Summary
השיטה הוצגה מציעה דרך לזהות נוגדנים עצמיים cardiotropic יעילים פונקציונליים בפלזמה של חולים עם קרדיומיופתיה המורחבת, ללא קשר לאנטיגן הספציפי, על ידי ניתוח ההשפעה של אימונוגלובולין חולה המבודד בקיצור הסלולר וארעי סידן תאי בcardiomyocytes חולדה המבודדת.
Abstract
קרדיומיופתיה המורחבת (DCM) היא האחד הגורמים העיקריים לאי ספיקת לב במבוגרים הצעירים 1. למרות נטייה גנטית וחשיפה לחומרים רעילים ידועות סיבות למחלה זו כבשליש מהחולים, מקורו של DCM נותר במידה רבה בלתי ברור. במספר לא מבוטל של חולים אלה, נוגדנים העצמיים נגד אפיטופים לב שכבר זוהה וחשודים לשחק תפקיד מרכזי בתחילת ההתקדמות של המחלה 2,3. החשיבות של נוגדנים עצמיים לב מודגשת על ידי שיפור המודינאמית נצפה בחולי DCM נטרול נוגדנים עצמיים על ידי immunoadsorption 3-5. מגוון רחב של אנטיגנים ספציפיים כבר זוהה 2,3 ונוגדנים נגד יעדים אלה עשויים להיות מזוהים על ידי immunoassays. עם זאת, המבחנים הללו אינם יכולים להבחין בין הגירוי (ולכן פונקציונליים יעיל) וחסימת נוגדנים עצמיים. יש גובר evidence כי הבחנה זו היא חיוני 6,7. כמו כן, ניתן להניח כי היעדים למספר נוגדני cardiotropic עדיין לא מזוהים ולכן אינו ניתן לגילוי על ידי immunoassays. לכן, הקים שיטה לגילוי נוגדנים תפקודיים פעילים cardiotropic, עצמאיים של אנטיגן החוקי. הרקע לשיטה הוא ההומולוגיה הגבוהה בדרך כלל נצפתה לאזורים פעילים של חלבונים בלב בין יונקים 8,9. הדבר מצביע על כך נוגדני לב הופנו נגד אנטיגנים אנושיים יחצו-מגיבים עם תאי המטרה שאינם בני אדם, המאפשרים בדיקה של נוגדנים מחולי DCM על cardiomyocytes חולדות בוגרות. השיטה שלנו כוללת 3 שלבים: הראשון, IgG מבודד מפלזמת מטופל באמצעות נוגדני sepharose מצמידים אנטי IgG מתקבלים מעמודות immunoadsorption (PlasmaSelect, Teterow, גרמניה). cardiomyocytes שנית, למבוגרים מבודדים על ידי זלוף collagenase במנגנון זלוף Langendorff באמצעות aprotocol שונה מעבודות הקודמות של 10,11. את cardiomyocytes מתקבל מצורפים לcoverglasses הקבורים laminin המצופה ומוכתם בFura-2, צבע פלואורסצנטי סידן סלקטיבית אשר יכולה להיות מובא בקלות לתוך התא כדי לבחון הסידן תוך תאי (Ca 2 +) תוכן 12. בשלב האחרון, ההשפעה של מטופל על IgG קיצור התא וCa 2 + ארעי של cardiomyocytes שדה מגורה מנוטר באופן מקוון באמצעות מערכת ניטור התכווצות (IonOptix, מילטון, מסצ'וסטס, ארה"ב) סיד myocyte מסחרי ומחובר לניאון הפוך סטנדרטי מיקרוסקופ.
Protocol
1. בידוד נוגדנים מדגימות מטופל
- הכן עמודות המיני immunoadsorption ידי מילוי 3 מ"ל אנטי IgG sepharose לכל 2 מיליליטר מטופל EDTA פלזמה לעמודה ריקה Econo פאק. IgG בידוד דורש לפחות 2 מ"ל של פלזמת חולה.
- הנח על גבי מסנן אנטי IgG sepharose, חתכת את הקצה התחתון של העמודה ולחץ על המסנן להגיע לקצב זרימה של כ 1 טיפה / שנייה. בואו פתרון השימור הנגמר של העמודה.
- לשטוף את העמודה עם 3 כרכים 0.9% NaCl לנפח הפלזמה.
- פיפטה פלזמה על העמודה. כאשר הפלזמה שקועה לחלוטין באנטי IgG sepharose, לשטוף עם אותו הנפח 0.9% NaCl.
- נפח פיפטה 1 פלזמה של 0.2 M HCl גליצין, 2.8 pH על העמוד ובואו לטבול לתוך sepharose. הוסף עוד כרך של גליצין HCl על העמודה. לאסוף את הזרימה דרך בצינור מ"ל 15 ולהתאים את ה-pH ל 7.3 עם 0.5 מ 'טריס-HCl, pH 8.0.
- כדי לחדש את העמודה, לשטוף עם 3 הפלזמה כרכים גליצין HCl. לאחר שטיפה סופית עם 2 כרכים 0.9% NaCl, העמודה עשויה לשמש לדגימת הפלזמה הבאה. לחלופין, העמודה יכולה להיות מלאה עם פתרון שימור ואוחסנה ב 4-8 מעלות צלזיוס למשך עד 4 שבועות.
- לשימוש בcardiomyocytes, שבריר IgG שנאסף צריך להיות דיאליזה נגד מאגר ניסויי (EB). להכנת EB, להוסיף 117 mM NaCl, KCl 2.8 מ"מ, 0.6 המ"מ MgCl 2, 1.2 המ"מ KH 2 4 ת.ד., 1.2 מ"מ CaCl 2, 10 HEPES המ"מ וגלוקוז 20 מ"מ למי 1 ליטר מזוקקים על stirrer מגנטי ולהתאים את ה-pH ל -7.3.
- מלא את שבר IgG לצינור קרום דיאליזת אסתר תאית עם משקל מולקולרי לחתוך של 100 kDa. שים את הצינור בEB 1 ליטר ומערבב לאט עם stirrer מגנטי ב 4 ° C. לאחר שעה 8, להעביר את הצינור לדיאליזת 3 L של EB הטריה ודיאליזה עבור 20 שעות נוספות בשעת 4 ° C.
- בעקבות דיאליזה, חום המדגם למשך 30 דקות ב 57 מעלות צלזיוס באמבט מים לinactivatגורמים משלים ה. קביעת ריכוז נוגדנים מוחלט ולהכין aliquots המכיל 330 מיקרוגרם IgG כל אחד. כאשר מוסיף את המדגם כדי cardiomyocytes למדידה (שלב 4.3), למלא את aliquots ל1 מ"ל עם EB. aliquots החי ניתן לאחסן ב -20 ° C עד לשימוש נוסף.
2. בידוד של cardiomyocytes Rat
- להכנת Ca 2 +-חיץ בידוד חופשי (IB), להוסיף 110 המ"מ NaCl, KCl 2.6 מ"מ, 1.2 המ"מ 4 MgSO, 1.2 mM KH 2 4 ת.ד., 20 HEPES המ"מ וגלוקוז 11 מ"מ למים מזוקקים 1 ליטר באמצעות מגנטי stirrer. התאם pH ל -7.4 בטמפרטורת חדר ומסנן דרך מסנן 0.2 מיקרומטר בקבוק עליון לעיקור.
- מלא 80 מ"ל של IB במאגר העליון של מערכת זלוף Langendorff thermostated. התאם את גדרות תרמוסטט כדי לשמור על טמפרטורת חיץ של 37 מעלות צלזיוס ולתחח חיץ עם 95% O 2/5% CO 2 למשך 30 דקות.
- שוקל כ 10,000 - 12,000 U של collagenase סוג השני, חומצות שומן חופשי BSA 175 מ"ג ומתמוססים ב20 IB מ"ל מכיל 22.5 μl של 100 פתרון mM CaCl 2 מניות. לשלוט על ה-pH של חיץ הבידוד במאגר העליון ולהתאים במידת צורך.
- לטשטש את עכברוש Wistar של 175-200 גרם עם thiopental משקל 375 מיקרוגרם / קילו משקל הגוף. הוסף הפארין יחב"ל 2500 לפתרון thiopental. לאחר פתיחת בית החזה, בלו הלב בקפידה עם קשת אב עורקים שלמה ולהעביר אותו לקר כקרח 0.9% NaCl. נקה את הלב מדם והרקמות והעברה לטרי 0.9% NaCl שמסביב. לחשוף את אב העורקים, פתח את מפחית הזרימה של מערכת Langendorff להשיג מהירות יורדת מ2-3/sec ולצרף את הלב לצינורית.
- תנקב את הלב לתקופה של עד 3 דקות בקצב זרימה של 1 טיפה / שניות לשטוף את הדם שנותר. התחל להפיץ את IB במערכת Langendorff. הסר חיץ מ"ל 20 מהמאגר העליון, מלא את פתרון collagenase ולמלא כמה שיותר חיץ כפי שנדרש כדי להגיע ל80 מ"ל. הפץ ג פתרון לollagenase 27 דקות נוספות. קצב זרימה צריך להיות מבוקר תקופתי ומתוחזק בירידת 1 / שניות באמצעות מפחית הזרימה.
- לנתק את הלב מהצינורית, הנקי מאטרייה ואב עורקים וקוצץ לחתיכות קטנות. אפשר פתרון collagenase לרוץ לתוך המאגר התחתון, להפחית את עוצמת קול למקסימום של 40 מ"ל ועוד יותר לעכל את החדרים הקצוצים עבור 10 - 15 דקות מתחת לאוורור רציף עם 95% O% 2/5 CO 2. לאחר מכן, מסנן את השעית התא דרך גזת 200 מיקרומטר רשת גודל לתוך צינור מ"ל 50.
- שחזור Ca 2 + התוכן של התאים ב3 שלבים: סרכזת השעית תא XG ב 43 עבור 2 דקות בטמפרטורת חדר ותאי resuspend ב 10 המ"ל מכיל 200 IB מיקרומטר CaCl 2. צנטריפוגה שוב וresuspend תאים ב10 המ"ל IB עם 500 מיקרומטר CaCl 2. לאחר צנטריפוגה סופית resuspend cardiomyocytes בEB המסוננת סטרילי (ראה 1.8) לצפיפות של 50,000 תאים / מ"ל.
- מעייל 4 coverglass קבורים היטב עם laminin 10 מיקרוגרם לטובים ולחכות עד שהוא יתייבש לגמרי.
- מלא 1 מ"ל של השעית cardiomyocyte לכל השימוש micropipette היטב עם קצה חתוך. אפשר התאים לדבוק לשעה 1 בטמפרטורת חדר.
- לדלל 10 μl של 1 מ"ג / המ"ל Fura-02:00 פתרון מנייה בEB 5 מ"ל. שמור את הפתרון המכתים בחושך.
- תוריד את החיץ ורווק תאים מcoverglass ו0.5 מיליליטר פיפטה של הפתרון המכתים לכל באר. דגירת התאים למשך 10 דקות ברעידות בינוניות. לאחר מכן, לוקח את הפתרון המכתים, לשטוף תאים פעם אחת עם EB 1 מ"ל ולבסוף למלא EB 0.5 מ"ל לכל באר. הימנע מאור ישיר בתהליך הצביעה ותמיד לשמור על תאים המוכתמים בחושך.
4. הקלטה של קיצור של תא ושל Ca 2 + ארעי
- הנח coverglass נאוטילוס על מ 'פלואורסצנטי הפוךicroscope מחובר למערכת הקלטת contractility סידן וmyocyte. מקם אלקטרודה מנהג עשה עם זרם וצינור זרימה בבאר הראשונה. cardiomyocytes Superfuse עם EB 1 מ"ל / דקה ולהתחיל גירוי החשמלי (20 וולט, 1 הרץ, 5 אלפיות משך). לאפשר לתאים להסתגל לגירוי כ 2 דקות.
- בחר cardiomyocyte צורת מוט שלם עם תלמים ברורים והתכווצות מתמדת. מקם את התא במרכז שדה הראייה ולפתוח את ערוץ המצלמה. להתמצא התא אופקי בתחום הווידאו על ידי סיבוב מתאם מסגור התא והתנועה את במת מיקרוסקופ.
- התאם את קצה איתור רכיבי בקרה של אזור הווידאו (איור 2), לפתוח את ערוץ 10 ולהקליט הניאון - 15 צירים כדי להשיג קיצור התא הראשוני וCa 2 + ארעי.
- סגור את ערוץ מיקרוסקופ האור, כדי למנוע הלבנת כתם פלואורסצנטי. כבה את הזרימה דרך מEB למדגםלעקוף עם שסתום 3-way וcardiomyocytes superfuse עם 1 מ"ל של מטופל נוגדנים. עצור את המשאבה ממש לפני האוויר מגיע גם.
- פתח את ערוץ האור ולהקליט עוד 10-15 צירים כדי לקבל את תגובת התא החריפה. להשהות את ההקלטה ולסגור את ערוץ האור שוב. חזור על הקלטה לאחר 2 ו 5 דקות.
- הוצא את האלקטרודה של הבאר. נקה את הצינורות ביסודיות עם EB ולהמשיך בבאר הבאה של coverglass נאוטילוס.
- נתח את קיצור התא וCa 2 + ארעי עם תוכנת IonWizard באמצעות "Edge-Length/Length" והחלון "Fura 2-מספריים נגרע / יחס", בהתאמה. לחשב את אחוז השינוי שחל מהקיצור הראשוני התא וCa 2 + הארעי של גובה השיא התייחס לנקודת ההתחלה (% bl השיא ח) לאקוטי, 2 דקות ותגובת 5 דקות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
שתי דוגמאות למדידת inotropy הסלולרי בתחום מגורה cardiomyocytes הבוגר (איור 2) באמצעות myocyte Ca + ומערכת הקלטת contractility 2 הם כדלקמן. איור 3 נותן רושם של מדידת שליטה, ואילו באיור 4 ההשפעה של נוגדני cardiodepressive של חולה עם DCM מוצג.
בשתי הדוגמות, קיצור תא ראשוני וCa 2 + ארעיות במהלך superfusion עם EB תערוכת פסגות ברורות וקבועות, שהוא תנאי הכרחי לניתוח. אנו יודעים מניסיון שמציגים תאים ראשוניות bl% לשיא שעות בטווח של 7 - 14% החליפה הטובה ביותר עבור היישום שלנו, ואילו עם התכווצות שריר לב נמוכה יותר או גבוהה יותר ראשונית לעתים קרובות נוטים להפגין שינויי התגרות מוקדמים, של קיצור תא. לאחר הפעלתה של הבקרה IgG, כלומר IgG מבודד מנבדקים בריאים, inotropy של cardiomyocytes נותר unchanged לאורך כל המדידה (איור 3 א). לעומת זאת, עם superfusion מכיל נוגדני IgG cardiodepressive אחריו ירידה של התקצרות תא (איור 4 א), מלווית בירידת Ca 2 + ארעי שהוא בדרך כלל פחות בולט (איור 4 ב). בדרך כלל אנחנו צופים שמצב יציב חדש שהוקם עבור שניהם, קיצור תא וCa 2 + ארעי, לאחר 2 דקות שנשמרו עד לסיום המדידה לאחר 5 דקות. הדוגמא שניתנה מראה השפעה ברורה מאוד שלילית אינוטרופיות עם ירידה של התקצרות תא על ידי 54% ושל Ca 2 + ארעית של 31% לאחר 5 דקות. עם זאת, שינויים הם לרוב פחות בולטים. לכן, הגדרנו גבול עליון ותחתון לinotropy שלילי והחיובי כמתכוון ± 2SD לבקרת IgG של קבוצת ביקורת בריאה כדי למנוע תוצאות חיוביות כוזבות. בהתאם לכך, תאים נחשבים רק כאינוטרופיות w שלילי או חיובישינויי תרנגולת של קיצור תא יעלו על הסף הזה, שאנו נחושים בדעתו להיות כ 10% ±.
איור 1. תרשים זרימה של איתור autoantibody ידי מדידת contractility cardiomyocyte. ראשית, IgG מופק מדגימות מטופל באמצעות עמודות אנטי IgG sepharose (מסומן בצהוב). שנית, cardiomyocytes מבודד מלב חולדה על ידי עיכול ומוכתם האנזימטית עם Fura-2 (מסומן בכחול). לבסוף, קיצור תא וCa 2 + ארעיים מנוטרים באופן מקוון באמצעות סיד Myocyte ומערכת הקלטת contractility (מסומן בירוק).
איור 2. cardiomyocyte חולדה המבודדת ממוקם באזור הווידאו של מערכת הקלטת contractility Myocyte. הגרף שלהלן מציג את תא עקבות העצמה מחושבות המשמשות לגילוי קצה. חיצים מעידים זיהוי רכיבי בקרה מתקדמת. לחץ כאן לצפייה בדמות גדולה.
איור 3. דוגמה מייצגת של מדידת שליטה. קיצור Cell () וCa 2 + (B) החולף היה פיקוח באינטרנט לפני (ראשוני), באופן מיידי (אקוטי), 2 דקות ו 5 דקות אחרי superfusion עם IgG. קווים אדומים מצביעים על ההשהיה של המדידה.
"האיור 4" fo: תוכן רוחב = "4.5in" fo: src = "/ files/ftp_upload/4237/4237fig4highres.jpg" />
איור 4. מדידת דוגמה לדגימה המכילה נוגדני IgG cardiodepressive. קיצור Cell () וCa 2 + (B) החולף נמדד באינטרנט לפני (ראשוני), באופן מיידי (אקוטי), 2 דקות ו 5 דקות אחרי superfusion עם IgG. קווים אדומים מצביעים על ההשהיה של המדידה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
השיטה הוצגה מציעה דרך מתאימה כדי לזהות נוגדנים עצמיים לבביים יעילים תפקודיים בחולים עם DCM ממוצא לא ברור. בהשוואה לשיטות אחרות, למשל זיהוי של נוגדנים פעילים נגד פונקציונליים β1-adrenoceptor לפי חשיבותם ברמות cAMP 6, השיטה שלנו אינה תלויה בepitope ספציפי. כמובן שיש מבחנים עצמאיים epitope אחרים שתוארו בספרות, כלומר לספור את הקצב הפועם של cardiomyocytes ילוד 13, מדידת זרמי סידן בשריר לב במבוגרי טכניקת מהדק תיקון או ההתכווצות של סיבים מבודדים פורקינג' 14. ביתרון לשיטות אלה, assay מוצג כאן הוא פחות זמן רב ומספק אובייקטיביות גדלה כתוצאה מהפרוטוקול הסטנדרטי. יתר על כן, היא מאפשרת זיהוי ההשפעה על התכווצות וארעית סידן תאי באותו הזמן.
בדומה לotבמבחניה חוץ גופייה, התוצאות שהתקבלו בשיטה שהוצגה ניתן לערער על ידי התנאים המלאכותיים שהוחלו על התאים. cardiomyocytes חולדה הילודה תרבית דווחו לצרף מעדיף בין micropillars עם מרחק של 30 מיקרומטר או פחות מאשר על מצעים שטוחים. כשמצורף לזה האחרון, נמצאו תאים כדי להציג סיבים יקטינו לחץ ולא מסודר 15 myofibers. עם זאת, ההשפעה הפוטנציאלית של סיבי עקה בassay contractility מתואר כאן עשוי להיות זניח מאז cardiomyocytes מבוגרים מתורבתים רק לתקופת זמן קצרה מאוד של עד 6 שעות שעשויים להפחית את ההיווצרות של סיבים כאלה וקיצור תא וCa 2 + ארעית הם מכונים התכווצות הראשונית של התא המתאים כדי למזער את ההשפעה של הבדלים אישיים בין תאים. מגבלה נוספת היא הביקוש הגבוה של בעלי חיים וזמן ניסוי. לכן השיטה אינה מתאימה להקרנת תפוקה גבוהה של פאטימציג.
מימושים נוספים הם על דעת לשיטה. בשל אנטיגן העצמאות זה יכול להיות מיושם למחל לב וכלי דם אחרות אידיופטית, בי השפעה אוטואימונית היא להניח.
יתר על כן, מדידות contractility יכולות בקלות להיות מותאמות ללמוד השפעות פונקציונליות של חומרים אחרים. זה מאפשר ניתוח השפעה אפשרית של תרופות על הלב, שיכול להיות למשל מועיל בפיתוח תרופות ובדיקות. חוץ מהפרמטרים הבסיסיים הניתנים על ידי השינויים של קיצור תא וCa 2 + מנקודת ההתחלה, מידע נוסף ניתן לקבל את המדידות אשר מאפשרים הגדרה מפורטת יותר של האפקט הנצפה. לדוגמה, היציאה וחזרת המהירות ניתן לחשב את אירועי הקיצור הסלולרי שיכול להצביע הסיסטולי ספציפיים והשפעה הדיאסטולי של תרופה או נוגדן.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
אין ניגודי האינטרסים הכריזו.
Acknowledgments
עבודה זו נתמכה על ידי Sonderforschungsbereich Transregio 19 (SFB/TR19, C2) של Forschungsgemeinschaft דויטשה (DFG), המשרד הפדרלי לכלכלה וטכנולוגית פרויקט לצים-KF 2727801MD0 והמרכז לכשירות חדשנות - תגובות חיסוניות הומורלית במחל לב וכלי דם ( זיק בטרמפים, BMBF FKZ 03Z2CN12) של המשרד הפדרלי לחינוך ולמחקר, גרמניה. שיכון וניסויים בבעלי חיים בוצעו בהתאם להמלצות של החברה למעבדה בבעלי חי מדע (Gesellschaft für Versuchstierkunde, GV-SOLAS) והפדרציה של מעבדה אירופית למדע בעלי חיים אגודים (FELASA).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Immunosorba preservation solution | Fresenius Medical Care | 903609211 | |
| Collagenase type 2 | Cell System | LS004176 | |
| BSA, fatty acid free | Sigma-Aldrich | A6003 | |
| Laminin | Sigma-Aldrich | L2020 | |
| Fura-2 AM | Sigma-Aldrich | F0888 | 1 mg/ml in DMSO |
| Econo Pac Chromatography Columns | BioRad | 732-1010 | |
| Spectra/Por Biotech Cellulose Ester Dialysis Membrane | Spectrumlabs | 131417 | |
| 4 well Chambered Coverglass | Nunc | 155383 | |
| Myocyte Calcium and Contractility Recording System | IonOptix | ||
| IonWizard 6.0 analysis software | IonOptix |
References
- Roger, V. L., et al. Heart disease and stroke statistics--2011 update: a report from the American Heart Association. Circulation. 123 (4), e18 (2011).
- Caforio, A. L., Vinci, A., Iliceto, S. Anti-heart autoantibodies in familial dilated cardiomyopathy. Autoimmunity. 41 (6), 462 (2008).
- Yoshikawa, T., Baba, A., Nagatomo, Y. Autoimmune mechanisms underlying dilated cardiomyopathy. Circ. J. 73 (4), 602 (2009).
- Felix, S. B., et al. Hemodynamic effects of immunoadsorption and subsequent immunoglobulin substitution in dilated cardiomyopathy: Three-month results from a randomized study. Journal of the American College of Cardiology. 35 (6), 1590 (2000).
- Staudt, A., et al. Role of immunoglobulin G3 subclass in dilated cardiomyopathy: results from protein A immunoadsorption. Am. Heart J. 150 (4), 729 (2005).
- Nikolaev, V. O., et al. A novel fluorescence method for the rapid detection of functional beta1-adrenergic receptor autoantibodies in heart failure. J. Am. Coll. Cardiol. 50 (5), 423 (2007).
- Jahns, R., et al. Autoantibodies activating human beta1-adrenergic receptors are associated with reduced cardiac function in chronic heart failure. Circulation. 99 (5), 649 (1999).
- Gocayne, J., et al. Primary structure of rat cardiac beta-adrenergic and muscarinic cholinergic receptors obtained by automated DNA sequence analysis: further evidence for a multigene family. Proceedings of the National Academy of Sciences. 84 (23), 8296 (1987).
- Jaenicke, T., et al. The complete sequence of the human beta-myosin heavy chain gene and a comparative analysis of its product. Genomics. 8 (2), 194 (1990).
- Piper, H. M. Cell Culture Techniques in Heart and Vessel Research. , Springer. Berlin, Heidelberg, New York. (1990).
- Kubin, T., et al. Microvascular endothelial cells remodel cultured adult cardiomyocytes and increase their survival. Am. J. Physiol. 276 (6 Pt. 2), H2179 (1999).
- Grynkiewicz, G., Poenie, M., Tsien, R. Y. A new generation of Ca2+ indicators with greatly improved fluorescence properties. J. Biol. Chem. 260 (6), 3440 (1985).
- Magnusson, Y., et al. Autoimmunity in idiopathic dilated cardiomyopathy. Characterization of antibodies against the beta 1-adrenoceptor with positive chronotropic effect. Circulation. 89 (6), 2760 (1994).
- Wakefield, I. D., et al. The application of in vitro methods to safety pharmacology. Fundam. Clin. Pharmacol. 16 (3), 209 (2002).
- Kajzar, A., et al. Toward physiological conditions for cell analyses: forces of heart muscle cells suspended between elastic micropillars. Biophys. J. 94 (5), 1854 (2008).
