Den presenterte fremgangsmåte tilbyr en måte å detektere funksjonelle effektive cardiotropic autoantistoffer i plasma av pasienter med dilatert kardiomyopati, uavhengig av den spesifikke antigen, ved å analysere effekten av isolert pasient immunoglobulin på cellulære matfett og intracellulære kalsium transienter i isolerte rotte cardiomyocytes.
Dilatert kardiomyopati (DCM) er en av de viktigste årsakene til hjertesvikt hos yngre voksne en. Selv om genetisk disposisjon og eksponering for giftige stoffer er kjent årsaker til denne sykdommen hos omtrent en tredel av pasientene, forblir opprinnelsen DCM stor grad uklart. I et betydelig antall av disse pasientene har autoantistoffer mot hjerte-epitoper blitt oppdaget og er mistenkt for å spille en sentral rolle i utbruddet og progresjon av sykdommen 2,3. Betydningen av hjerte autoantistoffer understrekes av en hemodynamiske forbedring observert i DCM pasienter etter eliminering av autoantistoffer ved immunoadsorption 3-5. En rekke spesifikke antigener har allerede blitt identifisert 2,3 og antistoffer mot disse mål kan påvises ved immunoanalyser. Imidlertid kan disse analysene ikke diskriminere mellom å stimulere (og derfor funksjonelt effektive) og blokkerer autoantistoffer. Det er økende evidence at dette skillet er avgjørende 6,7. Det kan også antas at målene for en rekke cardiotropic antistoffer fortsatt uidentifiserte og kan derfor ikke bli detektert av immunoanalyser. Derfor etablerte vi en fremgangsmåte for påvisning av funksjonelt aktiv cardiotropic antistoffer, uavhengig av deres respektive antigen. Bakgrunnen for fremgangsmåten er den høye homologi vanligvis observeres for funksjonelle regioner kardiale proteiner i mellom pattedyr 8,9. Dette tyder på at kardiale antistoffer rettet mot humane antigener vil kryssreagere med ikke-humane målceller, noe som tillater testing av IgG fra DCM pasienter på voksen rotte cardiomyocytes. Vår metode består av 3 trinn: først, IgG isolert fra pasienten plasma med Sepharose coupled anti-IgG-antistoffer hentet fra immunoadsorption kolonner (PlasmaSelect, Teterow, Tyskland). Second, voksen cardiomyocytes er isolert etter collagenase perfusjon i en Langendorff perfusjon apparat med aprotocol endret fra tidligere arbeider 10,11. De oppnådde cardiomyocytes er festet til laminin-belagte Chambered coverglasses og farget med Fura-2, en kalsium-selektiv fluorescerende fargestoff som lett kan bringes inn i cellen for å observere intracellulær kalsium (Ca2 +) innholdet 12. I det siste trinnet, effekten av pasienten IgG på cellen matfett og Ca 2 + transienter av feltet stimulerte cardiomyocytes overvåkes elektronisk ved hjelp av en kommersiell myocyte kalsium og kontraktilitet overvåkingssystem (IonOptix, Milton, MA, USA) koblet til en standard invers fluorescerende mikroskop.
Den presenterte fremgangsmåte tilbyr en egnet måte å oppdage funksjonelt effektive kardiale autoantistoffer i pasienter med DCM for uklar opprinnelse. I forhold til andre metoder, f.eks påvisning av funksjonelle aktive antistoffer mot β1-adrenoseptor ved deres innvirkning på cAMP nivåer 6, er vår metode uavhengig av en bestemt epitop. Selvfølgelig finnes det andre epitop uavhengige analyser beskrevet i litteraturen, dvs. telle slo frekvensen av neonatale cardiomyocytes 13,</sup…
The authors have nothing to disclose.
Dette arbeidet ble støttet av Sonderforschungsbereich Transregio 19 (SFB/TR19, C2) av Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG), den føderale departementet for økonomi og teknologi-prosjekt ZIM-KF 2727801MD0 og Senter for Innovasjon Kompetanse – humorale immunresponser i hjerte-og karsykdommer ( ZIK-tur, BMBF FKZ 03Z2CN12) av Federal Utdannings-og forskningsdepartementet, Tyskland. Bolig og eksperimenter med dyr ble utført i samsvar med anbefalingene fra Society for Laboratory Animal Science (Gesellschaft für Versuchstierkunde, GV-SOLAS) og Federation of European Laboratory Animal Science Association (FELASA).
Name of the reagent/equipment | Company | Catalogue number | Comments |
Immunosorba preservation solution | Fresenius Medical Care | 903609211 | |
Collagenase type 2 | Cell System | LS004176 | |
BSA, fatty acid free | Sigma-Aldrich | A6003 | |
Laminin | Sigma-Aldrich | L2020 | |
Fura-2 AM | Sigma-Aldrich | F0888 | 1 mg/ml in DMSO |
Econo Pac Chromatography Columns | BioRad | 732-1010 | |
Spectra/Por Biotech Cellulose Ester Dialysis Membrane | Spectrumlabs | 131417 | |
4 well Chambered Coverglass | Nunc | 155383 | |
Myocyte Calcium and Contractility Recording System | IonOptix | ||
IonWizard 6.0 analysis software | IonOptix |