقع CRF-R2. وقد تحول دون التغيير في CRF-R2 عن طريق العلاج خصم انتقائية. أثبتنا أن التعديلات لم يتم اكتشاف مستقبلات ويمكن أن لا تقاس باستخدام معيار تقنيات متعددة الأطياف 2D. القدرة على دراسة الصور 3D المعقدة أمر بالغ الأهمية لإدراج تعقيد العوامل البيولوجية لتحليل المظهرية. كنا قادرين على إجراء قياسات 3D من الخلايا دون شكل محدد مسبقا مع مكونات شبكة الاتصال غير متناسقة مضان. نا جناح أساليب الآلي المستخدم للتعديل يمكننا من قياس ديناميات الجزيئية في الخلايا على شكل غير متبلور الفردية في بيئتهم من أجل انتزاع معلومات حول الديناميات الخلية. هذه الأداة يمكن أن تساعد على جعل التكهنات بشأن الآثار المترتبة على مجمع الدوائية على مسارات الخلوية والخلوية تغيير التشكل في وجود مثبطات وتوفير المعلومات حول بقاء الخلية.
ميزة طريقتنا الكمي 3D هو أنه يسمح للباحثين مع خبرة واسعة في آليات البيولوجيا، ولكن لم تكن مألوفة مع رموز الكمبيوتر، إلى تقنيات المجهر التفاعل مع تطبيقات الحاسب الآلي. التي قطعناها على أنفسنا وحيدة الخلية القياسات من أجل الكشف عن المعلومات التي تعكس عدد السكان من الخلايا 6. قياس وحيدة الخلية يوفر لنا تحليلا للخلية على شكل رابط الجأش معقدة من القرب مع الخلايا الأخرى. وسوف تساعد هذه الطريقة في التحقيق العلماء تغييرات في شكل الخلية وموقع غشاء محدد البروتينات بعد stimualtion الكيميائية 7 و 8. وينبغي تحليل خلية تتضمن بيانات من المقصورات الداخلية الخلوية الأساسية لفي الأطراف خارج الخلية. إدراج البيانات القصوى التي يمكن الحصول عليها من صورة 2D هو عبر الطائرة من منتصف خلية، ولكن يتم وضع نواة وموقع الخارجية من الغشاء البلازمي على مختلف Z-الطائرات؛ التصور 2D باقتطاعالصورة. كما يقع نواة بين 3 و 4 ميكرون فوق نقطة التصاق الخلوية، والتي تقع على ساترة الزجاج، يتم فقدان مبلغ طويلة من البيانات. لا يمكن إلا أن عملية إعادة التنظيم هذه مستقبلات المكانية أن ينظر في الصور 3D، وغير قادر على أن يكون كميا دون التحليل. هذه الأداة يوفر نهجا جديدا لتصور وقياس التغيرات الخلوية التي لم يتم الكشف عن استخدام التقنيات التحليلية التقليدية 2D، وتوفير المعلومات التي تتناول نظام الهاتف الخلوي ككل بدلا من الانقسام بسبب البيانات 2D. هذا النهج لقياس الخلايا واحد معا، مع غيرها من التكنولوجيات وصف 9، يتيح لنا للتحقيق في تعقيد ديناميكيات الخلوية وأساس اللدونة الخلوية.
لا يقتصر هذا الأسلوب لImaris ويمكن تطبيقها على أي بيانات البرمجيات التصور تفاعل مع برنامج الحوسبة اللغة. وإدخال تحسينات في المستقبل على النظام تشمل تحليل المظهرية للخلايا مأخوذة من الذين يعيشون 3Dالخلايا للسماح فحص الخلية بأكملها في حالته الطبيعية دون تثبيت الكيميائية أو تلطيخ الكيميائية. والحصول على صور من القضاء على الخلايا الحية أيضا تنوع بين الخلايا، لأننا يمكن تحديد القياسات المظهرية في نفس الخلية مع مرور الوقت.
نعتقد دينا التكنولوجيا منصة، مع قدرته على قياس هياكل خلايا على شكل غير محدد، سوف يساعد علماء آخرين لملء الفجوة في تقنيات التصوير الكمي. هذا النهج الجديد ينطبق على توصيف العديد من التغييرات المظهرية خلية واحدة، مما يجعل هذا الاختبار القائم على الخلية، والتنميط وحيدة الخلية الأخرى 10، أداة إضافية لعملية اكتشاف المخدرات. وقد تم بالفعل منذ مورفولوجيا الخلايا المستخدمة في الفرز الفائق الإنتاجية لتحديد جزيء صغير مثبطات 11، وتتطور هذه المنصة، فإننا نتوقع أن يكون هذا الأسلوب مفيدا لتحديد منحنى الاستجابة للجرعة واحدة من الخلايا التي تؤثر على نفس pharmacologiكال الهدف ولكن مع آليات مختلفة للعمل.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الإعلان عن أي تضارب في المصالح.
Acknowledgments
نشكر مركز التنمية التصوير البيولوجي (BIDC) جامعة كاليفورنيا في سان فرانسيسكو لاستخدام Imaris، XT Imaris ومطلب. نشكر V. Kharazia للمساعدة التقنية وAT هنري، LK Floren، L. Daitch لمساهماتها في التحرير من المخطوطة. وأيد هذا العمل من خلال تمويل من الدولة للأبحاث الطبية في كاليفورنيا الإسراف في تناول الكحول والمخدرات من خلال UCSF لSEB، والمعاهد الوطنية للصحة: 1R21DA029966 NIH-01 وجائزة المسار السريع لفحص جمع MLSMR لUCSF SEB مدرسة، الصيدلة ( مكتب العميد والصيدلة الإكلينيكية) وكلية الطب (علم الأدوية السريري والعلاج التجريبي) لCLHK.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Human Embryonic Kidney (HEK293) | American Type Culture Collection | CRL-1573 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Invitrogen | 11965118 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Invitrogen | SH30070.03 | |
| AlexaFluor-488 (IgG2b) | Invitrogen | A-11001 | |
| monoclonal anti-HA.11 (IgG1) | Covance | 16B12 | |
| DAPI | Vector Laboratories | H-1200 | |
| CRF | Sigma | C2917 | |
| Antisauvagine-30 (AS-30) | Sigma | A4727 |
References
- West, M. J. Design-based stereological methods for counting neurons. Prog, Brain Res. 135, 43-51 (2002).
- Burke, M., Zangenehpour, S., Mouton, P. R., Ptito, M. Knowing what counts: unbiased stereology in the non-human primate brain. J. Vis. Exp. (27), e1262 (2009).
- Sugawara, Y., Ando, R., Kamioka, H., Ishihara, Y., Honjo, T., Kawanabe, N., Kurosaka, H., Takano-Yamamoto, T., Yamashiro, T. The three-dimensional morphometry and cell-cell communication of the osteocyte network in chick and mouse embryonic calvaria. Calcif. Tissue Int. 88, 416-424 (2011).
- Vickery, R. G., von Zastrow, M. Distinct dynamin-dependent and -independent mechanisms target structurally homologous dopamine receptors to different endocytic membranes. J. Cell Biol. 144, 31-43 (1999).
- Bartlett, S. E., Enquist, J., Hopf, F. W., Lee, J. H., Gladher, F., Kharazia, V., Waldhoer, M., Mailliard, W. S., Armstrong, R., Bonci, A. Dopamine responsiveness is regulated by targeted sorting of D2 receptors. Pro.c Natl. Acad. Sci. U.S.A. 102, 11521-11526 (2005).
- Gordon, A., Colman-Lerner, A., Chin, T. E., Benjamin, K. R., Yu, R. C., Brent, R. Single-cell quantification of molecules and rates using open-source microscope-based cytometry. Nat. Methods. 4, 175-181 (2007).
- Schock, F., Perrimon, N. Molecular mechanisms of epithelial morphogenesis. Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 18, 463-493 (2002).
- Pincus, Z., Theriot, J. A. Comparison of quantitative methods for cell-shape analysis. J. Microsc. 227, 140-156 (2007).
- Spiller, D. G., Wood, C. D., Rand, D. A., White, M. R. Measurement of single-cell dynamics. Nature. 465, 736-745 (2010).
- Loo, L. H., Wu, L. F., Altschuler, S. J. Image-based multivariate profiling of drug responses from single cells. Nat Methods. 4, 445-453 (2007).
- Yarrow, J. C., Totsukawa, G., Charras, G. T., Mitchison, T. J. Screening for cell migration inhibitors via automated microscopy reveals a Rho-kinase inhibitor. Chem. Biol. 12, 385-395 (2005).
