隔離された心筋細胞の細胞機能に対する抗体の効果測定

Summary

提示された方法は、細胞の短縮と分離したラットの心筋細胞の細胞内カルシウムトランジェントの隔離患者の免疫の影響を分析することで、にかかわらず、特定の抗原の、拡張型心筋症患者の血漿中で機能的な効果cardiotropic自己抗体を検出する方法を提供します。

Abstract

拡張型心筋症（DCM）は、若年成人¹で心不全のための主要な原因の一つです。有毒物質に対する遺伝的気質と博覧会は、患者の約3分の1で、この病気の原因を知られているが、DCMの起源は、主に不明なままである。これらの患者の相当数は、心臓エピトープに対する自己抗体が検出されており^、2,3病の発症と進行に重要な役割を果たすことが疑われている。心筋自己抗体の重要性は、免疫吸着^3月5日で自己抗体を除去した後、DCM患者において観察された血行動態の改善によって強調される。特定の種々の抗原は、すでに^2,3同定されており、これらのターゲットに対する抗体は免疫アッセイによって検出することができる。しかし、これらのアッセイは、刺激（したがって、機能的に有効な）と自己抗体をブロッキングを区別することはできません。 evidenが高まっているこの区別は^6,7重要であることをCE。またcardiotropic抗体の数のターゲットはまだ正体不明であるため、免疫アッセイでは検出できないことが想定される。したがって、我々はそれぞれの抗原とは独立し、機能的に活性なcardiotropic抗体の検出のための方法を確立した。法の背景には、通常哺乳類^8,9間に心臓のタンパク質の機能領域について観測と高い相同性があります。これは、ヒト抗原に対する抗体が心臓になる成体ラットの心筋細胞のDCM患者からのIgGのテストを許可する非ヒト標的細胞と交差反応することを示唆している。本手法は3つのステップで構成されています：最初に、IgGは免疫吸着カラム（PlasmaSelect、テーテロー、ドイツ）から入手セファロース結合抗IgG抗体を用いて患者血漿から分離されています。第二に、成体心筋細胞は、APを使用してランゲンドルフ灌流装置にコラゲナーゼ灌流によって分離されているrotocolは、以前の作品から^、10,11を変更^しました 。得られた心筋細胞は容易に細胞内カルシウム（Ca ^{2 +）}の内容^12を観察するため^の細胞内に持ち込むことのできるカルシウム選択的蛍光色素、ラミニンコートチャンバーcoverglassesに取り付け、のFura-2で染色されています。最後のステップでは、細胞短縮とCa ²上の患者IgGの効果フィールドの⁺過渡刺激心筋細胞は、商業筋細胞のカルシウムと標準蛍光逆に接続されている収縮性監視システム（IonOptix、ミルトン、MA、USA）を使用してオンラインで監視されている顕微鏡。

Protocol

1。患者サンプルからのIgGアイソ

1. 空のエコノパックカラムに2ミリリットル患者EDTA血漿当たり3ミリリットル抗IgGセファロースを充填することにより、ミニ免疫吸着カラムを準備します。 IgGの分離は、患者血漿の少なくとも2ミリリットルを必要とします。
2. 抗IgGセファロースの上にフィルターを置き、カラムの下部先端を開き、約1滴/秒の流速に到達するためにフィルタを押しカット。欄が不足する保存液してみましょう。
3. プラズマの体積あたりの3倍量の0.9％NaClでカラムを洗浄する。
4. カラム上でプラズマをピペット。プラズマは完全に抗IgGセファロースに浸漬した場合には、同じ体積の0.9％NaClで洗浄します。
5. ピペットカラムに0.2MのグリシンHCl、pHが2.8の1血漿量とセファロースに浸すことができます。カラムにグリシンHClの別のボリュームを追加します。 15mlチューブ内を通る流れを収集し、0.5Mのトリス-HCl、pH 8.0で7.3にpHを調整する。
6. 列を再生成するには、3プラズマボリュームグリシンHClで洗浄してください。 2倍量の0.9％NaClで最終洗浄後、カラムは次の血漿試料に使用されるかもしれません。 ℃で4週間までに8 - あるいは、その列は保存液を充填し、4℃で保存することができます。
7. 心筋細胞上で使用するために、収集したIgG画分では、実験的なバッファ（EB）に対して透析しなければならない。 EBの調製のために、マグネチックスターラーで1リットルの蒸留水に117 mMのNaCl、2.8のKCl、0.6 mMのMgCl _2、1.2mMのKH ₂ PO _4、1.2 mMのCaCl _2、10mMのHEPESおよび20mMグルコースを追加して、pHを調整7.3へ。
8. 100kDaのカットオフ分子量を有するセルロースエステル透析膜チューブにIgG画分を埋める。 1LのEBにチューブを入れて、4℃でマグネチックスターラーでゆっくりかき混ぜる℃、 8時間後、新鮮なEBの3 Lに透析チューブに移し、4℃でさらに20時​​間透析℃、
9. 透析後、57℃で30分間inactivatする水浴中でCのために試料を加熱eの補体因子。総IgG濃度を決定し、330μgのIgGのそれぞれを含むアリコートを準備します。測定（ステップ4.3）のための心筋細胞にサンプルを追加するときは、EBで1mlにアリコートを埋める。原液アリコートをさらに使用するまで-20℃で保存することができます。

2。ラット心筋細胞の単離

1. のCa ^{2 +}遊離、分離バッファ（IB）の調製のために、2.6のKCl、1.2mMのMgSO _4を 、1.2mMのKH ₂ PO _4、20mMのHEPESおよび磁気を用いて1Lの蒸留水に11 mMグルコース、110 mM NaClを追加スターラー。滅菌のための0.2μmのボトルトップフィルターを通して室温とフィルターでpHを7.4に調整してください。
2. サーモスタットランゲンドルフ灌流システムの上部貯水池で、IBの80ミリリットルを充填します。 37℃のバッファ温度を維持し、95％O _2/5％30分間、CO ₂でバッファを通気するため、サーモスタットの設定値を調整します。
3. 約10,000の重量を量る - collag 12,000 Uをenase II型、175 mgの脂肪酸フリーBSAおよび100 mMのCaCl ₂ストック溶液22.5μlを含む20ミリリットルIBに溶かす。上部貯水池の分離緩衝液のpHを制御し、必要に応じて調整します。
4. チオペンタール375μg/ kg体重で200グラム - 175のWistarラットをAnaesthetize。チオペンタールソリューションに2500 IUのヘパリンを追加します。無傷の大動脈弓と慎重に開胸、心臓を切除した後、氷冷した0.9％のNaClにそれを転送します。血液からの心と周囲の組織と新鮮な0.9％のNaClへの転送を清掃してください。大動脈を露出させ、2-3/secの滴下速度を取得し、カニューレに心臓を添付するランゲンドルフシステムの流れの減速を開きます。
5. 最大3分までの残りの血を洗い流すために1滴/秒の流速を持つための心臓を灌流する。ランゲンドルフシステムで、IBを循環させるために起動します。 80ミリリットルに達するために必要に応じて上部貯水池から20mlのバッファーを外し、はるかにバッファとしてコラゲナーゼ溶液とリフィルに記入してください。 cを循環させる別の27分間ollagenaseソリューションを提供します。流量が流れ減速機を使用して、1滴/秒で周期的に制御され、維持されるべきである。
6. 心房と大動脈からクリーンカニューレから心臓を、切り離し、小片に切り刻む。コラゲナーゼ溶液を下池に実行できるように、40ミリリットルの最大にボリュームを削減し、さらに10のために刻んだ心室を消化- 95％O _{2/5％CO 2}で連続曝気下に15分。その後、50 mlチューブに200μmのメッシュサイズのガーゼで細胞懸濁液をろ過する。
7. 200μMのCaCl _2を含有_する 10mlのIBの室温再懸濁した細胞で2分間43 xgで細胞懸濁液を遠心：3つのステップで細胞のCa ^{2 +の}コンテンツを復元します。再び遠心分離し、500μMのCaCl ₂を10ミリリットルIBに細胞を再懸濁する。最後の遠心分離の後、50,000細胞/ mlの密度に（1.8を参照）を滅菌濾過し、EBで心筋細胞を再懸濁します。

心筋細胞のe_title "> 3。のFura-2染色

1. コー​​トウェルあたり10μgのラミニンとの4ウェルにチェンカバーガラスと、それが完全に乾燥するまで待ちます。
2. よくカットチップ付きマイクロピペットを用いて各々に心筋細胞懸濁液1mlを埋める。細胞は室温で1時間付着することができます。
3. 1 mg / mlののFura-2の10μlを希釈は、5mlのEBにおける原液AM。暗闇の中で染色液を保管してください。
4. カバーガラスと各ウェルに染色液をピペット0.5ミリリットルからバッファと非付着細胞を脱ぐ。適度な揺れで10分間細胞をインキュベートします。続いて、染色液を脱いで1ミリリットルEBで一度細胞を洗浄し、最後に各ウェルに0.5 mlのEBを埋める。染色工程中に直接光を避け、常に暗闇の中で染色した細胞を保つ。

4。細胞短縮とCa ^{2 +}過渡の記録

1. 逆蛍光mにチャンバーカバーガラスを置きicroscopeは筋細胞のカルシウムと収縮記録システムに接続されています。よく最初の流入と流出管が付いているカスタムメイドの電極を配置します。 1ml /分のEBと電気刺激（20V、1Hzで、5ミリ秒の期間）を開始して心筋細胞を表面かん流する。細胞は約2分間刺激に適応することができます。
2. 明確なストライエーションと一定の収縮にそのまま棒状の心筋細胞を選択してください。視野の中央にあるセルを置き、カメラのチャンネルを開いてください。セルフレーミングアダプタを回転させ、顕微鏡ステージを移動することによって、ビデオ領域内で水平方向にセルを方向付ける。
3. 初期細胞短縮とCa ^{2 +の}一過性を得るために15の収縮-エッジがビデオ領域の制御要素（ 図2）を検出調整、蛍光チャネルおよびレコード10を開きます。
4. 蛍光染色の漂白を避けるために顕微鏡光チャネルを閉じます。サンプルにEBから通る流れを切り替える3方弁と患者のIgG 1ミリリットルと表面かん流する心筋細胞でバイパスしてください。空気がよく達する直前にポンプを停止します。
5. 光チャネルを開き、別の10記録 - 急性細胞応答を得るために15の収縮を。録音を一時停止し、再び光チャネルを閉じます。 2と5分後に録画を繰り返します。
6. 井戸の電極を取り出します。 EBで徹底的に管をきれいにし、チャンバーカバーガラスの次のウェルに進みます。
7. それぞれ細胞短縮とCa ^{2 +} "Edge-Length/Length"を使用してIonWizardソフトウェアと過渡と"フラ2数値は、/比を差し引いた"ウィンドウを、分析します。初期細胞短縮とCa ^{2 +}急性のベースライン（BL％ピーク時間）と呼ばれるピーク高さの過渡、2分、5分間応答からの変化率を計算します。

Representative Results

フィールドでの携帯変力作用を測定するための二つの例は以下のとおりである筋細胞のCa ^{2 +}および収縮記録システムを用いて成体心筋細胞を（ 図2）を刺激した。 図3は、制御測定の印象を与え、 図4の間cardiodepressive抗体の効果DCMを使用した患者の図が示されている。

どちらの例でも、初期の細胞短縮とCa ^{2 +} EBで灌流時の過渡では分析のための前提条件である、明確かつ一定のピークを示す。我々は、細胞が7の範囲で初期BL％のピーク時間を示すことを経験から知っている - 私たちのアプリケーションに最適な14％のスーツを、低い、または高い初期収縮による心筋細胞は、しばしば細胞短縮のいわれのない変化を示す傾向がある。健常者から分離されたコントロールIgG、 すなわち IgG抗体を塗布した後、心筋の変力作用はuのまま全体の測定（ 図3A）を通じてnchanged。これとは対照的に、cardiodepressive抗体を含むIgGと灌流が減少Ca ^{2 +を}一般的にあまり顕著である（ 図4B）過渡現象を伴う細胞短縮の減少（ 図4A）、続いています。私たちは通常、新しい定常状態が5分後に測定終了まで保存されて2分後に、細胞短縮^と Ca ^{2 +}過渡、両方のために確立されていることを確認します。与えられた例では、5分後に^31％+過渡54％及びCa ^{2 +}の細胞短縮の減少に非常に明確な陰性変力作用を示しています。ただし、変更は、あまり顕著である。したがって、我々は意味として、負と正の変力の上限と下限を定義±偽陽性の結果を回避するために、健康な対照群の対照IgG用2SD。したがって、細胞が唯一、負または正の変力wと考えられている細胞短縮のめんどりの変化は、我々は約であると判断、このしきい値は、±10％を超えております。

図1。心筋収縮力を測定することにより、自己抗体検出のフローチャートは、まず 、IgGは抗IgGセファロースカラム（黄色で強調表示）を使用して、患者の試料から抽出されます。第二に、心筋細胞のFura-2（青で強調表示されている）を持つ酵素消化やステンドによってラットの心臓から分離されています。最後に、細胞短縮とCa ^{2 +}過渡が筋細胞のカルシウムと収縮記録システムを（緑色で強調表示）を使用してオンラインで監視されています。

図2。単離されたラット心筋細胞筋細胞収縮のレコーディングシステムのビデオ領域に配置。セル下のグラフは、エッジ検出のために使用される計算された強度のトレースが表示されます。矢印は、エッジ検出制御の要素を示します。 拡大図を表示するにはここをクリック 。

図3。代表的なコントロールの測定例。細胞短縮（）とCa ^{2 +の}一過性（B）は、IgGと灌流後2分、5分、（急性）直ちに、（初期）の前にオンラインで監視した。赤い線は、測定の一時停止を示す。

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図4。 cardiodepressive抗体を含むIgGサンプルの測定例。細胞短縮（）とCa ^{2 +の}一過性（B）は、IgGと灌流後2分、5分、（急性）直ちに、（初期）の前にオンラインで測定した。赤い線は、測定の一時停止を示す。

Discussion

提示された方法は不明起源のDCM患者において、機能的に有効な心臓の自己抗体を検出するのに適した方法を提供しています。他の方法と比較して、cAMPレベル⁶への影響により、β1-アドレナリン受容体に対して機能アクティブ抗体の検出を、例えば 、我々の手法は、特定のエピトープとは無関係です。もちろん、文献に記載されている他のエピトープの独立したアッセイは、パッチクランプ法又は単離されたプルキンエ繊維¹⁴の収縮によって成体心筋細胞におけるカルシウム電流を測定する、 すなわち新生児心筋細胞¹³の拍動数を数えて、あります。これらの方法の利点は、ここで紹介する検定はそれほど時間がかかり、標準化されたプロトコルにより増加した客観性を提供します。さらに、それは同時に収縮と細胞内カルシウムトランジェントの影響を検出することができます。

OTに似て彼女のin vitroアッセイを 、提示された方法で得られた結果をセルに適用された人工的な条件によって挑戦することができる。培養新生児ラット心筋細胞は平坦な基板上に比べて30μm以下の距離でマイクロピラーの間に優先的に接続するために報告された。後者に添付された場合、細胞は、アクチンストレスファイバーを表示するために発見され、筋繊維¹⁵順不同た。成体の心筋細胞のみ⁺過渡ような繊維と細胞短縮の形成を減少させるとCa ^5月2日 6時間までの非常に短い期間のために培養されているのでしかし、ここで説明収縮性アッセイにおけるストレスファイバーの潜在的な影響は無視できるかもしれません細胞間の個人差の影響を最小限に抑えるため、各セルの初期収縮と呼ばれています。別の制限は、実験動物と時間の需要が高いです。そのための方法は、パチのハイスループットスクリーニングには適していませんエント。

さらに実装がメソッドの考えられる。抗原依存しないため、それが自己免疫への影響が想定され、他の特発性心血管疾患にも適用することができる。

また、収縮性の測定が簡単に他の物質の機能的効果を研究するために調整することができます。これは、医薬品開発やテストに有益な例かもしれない心、上薬の潜在的な影響を分析することができます。細胞短縮とCa ^{2 +}のベースラインからの変化によって提供される基本的なパラメータ以外に、さらに詳しい情報が観察された効果のより詳細な定義を可能な測定から得ることができる。例えば、出発と戻り速度は、特定の収縮期および薬剤または抗体の拡張期の効果を示している可能性が細胞短縮イベントから計算することができます。

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Immunosorba preservation solution	Fresenius Medical Care	903609211
Collagenase type 2	Cell System	LS004176
BSA, fatty acid free	Sigma-Aldrich	A6003
Laminin	Sigma-Aldrich	L2020
Fura-2 AM	Sigma-Aldrich	F0888	1 mg/ml in DMSO
Econo Pac Chromatography Columns	BioRad	732-1010
Spectra/Por Biotech Cellulose Ester Dialysis Membrane	Spectrumlabs	131417
4 well Chambered Coverglass	Nunc	155383
Myocyte Calcium and Contractility Recording System	IonOptix
IonWizard 6.0 analysis software	IonOptix